李婧涵 董 玲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海 200032)

DNA是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，DNA的檢測和定量分析可以作為許多臨床疾病診斷、臨床治療的評價及人類遺傳學(xué)等研究的基礎(chǔ)，而DNA的分離純化是分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中最為基本的操作步驟，也是下游分析如PCR、凝膠電泳和測序等生物學(xué)分析的先決條件。DNA的分離純化是指從細(xì)胞和細(xì)菌的裂解液、全血或其他含有DNA的雜質(zhì)樣品中提取出達(dá)到一定純度的DNA的過程。DNA提取的質(zhì)量如純度和完整性，會顯著影響后續(xù)分析的準(zhǔn)確性和靈敏度。

目前，DNA的分離手段主要包括2大類：液相分離及固相分離。液相分離是最傳統(tǒng)的DNA分離方法，是基于有機(jī)溶劑的萃取，包括Chomczynski’s法、苯酚-氯仿提取法和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取法等多種方法。液相分離方法雖然有效且成本低，但存在著較大的局限性，如：所需樣品量大、分離時間長、步驟繁瑣、易受污染、回收率及純度較低等缺點，使其不適用于自動化和規(guī)?；姆蛛x；使用的有機(jī)溶劑有毒性，會造成環(huán)境污染和操作者損傷；此外，液相分離中有機(jī)溶劑殘留可能對后續(xù)PCR等操作有抑制作用。為了提高提取DNA的純度與回收率，DNA分離方法在不斷更新，目前固相分離的方法受到更多研究者的青睞。固相分離的方法主要是指采用一些對DNA有吸附作用的固相材料顆粒，在一定條件下結(jié)合DNA，然后又在適當(dāng)條件下脫附，實現(xiàn)DNA的分離。固相分離常使用吸附劑在離心旋轉(zhuǎn)柱下進(jìn)行，二氧化硅基質(zhì)、玻璃顆粒、硅藻土和陰離子交換樹脂等是常作為吸附劑的材料。與液相分離方法相比，固相分離方法減少了有機(jī)溶劑的使用，操作簡便，時間短，樣品不易污染與降解，提取的DNA濃度和純度都相對較高。1997年，Hawkins等提出了基于磁性材料快速分離核酸的方法，如今磁性材料迅速發(fā)展成為了主要的核酸固相分離工具。

1 磁性固相萃取(MSPE)

磁性固相萃取是應(yīng)用功能化磁性納米材料從樣品中提取DNA等物質(zhì)的方法。磁性納米材料是一種處于1～100 nm的磁性材料，不僅具有普通納米材料的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等性質(zhì)，還具備特殊的磁性特征，包括超順磁性、高矯頑力以及磁化率。超順磁性指的是在外磁場作用下磁性納米顆粒的狀態(tài)，與順磁體在外磁場的反應(yīng)類似，只是吸引力更大，因此稱為“超順磁性”，故磁性納米顆粒可以很容易在外部磁場的存在下被引導(dǎo)，從而實現(xiàn)與其他組分分離。磁性納米材料對DNA的分離主要原理是利用顆粒表面的功能基團(tuán)(圖1)，通過靜電作用、氫鍵和疏水作用等不同的結(jié)合手段，將DNA固定在磁性納米材料表面，使用磁性引導(dǎo)將DNA與材料的結(jié)合物從樣品中分離，再利用適當(dāng)?shù)臈l件進(jìn)行解吸(圖2)。磁性固相萃取操作簡單，避免了繁瑣的離心步驟，也避免了毒性有機(jī)試劑的使用，還具有易實現(xiàn)自動化的優(yōu)勢，可大規(guī)模從樣品中分離DNA。

圖1 磁性納米顆粒表面修飾的示意圖Fig.1 Schematic diagram of surface modification of magnetic nanoparticles

圖2 磁性納米顆粒吸附和洗脫DNA的示意圖Fig.2 Schematic diagram of DNA adsorption and elution by magnetic nanoparticles

