咸瑞卿, 杭寶建, 鞏麗萍, 王聰聰, 張迅杰, 彭 麗, 石 峰*

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南 250101;2. 山東大學(xué)藥學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250012; 3. 華潤雙鶴利民藥業(yè)(濟(jì)南)有限公司質(zhì)量部, 山東 濟(jì)南 250200)

蛇毒血凝酶類藥物是一類以蝮蛇蛇毒為原料制備的止血藥,主要活性成分為蛇毒類凝血酶(svTLEs),其在止血領(lǐng)域中占有重要地位,占止血藥市場份額近50%[1,2]。目前,已上市蛇毒血凝酶類藥物主要來源于矛頭蝮蛇、尖吻蝮蛇、蝰蛇和白眉蝮蛇等蛇種,不同蛇種來源的類凝血酶結(jié)構(gòu)不同,其作用機(jī)制不同,相應(yīng)的藥理作用也存在差異[3,4],因此準(zhǔn)確鑒別蛇毒種屬來源和svTLEs含量對于保障該類產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要。

現(xiàn)報(bào)道的蛇毒種屬鑒別及蛋白質(zhì)檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]、液相色譜法(LC)[6]和電泳法等[6],存在方法繁瑣、靈敏度低、專屬性差等問題。伴隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究日漸成熟,以肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為食品藥品質(zhì)量控制提供了一種新思路,已成功應(yīng)用于肉類產(chǎn)品成分鑒定、中藥摻偽篩查等方面[7-17],但在生化藥物領(lǐng)域研究較少,尚未見基于特征肽的蛇毒類凝血定性定量研究報(bào)道。

本研究采用納升液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Nano LC-Q-Exactive-MS)篩選了矛頭蝮蛇類凝血酶特征肽,并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)建立了檢測矛頭蝮蛇蛇毒種屬來源及類凝血酶含量的方法。與現(xiàn)有檢測方法相比,本研究所建立的方法分析時(shí)間短,專屬性更強(qiáng),靈敏度更高,為從源頭保證矛頭蝮蛇蛇毒類產(chǎn)品的質(zhì)量及用藥安全性提供了技術(shù)支持,并可為其他蛇毒類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

EASY-nLC 1000納升液相色譜聯(lián)用Q-Exactive高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Scientific公司), Triple Quad 6500+型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司), CP225D電子天平(德國Sartorius公司), Sigma 3-30 K冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司), Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國Millipore公司)。

乙腈(色譜純,美國Honeywell公司),甲酸(色譜純,美國ACS恩科化學(xué)公司),胰蛋白酶(序列分析純,德國Sigma公司),碘乙酰胺(分析純,德國Sigma公司),三羥甲基氨基甲烷(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),二硫蘇糖醇(純度≥99%,上海翌圣生物科技有限公司),特征肽EAYNGLPAK(純度≥98%,上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)。

蛇毒SV1～SV3、矛頭蝮蛇類凝血酶(純度98.5%)(蓬萊諾康藥業(yè)有限公司),蛇毒SV4～SV6(錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2 Nano LC-Q-Exactive-MS條件

采用Thermo ReproSil-Pur C18-AQ Trap柱(35 mm×0.2 mm, 5 μm)脫鹽富集,采用Thermo ReproSil-Pur C18-AQ納升分析柱(250 mm×75 μm, 3 μm)進(jìn)行分離。流動相A: 0.1%甲酸水-乙腈(98∶2, v/v);流動相B: 0.1%甲酸水-乙腈(2∶98, v/v)。納升分離泵流速:300 nL/min。梯度洗脫程序:0～5.0 min, 100%A; 5.0～20.0 min, 100%A～90%A; 20.0～75.0 min, 90%A～68%A; 75.0～95.0 min, 68%A～50%A; 95.0～100.0 min, 50%A～100%A。

電噴霧電離(ESI)源,正離子模式,噴霧電壓為2.0 kV,離子傳輸毛細(xì)管溫度為275 ℃,離子傳輸透鏡(S-Lens)傳輸效率設(shè)置為60%。一級質(zhì)譜采用靜電場軌道阱(Orbitrap)作為質(zhì)量分析器,分辨率為60 000,采集范圍為350～1 650。二級質(zhì)譜采用Top20數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行母離子選擇,采用高能誘導(dǎo)裂解(HCD)模式進(jìn)行碎裂,歸一化碰撞能量(NCE)設(shè)置為35%。

1.3 UHPLC-MS/MS條件

色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;流動相A: 0.1%甲酸水溶液,流動相B: 0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～6.0 min, 10%B～40%B; 6.0～6.1 min, 40%B～70%B; 6.1～8.0 min, 70%B; 8.0～8.1 min, 70%B～10%B; 8.1～10.0 min, 10%B。進(jìn)樣量:10 μL。

ESI源,正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度:500 ℃。定性、定量離子對(雙電荷)、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表 1 特征肽的質(zhì)譜采集離子信息Table 1 Ion information of the marker peptide acquired by mass spectrometry

