黃國(guó)清 張勇剛 伍昌林 王強(qiáng) 王素云 周仁龍 楊東莞 彭銀艷

輸血依賴性地中海貧血患者需長(zhǎng)期依賴輸血維持生命，定期輸血患者易產(chǎn)生血型不規(guī)則抗體。近年定期輸血患者同種免疫機(jī)制與防治策略是全球研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外研究表明Th1、Th2、Th17 及Treg 細(xì)胞失衡與同種免疫相關(guān)，但近年研究的新型Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞亞群免疫平衡在血型同種免疫中的作用尚不完全明確[1～3]。本項(xiàng)目將研究血型同種免疫產(chǎn)生的不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞亞群比例及ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平，分析Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值變化及其臨床意義，探討Tfh、Tfr 細(xì)胞亞群及相關(guān)因子在血型同種異體免疫機(jī)制中的作用，為定期輸血患者血型不規(guī)則抗體的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與治療思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年1月～2021年7月在我院定期輸血的不規(guī)則抗體篩查陽(yáng)性患者32 例，其中男15 例，女17 例，年齡14～58 歲，平均32.5 歲。排除合并自身抗體或其它自身免疫病的患者。隨機(jī)選擇定期輸血的32 例不規(guī)則抗體篩查陰性患者作為對(duì)照組，其中男18 例，女14 例，年齡13～56 歲，平均34 歲。本研究符合我院倫理標(biāo)準(zhǔn)，獲倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞（上海生物醫(yī)藥），不規(guī)則抗體鑒定譜細(xì)胞（荷蘭三昆公司），細(xì)胞檢測(cè)的熒光標(biāo)記抗體：抗人-CXCR5單克隆抗體，抗人-CD4 單克隆抗體、抗人-FoxP3 單克隆抗體、抗人-CXCR3 和CCR6 單克隆抗體；同型對(duì)照的熒光抗體IgG1 單克隆抗體（美國(guó)BD 公司）。酶標(biāo)儀（匯松MB-580）和流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），細(xì)胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 ELISA 試劑盒（美國(guó)RD 公司），KA-2200 型離心機(jī)（日本久保田），卡式離心機(jī)（西班牙戴安娜公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞亞群的檢測(cè) 抽取EDTA 抗凝的不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血3ml，利用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），分離細(xì)胞濃度為1×106的PBMC 懸液100μl；分別加入熒光標(biāo)記抗體：一組加入CD4、CXCR5、FoxP3 抗體；另一組加入CD4、CXCR5、CXCR3 和CCR6 抗體，4℃避光孵育30min，1 800r/min 離 心6min 棄上清，加入PBS 2ml 吹打均勻，再次1 800r/min 離心6min 棄上清；然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述細(xì)胞。外周血Tfh 及其亞型定義如下：Tfh：CD4+CXCR5+T 細(xì)胞；Tfh1：CXCR3+CCR6-Tfh 細(xì)胞；Tfh2：CXCR3-CCR6-Tfh 細(xì)胞；Tfh17：CXCR3-CCR6+Tfh 細(xì) 胞；Tfr：CD4+CX CR5+FoxP3+T 細(xì)胞。分析比較Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr細(xì)胞亞群的比值變化。