磁性納米顆?？梢苑譃?類，分別為金屬氧化物如FeO、FeO及CoO等，純金屬如Fe、Co及Ni等，其它磁性化合物如鈷鐵氧體、錳鐵氧體及鎂鐵氧體等，磁性合金如鐵鉑合金及鈷鉑合金等。其中基于氧化鐵納米粒(IONP)的技術(shù)正在快速發(fā)展，因其制備過程較為容易，在納米尺度上具有超順磁性、在外磁場作用下分離快、分散性好、生物相容性好和安全性較好等特點，應(yīng)用最為廣泛。

1.1 磁性Fe3O4納米顆粒

磁性FeO納米顆粒具有低毒性和比表面積較大等特點，可以搭載小分子物質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)或負(fù)載藥物；還具有優(yōu)越的超順磁性，可以很容易地從混合物中分離出來；并且可以在表面改性附加上所需的功能基團(tuán)，增強(qiáng)與物質(zhì)的結(jié)合能力。因此在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，應(yīng)用最為廣泛。

但是磁性FeO納米顆粒由于其比表面積較大的特征，聚集傾向比較劇烈，分散性較差，穩(wěn)定性較差；此外，F(xiàn)eO化學(xué)活性高，容易被氧化，結(jié)合DNA后的超順磁性有所減弱，會對磁性分離的高通量和自動化優(yōu)勢有所影響。因此，多是在其表面進(jìn)行功能化修飾，如負(fù)載二氧化硅及其衍生物和添加活性官能團(tuán)等，可加大其分散程度，同時保障與外界接觸的組分不受氧化等影響。此外，表面功能化修飾還可通過靜電作用等結(jié)合核酸，用于快速分離。

對于磁性FeO納米顆粒的表面功能化修飾，按照修飾材料的種類可以分為3類：無機(jī)材料修飾、有機(jī)小分子修飾和高分子聚合物修飾。

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磁性FeO納米顆粒的無機(jī)修飾

1.1.1.1 SiO

在眾多可被用來修飾磁性FeO納米粒子的無機(jī)材料中，SiO的應(yīng)用最為廣泛。主要是因為其具有以下優(yōu)點：1)具有很好的生物相容性和惰性，防止磁性納米顆粒聚集，可以使磁性納米粒子在生物體系中穩(wěn)定存在；2)制備SiO修飾的FeO納米粒子技術(shù)已經(jīng)較為成熟，也相對簡單方便；3)易被進(jìn)一步功能化，可與其他生物分子結(jié)合，方便引入其他活性基團(tuán)。

早在2006年，Zhang等制備了1種由均勻分散在SiO中的磁性納米顆粒組成的新型介孔微球，并應(yīng)用這些磁性粒子作為吸附劑從酵母細(xì)胞和玉米粒中分離基因組DNA，提取的DNA具有令人滿意的完整性、產(chǎn)率和純度，是較早期成功利用磁性納米顆粒提取DNA的試驗之一。SiO層對FeO納米粒子進(jìn)行表面修飾可以提高其吸附質(zhì)粒DNA的功能性和特異性，提取的DNA產(chǎn)量和純度均較高。包覆SiO的磁性納米粒子不但較裸露的FeO納米粒子具有更佳的DNA吸附能力，較商業(yè)化產(chǎn)品也不遜色。使用SiO包裹的磁性納米顆粒提取腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA、提取乙型肝炎病毒和巴爾病毒的基因組DNA及從人全血中提取DNA，均較商業(yè)試劑盒提取速度快、產(chǎn)量高且自動化程度好，也可應(yīng)用于下一步的分子生物學(xué)步驟。較多研究表明，顆粒的孔徑及吸附條件等均對DNA吸附能力具有影響。Sen等利用SiO包裹的磁性納米顆粒分別吸附鮭魚精子DNA和大腸桿菌RNA，最大吸附量高達(dá)10.6 mg/g DNA或7.7 mg/g RNA。而利用中孔SiO-磁性納米顆粒提取鮭魚精子DNA及從細(xì)菌裂解物中純化質(zhì)粒DNA，提取效率均表明中孔材料具有較高的DNA結(jié)合能力。此外，增加鹽濃度或降低pH可以促進(jìn)DNA在中孔SiO磁性納米粒子中的吸附，對RNA的吸附能力同樣是酸性條件大于堿性。故顆粒的孔徑及相關(guān)吸附條件均可成為提高材料提取DNA能力的研究方向。