1.4 溶液的制備

1.4.1特征肽篩選溶液

取矛頭蝮蛇類凝血酶5 mg,置于10 mL量瓶中,加25 mmol/L碳酸氫銨溶液溶解并定容;精密量取200 μL,加0.2 mol/L二硫蘇糖醇溶液10 μL,混勻,60 ℃反應(yīng)1 h,加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL,避光放置30 min,加25 mmol/L碳酸氫銨溶液760 μL和10 mg/mL胰蛋白酶溶液10 μL, 37 ℃反應(yīng)90 min, 90 ℃滅活10 min,放冷至室溫,12 000 r/min離心10 min,取上清液作為特征肽篩選用溶液,按1.2節(jié)條件進(jìn)行檢測。

1.4.2特征肽對照品儲備液

取約10 mg特征肽對照品,精密稱定,置于100 mL量瓶中,加25 mmol/L碳酸氫銨溶液并定容至刻度,搖勻,精密量取上述溶液(100 μg/mL)適量,用25 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋制得質(zhì)量濃度為100 ng/mL特征肽對照品儲備液。

1.4.3特征肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

取1.4.2節(jié)特征肽對照品儲備液適量,用25 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為2.5、5、8、10、12、20和30 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)條件進(jìn)行檢測。

1.4.4供試品溶液

取供試品20 mg,置于100 mL容量瓶中,然后加入濃度為25 mmol/L的碳酸氫銨溶液定容,搖勻;精密量取上述溶液1 mL,加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的胰蛋白酶溶液10 μL,在37 ℃下反應(yīng)4 h, 12 000 r/min離心10 min,取上清液作為供試品溶液,按1.3節(jié)條件進(jìn)行檢測。

1.4.5空白溶液

精密量取濃度為25 mmol/L的碳酸氫銨溶液1 mL,加入10 mg/mL胰蛋白酶溶液10 μL, 37 ℃下反應(yīng)4 h, 12 000 r/min離心10 min,取上清液作為空白溶液,按1.3節(jié)條件進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1特征肽的篩選

特征肽的選擇是開發(fā)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,進(jìn)行蛋白質(zhì)定性定量分析的關(guān)鍵和難點(diǎn),直接決定了后續(xù)建立方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。本研究采用普適性強(qiáng)的酶解條件,對純化的矛頭蝮蛇類凝血酶進(jìn)行酶解,以獲得豐富的酶解肽段,并采用納升液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分析,采集了高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用Proteome Discoverer 2.2軟件(美國Thermo Scientific公司)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,初步篩選出了矛頭蝮蛇類凝血酶的備用多肽序列EAYNGLPAK、NVITDKDIMLIR、FICPN、KNVITDKDIMLIR,進(jìn)一步參考特征肽篩選一般原則[18],選擇“EAYNGLPAK”作為矛頭蝮蛇類凝血酶的特征肽。為進(jìn)一步驗(yàn)證該特征肽的種屬特異性,在NCBI數(shù)據(jù)庫里對特征肽“EAYNGLPAK”進(jìn)行BLAST比對分析,確認(rèn)其為矛頭蝮蛇毒類凝血酶特有,具有種屬特異性。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中矛頭蝮蛇類凝血氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot: P04971.1)可知,其序列中僅存在唯一的EAYNGLPAK肽段,可以直接用特征肽的含量表征矛頭蝮蛇蛇毒中類凝血酶的含量。該特征肽的一級和二級質(zhì)譜如圖1所示。

圖 1 特征肽(EAYNGLPAK)的一級和二級質(zhì)譜圖Fig. 1 MS and MS/MS spectra of marker peptide (EAYNGLPAK)

2.1.2特征肽MS/MS參數(shù)的優(yōu)化

為保證方法的實(shí)用性和可推廣性,本研究采用MRM模式監(jiān)測特征肽的碎片離子,以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)蛋白質(zhì)的精確定量。為獲得合適的離子對和質(zhì)譜采集參數(shù),提高檢測靈敏度和特異性,本實(shí)驗(yàn)采用蠕動泵(流速10 μL/min)向三重四極桿質(zhì)譜中引入人工合成特征肽(EAYNGLPAK)標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ng/mL)。通過一級全掃描找到特征肽的母離子,再分別以一級母離子通過二級全掃描找到二級碎片離子,并通過不斷改變碰撞能使碎片離子響應(yīng)增強(qiáng),通過優(yōu)化獲得最佳離子源參數(shù),確定錐孔電壓及碰撞能量。

2.1.3酶解條件的優(yōu)化

二硫鍵還原條件的考察:固定酶解溫度(37 ℃)、酶用量(10 μL)、酶解時(shí)間(4 h),考察了二硫蘇糖醇和碘乙酰胺對特征肽量的影響。結(jié)果顯示,酶解體系中是否加入二硫蘇糖醇和碘乙酰胺對產(chǎn)生的特征肽量無顯著影響,因此選擇無還原劑的直接酶解條件。

