盧緒英 方芳 李然 滕飛 公文 張進 滕娜娜 辛秉昌 孫德剛

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)作為一類與遺傳高度相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，其三大核心特征是：交互性社交互動障礙、交流障礙、重復性的活動和狹隘的興趣，最早可于2 歲出現(xiàn)癥狀[1-2]。男女比例在2∶1～4∶1，全球發(fā)病率為1%[3]。目前沒有這種復雜的精神類疾病的根治療法，對社會保障、教育、醫(yī)療系統(tǒng)構(gòu)成了嚴重的挑戰(zhàn)。而診斷只能依賴專業(yè)人員的臨床觀察和家長訪談，沒有客觀的醫(yī)學診斷標志。研究證實口腔菌群與腸道菌群在抑郁癥、多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默癥和自閉癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[4-7]。ASD患者因運動協(xié)調(diào)性缺陷，難以完成自主清潔，口腔衛(wèi)生情況差[8]。在人類微生物組計劃中，近一半(45%)的受試者的口腔細菌和糞便細菌重疊[9]?？谇患毦某掷m(xù)定植可使腸道微生物群失調(diào)和慢性炎癥永久化[10]?？谇痪嚎赡芡ㄟ^單獨作用或與腸道菌群交互作用等形式參與了ASD的發(fā)病機制。傳統(tǒng)的微生物鑒別方法(微生物培養(yǎng)、PCR擴增)難以研究整個環(huán)境樣本微生物群。為獲取更真實的生物學信息，近年來環(huán)境樣本微生物的研究多采用高通量測序技術(shù)，關(guān)于口腔菌群與ASD關(guān)系的研究較少且多采用二代測序[11-12]。由于測序長度的限制，二代測序僅能選擇16S rRNA部分可變區(qū)作為擴增片段(V1-V3/V3-V4/V5-V6/V4)，而以SMRT為代表的三代測序技術(shù)可讀取基因全長，提高物種鑒定水平的的同時，在復雜環(huán)境群類區(qū)分中具有顯著優(yōu)勢[13]。

本研究首次應用三代測序分析ASD患者口腔菌群，探究其與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育正常者的唾液菌群差異，為將來尋找孤獨癥譜系障礙唾液標志物提供研究資料。

1 資料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 采樣對象的選擇 篩選出30 例孤獨癥譜系障礙兒童(ASD組)，年齡均在5 歲左右(男∶女=5∶1)。孤獨癥譜系障礙均符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第5版)》診斷標準。篩選出30 例神經(jīng)發(fā)育正常兒童(H組)，年齡均在5 歲左右(男∶女=17∶13)。經(jīng)與班主任訪談全部為神經(jīng)精神發(fā)育正常兒童。排除標準：在過去3 個月內(nèi)使用抗生素或免疫抑制藥物；口腔軟硬組織有明顯異常；有發(fā)育畸形；全身系統(tǒng)性疾病的神經(jīng)發(fā)育正常兒童。兒童監(jiān)護人知情同意并簽署知情同意書，研究經(jīng)青島大學附屬青島市口腔醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 樣品采集 唾液收集：采樣根據(jù)《人類微生物組計劃程序手冊》(http://hmpacc.org/resources/tools_protocols.php)和之前的研究對2 名口腔醫(yī)生進行樣本采集培訓。Kappa值>0.85，上午9 時收集樣本，所有受試者早晨不刷牙，采樣前2 h內(nèi)不進食并輕漱口，用3 mL無菌EP管收集3 mL非刺激性唾液，標記后于-4 ℃條件保存，2 h內(nèi)保存到-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取純化、16S rRNA基因擴增及測序

使用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit(QIAGEN)試劑盒純化分離唾液樣本中基因組DNA，對其16S rRNA 片段全長進行基因擴增，使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready mix試劑盒進行PCR擴增，利用PacBio測序平臺進行SMRT測序。