1.3.2 兩組外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 細(xì)胞因子檢測(cè) 取前期凍存血清，溶解后每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3 孔檢測(cè)，酶標(biāo)儀在520nm 波長(zhǎng)處讀取OD 值并取均值，由標(biāo)準(zhǔn)品在配套軟件上自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各樣本的OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對(duì)應(yīng)值，獲得待測(cè)樣本ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10含量，并比較ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值差異。以上操作均按ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與血型不規(guī)則抗體效價(jià)變化的相關(guān)分析 采用倍比稀釋法檢測(cè)血型不規(guī)則抗體的效價(jià)水平（IgG、IgM 或IgG+IgM），同時(shí)比較分析不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值變化，Spearman 相關(guān)分析法評(píng)價(jià)其與不規(guī)則抗體總效價(jià)變化的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性用Spearman 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞亞群與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CD4+T 細(xì)胞中CXCR3-CCR6-Tfh（Tfh2）細(xì)胞的比例升高，而CD4+CXCR5+FoxP3+T 細(xì)胞（Tfr）比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Tfh1/Tfh2 細(xì)胞亞群比值降低，Tfh17/Tfr 細(xì)胞亞群比值升高，兩組CXCR3+CCR6-Tfh 細(xì) 胞（Tfh1）與CXCR3-CCR6+Tfh細(xì)胞（Tfh17）比例無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組外周血Tfh/Tfr 細(xì)胞亞群的效應(yīng)細(xì)胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組血清中IL-4水平明顯高于對(duì)照組，IL-10 的表達(dá)水平低于對(duì)照組，IL-17/IL-10 比值高于對(duì)照組，ILN-γ/IL-4 比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組細(xì)胞因子ILN-γ、IL-17 水平比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

表1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細(xì)胞與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

組別 例數(shù) Tfh1（%） Tfh2（%） Tfh17（%） Tfr（%） Tfh1/Tfh2 Tfh17/Tfr實(shí)驗(yàn)組 32 22.63±5.61 3.80±0.69 22.46±3.27 2.56±2.32 5.35±1.21 8.35±2.23對(duì)照組 32 24.41±4.35 1.53±0.38 20.98±4.25 4.20±1.34 15.64±3.35 4.94±1.38 t 1.42 16.3 1.24 3.49 16.6 7.53 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較（±s）

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較（±s）

組別 例數(shù) ILN-γ（pg/ml） IL-4（pg/ml） IL-17（pg/ml） IL-10（pg/ml） ILN-γ/IL-4 IL-17/IL-10實(shí)驗(yàn)組 32 80.56±15.22 26.35±6.83 71.31±12.81 21.35±5.58 3.05±1.72 3.55±0.72對(duì)照組 32 77.31±10.23 15.37±5.65 75.37±13.64 45.55±8.66 5.13±1.85 1.66±0.82 t 1.01 7.26 1.28 13.3 4.75 9.52 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與不規(guī)則抗體效價(jià)的相關(guān)性分析 不規(guī)則抗體效價(jià)范圍為1：2 至1：256，經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析表明Tfh17/Tfr、IL-17/IL-10比值變化與不規(guī)則抗體效價(jià)呈正相關(guān)（r=0.59、0.75，P均＜0.05），見圖1A、1B；外周血Tfh1/Tfh2、ILN-γ/IL-4比值變化與不規(guī)則抗體效價(jià)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.48、-0.77，P均＜0.05），見圖1C、1D。

圖1 Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與不規(guī)則抗體效價(jià)的相關(guān)性

3 討論

輸血依賴性地中海貧血患者需長(zhǎng)期依賴輸注異體紅細(xì)胞懸液，因此易產(chǎn)生紅細(xì)胞血型抗原同種免疫。但是血型同種免疫的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確，如何有效預(yù)防同種異體血型不規(guī)則抗體的產(chǎn)生，減少輸血反應(yīng)，提高臨床輸血療效，是臨床輸血研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)輸血同種免疫患者的細(xì)胞免疫平衡進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)Th1、Th2、Th17 與Treg 等免疫細(xì)胞平衡在血型同種免疫機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4，5]，但是Tfh 細(xì)胞亞群（Tfh1、Tfh2、Tfh17）與Tfr 細(xì)胞在血型同種免疫機(jī)制中的作用尚不完全清楚且報(bào)道較少。