1.1.1.2 SiO包覆后引入其他活性集團(tuán)

SiO廣泛應(yīng)用于包覆FeO制備磁性納米顆粒，不僅可以有效防止磁性納米顆粒聚集，同時也方便引入如氨基及血紅蛋白等其他活性基團(tuán)。

相較SiO包覆的磁性納米顆粒，引入活性官能團(tuán)后可提高DNA吸附效率。應(yīng)用氨基功能化SiO涂層磁性納米粒子，可通過增強(qiáng)靜電相互作用產(chǎn)生選擇性DNA分離。與僅SiO涂層的納米顆粒相比，氨基官能化納米顆粒的吸附效率高4～5倍，與傳統(tǒng)的酚氯抽提方法相比也有很大的優(yōu)勢。得到的質(zhì)粒DNA保留了生物學(xué)活性，可應(yīng)用于下游生物學(xué)分析。同樣是氨基功能化的SiO磁性納米粒子，其制備方法及吸附DNA的形態(tài)均會對提取DNA的能力造成影響。Sheng等改進(jìn)了采用氨基硅烷來構(gòu)建氨基改性的磁性介孔SiO納米粒子(MMSN @ EDPS)的方法，使其具有獨特的介孔結(jié)構(gòu)和更大的比表面積，使DNA結(jié)合能力有著顯著的提高。Shan等通過在吸附前將細(xì)長的DNA縮合成緊密的小球，促進(jìn)氨基修飾的SiO涂層磁性納米顆粒(ASMNPs)上的DNA負(fù)載。在不同環(huán)境條件下DNA-ASMNPs絡(luò)合形態(tài)不同，ASMNPs對縮合的DNA最大負(fù)載能力是伸長的卷曲DNA的4.4倍，達(dá)到385 mg/g。改變被吸附DNA的形態(tài)及改進(jìn)材料制備的方法均可以提高材料吸附的效率，這為研究提供了新的方法和方向。多數(shù)研究表明，磁性納米顆粒對DNA的吸附作用較強(qiáng)，但解吸相對困難，對于提取效率及應(yīng)用于后續(xù)生物學(xué)分析可能會有所影響。Bai等使用富含氨基的SiO包覆的磁性納米粒子吸附DNA后，使用脫脂奶粉封閉了磁性納米顆粒和DNA復(fù)合物, 可以直接將復(fù)合物添加到PCR體系中進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)分析, 而無需進(jìn)行繁瑣且費時的洗脫和純化DNA的步驟，一定程度解決了DNA與材料解吸困難的問題。

除引入氨基修飾外，Chen等制得了血紅蛋白(Hb)修飾的磁性納米復(fù)合材料，從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，與使用商業(yè)試劑盒相比可獲得相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率和純度。

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磁性FeO納米顆粒的有機(jī)基團(tuán)修飾

使用有機(jī)小分子修飾后，磁性納米粒子在水溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性，并且對細(xì)胞、DNA和蛋白質(zhì)的吸附能力增強(qiáng)，毒性較小。