1.3 生物信息學和統(tǒng)計學分析

使用USEARCH(version 10.0)進行生物信息學分析。使用QIIME及R語言進行菌群統(tǒng)計分析(P<0.05即差異有統(tǒng)計學意義)。H組和C組之間多樣性及代謝差異的比較采用Studentt檢驗。通過LEfSe統(tǒng)計分析不同分組中的物種組成差異。運用ROC曲線及曲線下面積(AUC)進行可視化分類準確性分析。

2 結(jié) 果

2.1 α多樣性分析

圖1可見：多樣性指數(shù)中，ACE、Chao1和PD指數(shù)顯示H組顯著高于ASD組(P<0.05)，說明ASD患兒的唾液菌群多樣性較正常兒童下降。

圖1 受試者唾液菌群多樣性分析

2.2 β多樣性分析

圖2可見：bray-curtis算法表明，ASD組和H組之間的唾液菌群的β多樣性物種差異顯著(P<0.05)，各樣本的群落構(gòu)成存在差異，但樣本有根據(jù)病理狀態(tài)聚類的趨勢。

圖2 H組和C組唾液微生物群落結(jié)構(gòu)比較

2.3 差異性代表菌分析

在門水平，ASD患者和健康對照組的唾液菌群主要包括Firmicutes(厚壁菌門)，Proteobacteria(變形菌門)，Bacteroidetes(擬桿菌門)，Actinobacteria(放線菌門)，F(xiàn)usobacteria(梭桿菌門)，其中Firmicutes(厚壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)在菌群結(jié)構(gòu)比例中占大多數(shù)，分別占81.5%(ASD組)和78.5%(H組)，是絕對的優(yōu)勢菌群(圖3)。

圖3 ASD 組和H組唾液微生物群落物種構(gòu)成比較

根據(jù)LDA score>4的篩選標準(圖4)，在ASD組中：門水平差異菌為Proteobacteria(變形菌門)；屬水平差異菌為Haemophilus(嗜血桿菌屬)和Neisseria(奈瑟菌屬)；種水平差異菌為uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟菌種)。在H組中：門水平差異菌為Firmicutes(厚壁菌門)；屬水平差異菌為Streptococcus(鏈球菌屬)和Prevotella(普雷沃氏菌屬)；種水平差異菌為Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)和Streptococcus_sanguinis(血鏈球菌種)。

圖4 ASD組和H組唾液菌群差異菌

2.4 菌群功能及代謝通路分析

基于KEGG代謝通路預測唾液菌群功能特征，結(jié)果顯示兩樣品組的功能宏基因組存在顯著差異，這可能表明ASD疾病狀態(tài)下口腔微生物宏基因功能發(fā)生了巨大變化。與健康對照組相比，ASD組糖類代謝通路、翻譯、轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)(P<0.05)，而能量代謝通路、脂質(zhì)代謝通路和氨基酸代謝通路顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

圖5 ASD組和H組唾液菌群代謝差異的比較

2.5 基于唾液微生物建立ASD評估模型

首先，篩選對建模最優(yōu)的種系發(fā)育水平，發(fā)現(xiàn)利用細菌種水平圖譜可獲得性能最佳模型(AUC=80.6%，圖6)，提示唾液鏈球菌、血鏈球菌和未命名的奈瑟菌在孤獨癥譜系障礙風險評估方面具有潛在的應用價值。

圖6 利用唾液菌群圖譜建立孤獨癥譜系障礙分類模型

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)口腔微生態(tài)失調(diào)與阿爾茨海默病、帕金森和自閉癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。為尋找疾病可能的早期診斷標志，口腔微生物群落日益得到重視[14]。在本研究中，ASD兒童唾液微生物多樣性和豐富度降低，與之前研究結(jié)果部分一致[11-12,15]。這可能與地理、種族和測序技術(shù)等不同有關(guān)。