CD4+CXCR5+Tfh 細(xì)胞是CD4+效應(yīng)性T 細(xì)胞，其可輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體并通過IL-10、IL-21 等效應(yīng)因子發(fā)揮作用。Tfh 細(xì)胞亞群與Tfr 細(xì)胞的免疫失調(diào)在自身免疫性疾病發(fā)生機(jī)制中的作用近年已被證實(shí)[6]，但其在血型同種免疫中的研究報(bào)道較少。外周血Tfh 細(xì)胞可根據(jù)表面趨化因子CXCR3 和CCR6不同分為3 種不同功能亞群：Tfh1、Tfh2、Tfh17；此外Tfr 兼有Tfh 及Treg 細(xì)胞雙重性質(zhì)。這些細(xì)胞亞群與自身免疫病患者自身抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)[7]。Tfh1、Tfh2、Tfh17 及Tfr 與傳統(tǒng)的Th1、Th2、Th17及Treg 細(xì)胞亞群相似，可分泌ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 等不同的效應(yīng)細(xì)胞因子，但Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細(xì)胞平衡在血型同種免疫中的作用機(jī)制尚不十分明確。本研究發(fā)現(xiàn)輸血過程中部分患者易發(fā)生血型同種免疫，可能由于Tfh 細(xì)胞亞群輔助B 細(xì)胞產(chǎn)生高親和力同種抗體，Tfr 細(xì)胞則可抑制血型同種抗體產(chǎn)生，但影響血型同種抗體產(chǎn)生的Tfh亞群類型不明確。有研究發(fā)現(xiàn)Th17/Th22/Treg 平衡失調(diào)參與自身免疫病患者自身抗體產(chǎn)生[8]，但尚不完全明確血型不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17 與Tfr 平衡偏移及其血型同種抗體效價(jià)之間的關(guān)系。

本研究對(duì)血型不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細(xì)胞平衡狀況進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者CD4+T 細(xì)胞中Tfh2 細(xì)胞比例升高，而Tfr 比例降低，Tfh1 與Tfh17 比例無(wú)顯著性差異，而Tfh1/Tfh2 細(xì)胞亞群比值降低，Tfh17/Tfr 細(xì)胞亞群比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Tfh17/Tfr 與患者血型不規(guī)則抗體的效價(jià)呈正相關(guān)，Tfh1/Tfh2 比值與患者血型不規(guī)則抗體效價(jià)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細(xì)胞失調(diào)可能參與血型同種免疫機(jī)制，免疫抑制細(xì)胞數(shù)量或功能下降可能是血型同種免疫易感性的重要原因之一[9，10]。同時(shí)Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細(xì)胞效應(yīng)分子水平也可能與血型不規(guī)則抗體的發(fā)生率相關(guān)，實(shí)驗(yàn)組患者外周血血清中IL-4 水平明顯高于對(duì)照組，IL-10 的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)胞因子ILN-γ、IL-17 與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組IL-17/IL-10 比值高于對(duì)照組，ILN-γ/IL-4 比值低于對(duì)照組，且IL-17/IL-10 比值與血型不規(guī)則抗體效價(jià)呈正相關(guān)，ILN-γ/IL-4 比值變化與血型不規(guī)則抗體效價(jià)呈負(fù)相關(guān)。表明血型同種免疫患者Tfh1/Tfh2 細(xì)胞變化與Tfh17/Tfr 的調(diào)節(jié)效應(yīng)相反，這與當(dāng)前研究結(jié)果相近[11～13]，Tfh2 亞群可能促進(jìn)血型同種免疫產(chǎn)生，激活機(jī)體免疫效應(yīng)功能[14]。

本研究分析表明Tfh2 細(xì)胞亞群是血型不規(guī)則抗體產(chǎn)生的重要效應(yīng)細(xì)胞，而Tfr 細(xì)胞具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能，可抵制或減弱血型同種異體免疫的產(chǎn)生；由于血型抗原同種免疫患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比例失調(diào)，可能是導(dǎo)致定期異體輸血患者血型抗原同種免疫發(fā)生的重要原因，但具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制有待深入研究[15]，因此我們可將Tfh2、Tfr 細(xì)胞亞群平衡及其效應(yīng)因子IL-4、IL-10 作為預(yù)防血型抗原同種免疫的新靶標(biāo)，可通過免疫調(diào)節(jié)糾正定期輸血患者Tfh/Tfr 細(xì)胞亞群比例失衡，對(duì)預(yù)防并減少血型不規(guī)則抗體的發(fā)生具有重要意義。