1.1.2.1 羧基

羧基是常用的有機(jī)小分子官能團(tuán)，它易衍生化，并且羧基化的磁性納米顆粒在水溶液中分散穩(wěn)定性較高。Sarkar等使用羧基包覆的磁性納米粒子簡單并高效的從哺乳動物細(xì)胞中分離mRNA，并成功從瓊脂糖凝膠中提取pDNA。Shan等使用羧基官能化的磁性納米顆粒(CMNPs)從粗大腸桿菌裂解物中純化質(zhì)粒DNA并從尿液樣品中提取gDNA。與有機(jī)溶劑或商業(yè)試劑盒獲得的結(jié)果相比，該方法快速、簡單、具有成本優(yōu)勢且對環(huán)境友好，適合自動化核酸提取。

1.1.2.2 水楊酸(SA)

SA是一種具有羧酸和酚類官能位的化學(xué)配體，通常用作螯合樹脂的修飾劑，并已被證明具有良好的吸附性能。SA包裹的磁性納米顆粒用于從哺乳動物細(xì)胞提取基因組DNA，整個提取分離過程可在30 min內(nèi)完成。與傳統(tǒng)的離心過濾方法相比具有快速、簡便、可靠及環(huán)保等優(yōu)點。

1.1.2.3 吖啶橙(ACO)

ACO具有強(qiáng)熒光和水溶性，是一種細(xì)胞滲透性染色劑，可通過嵌入或靜電引力與DNA和RNA相互作用。Liu等研究了質(zhì)粒DNA和鮭魚精DNA在配體ACO包被的磁性納米顆粒上的吸附，并證實在溶液中加入0.5 mol/L的CaCl可進(jìn)一步增強(qiáng)DNA的吸附量。

1.1.2.4 咪唑(IMI)

在中性pH條件下，IMI修飾的磁性納米顆粒(IMI-MNPs)的表面電荷可以為零。因此，通過改變pH很容易將表面電荷從正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷，說明IMI-MNPs擁有電荷可逆性。低pH時，帶正電的IMI-MNPs可以通過靜電作用吸附DNA，而在pH較高時帶負(fù)電的IMI-MNPs由于靜電排斥而釋放DNA。Maeda等利用IMI-MNPs從單個細(xì)菌細(xì)胞中高效地回收了DNA。

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磁性FeO納米顆粒的高分子聚合物修飾

有機(jī)高分子材料表面含有大量的功能基團(tuán)，具有良好的生物相容性，不僅能與磁性納米粒子表面進(jìn)行有效的反應(yīng)，還能有效防止聚合物團(tuán)聚。

1.1.3.1 聚多巴胺(PDA)

多巴胺聚合條件溫和，PDA單體同時包含鄰苯二酚和胺官能團(tuán)，在水性基質(zhì)中顯示出良好的分散性，并具有出色的環(huán)境穩(wěn)定性。PDA的親水性和生物相容性使其成為一種通用的表面改性方法。核-殼型結(jié)構(gòu)的PDA@FeO可基于靜電相互作用與DNA結(jié)合，并通過pH調(diào)節(jié)PDA@FeO表面酚羥基和氨基的電荷轉(zhuǎn)換來捕獲和釋放DNA，提取率較離心柱法等傳統(tǒng)方法高。Wang等將PDA修飾在帶有羧基的FeO納米粒子表面，利用其在酸性條件下表面帶正電荷的特性，進(jìn)行DNA的吸附和提取。在相同體積的結(jié)合溶液中制備一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液以測定PDA@FeO對DNA的吸附能力，在5～24 mg范圍內(nèi)，PDA@FeO捕獲的DNA量與DNA原始量呈線性，超過該范圍，吸附量達(dá)到平臺期。實驗計算測得PDA@FeO對DNA的吸附能力為161 mg/g，捕獲量優(yōu)于使用商業(yè)試劑盒和傳統(tǒng)苯酚-氯仿提取方法。該方法中未使用PCR抑制劑，也未使用任何有毒的有機(jī)溶劑。此外，結(jié)合及洗脫溶液的組成很簡單，整個吸附和解吸過程均在室溫下進(jìn)行，無需高溫孵育，也不需要頻繁離心。