酶解時(shí)間的考察:固定酶解溫度(37 ℃)、酶用量(10 μL),考察酶解時(shí)間對測定結(jié)果的影響。比較了不同酶解時(shí)間(0.5、1、2、4、6、8、12 h)產(chǎn)生的特征肽峰面積。由圖2可以看出,隨著酶解時(shí)間的延長,特征肽的含量逐漸升高,當(dāng)酶解時(shí)間超過4 h以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明酶解反應(yīng)趨于完全,因此本方法選擇酶解時(shí)間為4 h。

圖 2 不同酶解時(shí)間下監(jiān)測離子的峰面積Fig. 2 Peak areas of monitoring ions at different enzymatic hydrolysis times

酶的用量:固定酶解溫度(37 ℃)和酶解時(shí)間(4 h),考察酶的用量對測定結(jié)果的影響。由圖3可以看出,在胰蛋白酶質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),酶的用量超過10 μL以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,說明當(dāng)酶的用量為10 μL時(shí),足以完全酶解樣品,因此本方法選擇酶的用量為10 μL。

圖 3 不同酶用量下監(jiān)測離子的峰面積Fig. 3 Peak areas of monitoring ions at different enzyme dosages

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1專屬性

取1.4節(jié)制備的特征肽對照品溶液(10 ng/mL)、空白溶液及陰性樣品溶液(取SV3蛇毒樣品按1.4.4節(jié)方法制備),按1.3節(jié)UHPLC-MS/MS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示空白溶液和陰性樣品溶液在特征肽對照品溶液出峰位置無干擾峰出現(xiàn),特征肽峰形良好,MRM色譜圖見圖4,表明該方法專屬性良好。

表 2 3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率及RSD(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs at three spiked levels (n=6)

圖 4 特征肽對照品溶液(10 ng/mL)、空白溶液及陰性樣品溶液的MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of marker peptide reference solution (10 ng/mL), blank solution and negative sample solution

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)UHPLC-MS/MS條件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。以定量離子對m/z481.9>315.2的峰面積為縱坐標(biāo)(y),以對照品溶液中特征肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, ng/mL),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=143 868x-54 779(r=0.999 6),在2～30 ng/mL范圍內(nèi),特征肽的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3檢出限與定量限

取1.4.3節(jié)2.5 ng/mL的特征肽對照品溶液適量,用1.4.5節(jié)的空白溶液稀釋制得不同濃度的特征肽溶液,進(jìn)樣測定。當(dāng)特征肽質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL和1.25 ng/mL時(shí),對應(yīng)的峰高信噪比分別為約1∶3和1∶10,按1.4.4節(jié)供試品取樣量和稀釋倍數(shù)計(jì)算,本方法的檢出限和定量限分別為2.5 mg/kg和6.25 mg/kg。

2.2.4回收率

本方法通過向空白樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的特征肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),計(jì)算方法回收率。結(jié)果見表2,回收率為95.5%～101.9%,各水平平行測定測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～3.2%,完全能夠滿足實(shí)際樣品的檢測需求。

2.2.5精密度

取1.4.3節(jié)10 ng/mL的特征肽對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算定量離子對所對應(yīng)峰面積的RSD,結(jié)果為1.2%,顯示儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性

取1.4.4節(jié)的供試品溶液,置于8 ℃,分別于0、2、4、6、8、16及24 h進(jìn)樣測定,計(jì)算定量離子對所對應(yīng)峰面積的RSD,結(jié)果為2.6%,說明供試品溶液中特征肽在8 ℃下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性

精密稱取SV1蛇毒樣品6份,每份20 mg,按1.4.4節(jié)方法,制備供試品溶液,同上進(jìn)樣分析,結(jié)果6份樣品的平均含量為102.51 mg/kg, RSD為3.3%,顯示本方法重復(fù)性良好。

2.3 實(shí)際樣品測定

采用本方法對收集到的6批蛇毒樣品進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,SV1～SV3樣品均呈現(xiàn)與對照特征肽EAYNGLPAK色譜保留時(shí)間一致的色譜峰,確認(rèn)其來源于矛頭蝮蛇,采用外標(biāo)法定量,結(jié)果顯示其特征肽含量范圍為102.51～105.40 mg/kg。SV4～SV6樣品在對照特征肽色譜保留時(shí)間處均未提取到色譜峰,顯示未檢測到該特征肽,因此為非矛頭蝮蛇來源蛇毒。

3 結(jié)論

本研究針對矛頭蝮蛇蛇毒,采用普適性強(qiáng)的酶解條件,對純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解,獲得的目標(biāo)蛋白特征肽靶向性更強(qiáng),且避免了其他蛋白質(zhì)的干擾,數(shù)據(jù)分析簡單且準(zhǔn)確性高。為保證方法的實(shí)用性和可推廣性,本研究進(jìn)一步針對所選特征肽優(yōu)化了樣品前處理方法、色譜和質(zhì)譜條件,建立了基于特征肽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測矛頭蝮蛇蛇毒種屬來源及類凝血酶含量的方法。本方法為追溯蛇毒的物種來源提供了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的檢測技術(shù),也可應(yīng)用于矛頭蝮蛇蛇毒、矛頭蛇毒血凝酶及其制劑中類凝血酶的含量檢測,對于優(yōu)選蛇毒原料、優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品安全性具有重要意義。