在本研究中，ASD兒童中Proteobacteria(變形菌門)增加，F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)降低。此外，在ASD兒童唾液中觀察到Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Pasteurellales(巴斯德氏菌目)、Betaproteobacteriales(β-變形菌綱)、Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Pasteurellaceae(巴斯德氏菌科)、Neisseriaceae(奈瑟氏菌科)、Haemophilus(嗜血桿菌屬)、Neisseria(奈瑟氏菌屬)和uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟氏菌種)的豐度增加，以及Streptococcus(鏈球菌屬)、Prevotella(普雷沃氏菌屬)、Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)和Streptococcus_sanguinis(血鏈球菌種)的含量減少。這些觀察結(jié)果可能有助于確定疾病的口腔微生態(tài)失衡特征。以種水平3 種差異菌建立的評估模型準確率達80.6%。Haemophilus(嗜血桿菌屬)和Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)的類似趨勢得到先前研究研究結(jié)果的支持[12,15]。Haemophilus(嗜血桿菌屬)常在免疫功能低下的的人群中檢出[16]。Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)因其能夠抑制IL-6和IL-8等炎性因子的活化，而作為安全有效的口腔益生菌得到廣泛應用[17]。本研究中ASD兒童口腔微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝特征的改變，得到先前的ASD兒童腸道微生物改變的支持[18]。

一方面，在腸道菌群中，ASD兒童中的Firmicutes(厚壁菌門)、Prevotella(普雷沃氏菌屬)豐富明顯降低。Prevotella(普雷沃氏菌屬)在參與糖類代謝和纖維素代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，碳水化合物消化障礙是ASD患者的病理機制，同時ASD兒童普遍拒絕果蔬類而更偏愛高脂肪類食物[19]，本研究結(jié)果中的ASD兒童唾液菌群糖類代謝功能減退。因此富含纖維素的食物攝入減少及Firmicutes(厚壁菌門)和Prevotella(普雷沃氏菌屬)豐度減少，可能與ASD兒童胃腸道功能紊亂有關(guān)。ASD人群對感覺的處理主要分為3 種模式：感覺超敏、感覺低敏和感覺尋求。當果糖不能被正常吸收時，會嚴重干擾色氨酸(TRP)的吸收，TRP作為合成神經(jīng)遞質(zhì)血清素的重要原料，參與調(diào)解情緒敏感性[20]。因此，本研究結(jié)果中的ASD兒童唾液菌群氨基酸代謝異常可能與感覺處理異常有關(guān)。脂質(zhì)在神經(jīng)元遷移、分化、形態(tài)發(fā)生、髓鞘形成和突觸可塑性等神經(jīng)發(fā)育過程中具有關(guān)鍵作用。El-Ansary等[21]發(fā)現(xiàn)二磷酸代謝、膽固醇代謝、磷脂代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白在ASD病理條件下受損，與本研究ASD兒童唾液菌群脂質(zhì)代謝功能增強的結(jié)果相反；推測這可能是菌群對人體脂質(zhì)代謝失衡的代償反應。另一方面，臨床研究發(fā)現(xiàn)，高脂低碳水以及適量蛋白質(zhì)的生酮飲食可以明顯減輕自閉癥典型癥狀[19]，其可能通過改善能量代謝、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和消化道微生物菌群結(jié)構(gòu)來介導。因此，在ASD病理狀態(tài)下，患者不僅發(fā)生營養(yǎng)物質(zhì)代謝異常、腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝改變，同時伴隨唾液菌群結(jié)構(gòu)及代謝改變，間接或直接影響患者神經(jīng)系統(tǒng)。

綜上所述，在孤獨癥譜系障礙兒童唾液微生物群落特征存在顯著改變，同時篩查出的種水平差異菌建立的評估模型，其辨別準確率可達80.6%。利用其建立ASD風險評估方案是否可以應用與臨床預測高危人群，亟待進一步研究驗證，由于本研究的樣本量、采樣位點較少，今后可加大樣本采集量、增加采樣生態(tài)位點，聯(lián)合多組學全面精確的研究孤獨癥譜系障礙患者口腔微生物信息。