1.1.3.2 聚乙烯亞胺(PEI)

PEI是一種富含氨基的多價陽離子試劑，可與DNA的帶負(fù)電磷酸鹽骨干體和部分蛋白質(zhì)形成強(qiáng)離子相互作用，以吸附DNA。用PEI在FeO納米粒子的表面進(jìn)行涂層改性，可多次從細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出高純度質(zhì)粒DNA，也可與質(zhì)粒DNA和基因組DNA相結(jié)合，且結(jié)合效率高于商用試劑盒，從生物樣品中分離出的DNA可直接用于PCR等下游應(yīng)用。該技術(shù)不需要任何有機(jī)溶劑，也無需重復(fù)離心、真空過濾或色譜柱分離。

1.1.3.3 聚酰胺胺(PAMAM)

PAMAM涂層可以減少磁性納米顆粒團(tuán)聚，并且可以定制外圍的末端基團(tuán)來控制復(fù)合溶解度。PAMAM樹枝狀修飾的磁性納米粒子(PAMAM-MNPs)可吸附大量DNA，有效的DNA解吸率超過95%，添加二甲基亞砜(DMSO)可以大大改善DNA的回收率，該方法顯示出比市售磁性顆粒更高的DNA提取性能。硫醇功能化PAMAM修飾的磁性納米顆粒(G6 PAMAM-PE-MNPs)，在優(yōu)化條件可回收96%的λDNA。較高的氨基濃度可以提高其對DNA的吸附能力，然而G6 PAMAM-MNPs對DNA釋放率約為總DNA的80%，剩下20%的DNA分子通過靜電作用與固體表面的高密度氨基緊密結(jié)合，不容易從固體表面釋放出來。后續(xù)可針對DNA與材料的解吸條件進(jìn)行更深入的研究。

1.1.3.4 殼聚糖(CTA)

CTA是從甲殼類動物殼中提取的幾丁質(zhì)衍生物，易于獲得、價格低廉且具有生物相容性。因其含有豐富的胺基團(tuán)，可以通過調(diào)整pH進(jìn)行電荷調(diào)節(jié)，是一種有用的電荷轉(zhuǎn)換聚陽離子。CTA上胺基團(tuán)的p

K

約為6.4，即在pH低于6.4時呈陽離子狀態(tài)，并且很容易與陰離子核酸結(jié)合，形成復(fù)合物。低分子量CTA功能化二氧化硅顆粒已被證明可在與PCR兼容的中等高pH(約8.5)下有效洗脫DNA，與酚-氯仿提取方法相比，在操作簡便及選擇性好等方面具有突出的優(yōu)勢。

1.1.3.5 其他高分子聚合物

Percin等制備了新型材料——聚甲基丙烯酸羥乙酯磁性納米粒子，發(fā)現(xiàn)其對質(zhì)粒DNA的總回收效率可以達(dá)到92%，且該磁性顆粒在不明顯降低質(zhì)粒DNA吸附量的前提下可被循環(huán)使用6次。Gai等將聚苯胺(PANI)和聚吡咯(PPy)分別包覆在FeO納米粒子表面，證明使用該材料的DNA提取效率優(yōu)于傳統(tǒng)苯酚-氯仿萃取的方法，且提取的DNA可用于后續(xù)生物學(xué)研究。Cotchim等使用亞甲藍(lán)(MB)、聚丙烯酸和改性氧化鐵磁性納米粒子(PAA/IOMNPs)的復(fù)合材料從樣品中吸附DNA，用外部磁鐵從溶液中分離吸附了DNA的MB-PAA/IOMNPs，并用乙酸從PAA/IOMNPs上洗脫MB-DNA，是一種新的提取、檢測和量化痕量級DNA的策略。

1.2 磁性Fe2O3納米顆粒

除FeO磁性納米顆粒之外，F(xiàn)eO磁性納米顆粒在DNA分離提取中也有著廣泛的應(yīng)用。超順磁多孔FeO-SiO復(fù)合微球可提取HBV的DNA，利用該復(fù)合微球可初步建立一種穩(wěn)定的磁性顆粒全血提取法，提取出純度高、產(chǎn)率高、重復(fù)性好且完整的全血HBV DNA樣本。γ-FeO@Chi@Pani磁性納米材料可應(yīng)用于鮭魚精子DNA的吸附。Medina-Llamas等證明了磁性聚苯胺-磁鐵礦納米復(fù)合材料(PANI/γ-FeOMNC)是從水溶液中回收純雙鏈DNA的有效試劑，在水溶液中聯(lián)合作用10 min就達(dá)到了最大的DNA吸附量75.2 mg/g。通過改變?nèi)芤旱膒H值可以幾乎完全釋放由MNC捕獲的DNA。Medina-Llamas等還評估了MNC在多次回收過程后的可重復(fù)使用程度，結(jié)果表明，PANI/γ-FeOMNC是一種有前途的低成本可重復(fù)使用的材料，可實現(xiàn)快速、簡單和有效的DNA分離和提取。

1.3 其他磁性納米顆粒

Hu等通過靜電作用將PEI固定在FePO納米粒子表面制備了納米復(fù)合材料，其對DNA的吸附能力為61.88 mg/g。Lee等制造了生物素化的陽離子聚合物(聚吡咯/聚乙烯亞胺)的多功能磁性納米線(PEI/mPpy-NWs)用于從血液樣本中分離cfDNA。PEI/mPpy-NW對DNA的捕獲性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于商業(yè)Qiagen試劑盒，故可將PEI/mPpy-NW用于處理肺癌血漿樣品獲得cfDNA。

表1 不同磁性納米顆粒對DNA提取效率的對比
Table 1 Comparison of DNA extraction efficiency of different magnetic nanoparticles

吸附材料Adsorbent material提取標(biāo)本Extractedspecimens最大提取能力/(mg/g)Maximum extractioncapacity提取率/%ExtractionrateA260/A280時間/minTimeSiO2[16]人全血DNA96.4781.79±0.1240中孔SiO2[30]鮭魚精DNA122.2--1 300ASMNPs[35]縮合的DNA385-1.8020SiO2-Hb[37]大腸桿菌質(zhì)粒DNA27.8668.31.8415MMSN@EDPS[34]小牛胸腺DNA210.2282.95-30Fe3O4吖啶橙[43]質(zhì)粒DNA181.1--30鮭魚精DNA164.2PDA[47]小牛胸腺DNA161-1.8025PDA[46]人全血中基因組DNA116.790.21.82±0.0425PANI[56]黑曲霉DNA2.08-1.7940～60PPy[56]黑曲霉DNA2.60-1.75-γ-Fe2O3PANI[58]鮭魚精DNA75.294-20Chi@Pani[59]鮭魚精DNA49.5611.71-FePO4PEI[60]各種生物樣本61.88851.88～1.9015

2 磁性納米顆粒應(yīng)用的發(fā)展與展望

綜上所述，磁性固相萃取作為一種新興的且迅速發(fā)展的DNA提取方法，其優(yōu)勢主要在于：安全無毒、操作簡單并可重復(fù)使用；通過表面活性官能團(tuán)與DNA特異性結(jié)合，使得提取的DNA純度高且濃度大，可以適合痕量DNA提??；并且能夠?qū)崿F(xiàn)自動化和高通量操作。

基于磁性納米顆粒對核酸出色的吸附能力，其高通量及商業(yè)化的核酸提取程序有著可觀的發(fā)展前景。Li等研制了一種基于磁珠(MBs)的快速且高質(zhì)量的通用核酸提取試劑盒，命名為MB-100，同時對其性能進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，它的提取效率遠(yuǎn)高于其他2種商業(yè)化的試劑盒，隨后的PCR反應(yīng)也有著更高的擴(kuò)增效率。Chen等開發(fā)了一種全自動快速核酸提取器(NAE)，可以使用MNPs同時處理16個樣品，多數(shù)樣品的提取過程可在30 min內(nèi)完成；還優(yōu)化了運動控制、機(jī)械結(jié)構(gòu)和試驗配方以提高產(chǎn)量和凈化產(chǎn)品，并應(yīng)用了肝癌樣本對產(chǎn)量及純化效果進(jìn)行了驗證，表明了所開發(fā)的系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。

目前應(yīng)用磁性納米顆粒提取核酸已經(jīng)投入商業(yè)化的使用，常用的商用試劑盒有英國的PrimerDesign、荷蘭的Magtivio、美國的Omega、國內(nèi)的博科、麥伯及百奧萊博等核酸快速提取試劑盒。試劑盒的核酸提取效率毋庸置疑，但價格昂貴，1 mL磁珠產(chǎn)品價格為1 000元左右不等。也有一體式的核酸提取機(jī)器如賽默飛的KingFisher全自動核酸提取儀和德國Chemagen全自動核酸提取儀等，但價格更為昂貴，對于需要批量多樣本提取核酸的操作可能會有比較高的經(jīng)濟(jì)要求。

磁性納米顆粒的研究有幾十年的歷史，對于其特性、制備、類型和應(yīng)用等多方面已有較為透徹的研究。通過綜合前人研究與對比，總結(jié)了多種不同活性修飾的磁性納米粒子對DNA分離提取的效率，如表1所示。綜合文獻(xiàn)的結(jié)論可知，磁性納米顆粒對DNA的分離提取效率取決于多種因素，而改進(jìn)這些因素從而提高DNA提取效率，或在顆粒制作等過程中降低成本是磁性固相萃取進(jìn)一步投入商業(yè)化發(fā)展的研究前景。

首先，磁性納米顆粒本身的性質(zhì)如尺寸、孔徑大小及磁化強(qiáng)度等與分離提取的DNA質(zhì)量息息相關(guān)。因此，構(gòu)建結(jié)構(gòu)完整、粒徑適宜均一且分散性好的磁性顆粒材料對DNA分離效率的提高極為重要。目前的文獻(xiàn)表明中孔徑的顆粒較大小孔徑有著更高的提取效率，改變顆粒其他性質(zhì)如尺寸與磁化強(qiáng)度能否進(jìn)一步提高DNA提取效率或降低制作成本可能是后續(xù)磁性納米顆粒的發(fā)展前景。

其次，磁性固相萃取的優(yōu)勢很大一部分在于其可以以一種磁性納米粒子為核心，在此基礎(chǔ)上引入其他活性官能團(tuán)，而活性官能團(tuán)與DNA分子間的作用力強(qiáng)弱是影響DNA分離提取效率最重要的因素之一。根據(jù)表1對于不同活性官能團(tuán)修飾的磁性納米顆粒對DNA提取效率的總結(jié)與對比可直觀的看到官能團(tuán)修飾對于DNA提取效率的影響。所以嘗試引入新的活性官能團(tuán)或改進(jìn)引入官能團(tuán)的方式方法，研發(fā)新型且高效的功能化磁性納米顆粒，是不斷優(yōu)化磁性分離過程、提高分離效率和質(zhì)量的重要手段。而在磁性納米顆粒發(fā)展的近20余年內(nèi)，廣大研究者嘗試了很多種不同官能團(tuán)的引入，也大致掌握了何種官能團(tuán)對DNA提取的效率較高，故引入全新官能團(tuán)以提高效率可能并不容易。但改進(jìn)磁性納米顆粒的制作過程，可能會使其生產(chǎn)變得更高效或低成本，方便投入大批量生產(chǎn)從而進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用，這也是磁性固相萃取的發(fā)展前景之一。

此外，磁性納米材料的制備方法、所提取DNA的形態(tài)性質(zhì)及結(jié)合緩沖液的pH或鹽濃度等實驗條件均對DNA吸附效率有影響。故在材料相同的情況下，改變實驗條件也可能成為提高DNA提取效率的方法。

與其他DNA分離方法相似，提取基因組DNA仍普遍受限于耗時的樣本裂解過程，限制了整體DNA提取的全過程通量及提取時效性。同時，從前人研究可看出，多數(shù)磁性納米顆粒對DNA的吸附作用較強(qiáng)，但解吸相對困難，所以DNA的提取效率會有所降低，應(yīng)用于后續(xù)生物學(xué)分析的DNA量也會隨之減少。Bai等通過試驗證明，將磁性納米粒子與DNA的復(fù)合物直接作為PCR模板可以避免這個問題。但磁性顆粒對PCR擴(kuò)增過程具有強(qiáng)抑制作用，雖然Bai等證明用脫脂奶粉等物質(zhì)封閉，可減少磁性顆粒對PCR的抑制作用，但對于絕大多數(shù)下游生物學(xué)分析來說，洗脫過程不可避免。故在后續(xù)開發(fā)新型磁性納米顆粒的過程當(dāng)中，除了關(guān)注其吸附DNA的能力，也要盡可能保證在適當(dāng)條件下DNA能夠順利解吸，即洗脫緩沖液的性質(zhì)也是探究如何提高磁性納米顆粒對DNA提取效率的切入點之一。

磁性納米顆粒除了在核酸提取中有著廣泛的應(yīng)用，在很多其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中也起到了重要的作用。比如磁性納米顆粒可以作為捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的工具，也可作為MRI的造影劑在醫(yī)學(xué)成像中使用；在疾病診斷中，可應(yīng)用生物傳感器等進(jìn)行病毒檢測及癌癥診斷；在疾病治療中，磁性納米顆粒可作為藥物載體，靶向釋放到作用部位，也可應(yīng)用于腫瘤熱療及血液凈化等療法?；诖判约{米材料的獨特特性，其在SARS-CoV-2的預(yù)防和治療中也可有廣泛應(yīng)用，也可在對抗COVID-19的斗爭中起到一定作用。

總而言之，磁性納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用極為廣泛，有著很強(qiáng)的研究發(fā)展前景。

3 總 結(jié)

本研究通過多文獻(xiàn)綜合對比總結(jié)了以鐵氧化物為核心的磁性納米材料，總結(jié)了其結(jié)構(gòu)與表面相關(guān)活性官能團(tuán)的修飾對DNA提取效率的影響。

磁性固相萃取作為一種新興的且迅速發(fā)展的DNA提取方法，有著安全無毒、操作簡單、可重復(fù)使用、能夠?qū)崿F(xiàn)自動化及高通量操作等多種優(yōu)勢。目前磁性納米材料已經(jīng)有著比較全面的研究。在后續(xù)研究中，可以通過改變磁性納米材料的尺寸、孔徑大小和磁化強(qiáng)度等性質(zhì)，嘗試引入新的活性官能團(tuán)，研發(fā)新型且高效的功能化磁性納米顆粒，或改變磁性納米材料的制備方法、所提取DNA的形態(tài)性質(zhì)及溶液pH或鹽濃度等實驗條件，以提高DNA與材料的解吸率，不斷優(yōu)化磁性分離過程并提高DNA分離效率和質(zhì)量?；诖判约{米顆粒對核酸出色的吸附能力，發(fā)展高通量商業(yè)化的核酸提取程序，是磁性固相萃取可觀的發(fā)展前景。此外，磁性納米顆粒在核酸提取中有著廣泛的應(yīng)用，表明該材料具有極強(qiáng)的研究發(fā)展前景。