姚玉榮，霍建飛，賁海燕，郝永娟，王萬(wàn)立

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，天津 300384）

番茄（Mill.）是我國(guó)重要的蔬菜作物之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全國(guó)番茄栽培面積135萬(wàn)hm，在蔬菜產(chǎn)業(yè)中具有重要地位。近年來(lái)保護(hù)地蔬菜栽培面積持續(xù)增加，而番茄種植收益較高，因此保護(hù)地番茄種植已經(jīng)成為農(nóng)民脫貧致富的重要途徑。根結(jié)線蟲是一類重要的植物寄生線蟲，寄主植物高達(dá)3 000多種，嚴(yán)重威脅世界各地蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物及農(nóng)作物等安全生產(chǎn)。隨著保護(hù)地蔬菜種植年限的增加，特別是越冬溫室蔬菜面積的擴(kuò)大，為根結(jié)線蟲幼蟲和卵的越冬提供了更有利的環(huán)境，導(dǎo)致根結(jié)線蟲病害的發(fā)生情況逐年加重，蔬菜減產(chǎn)20%~30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%~70%，嚴(yán)重影響了設(shè)施蔬菜的產(chǎn)量、效益及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，化學(xué)防治仍然是治理根結(jié)線蟲病害重要措施之一，應(yīng)用最多的是土壤熏蒸劑和觸殺性殺線劑。由于根結(jié)線蟲抗藥性的增加，僅僅依靠單一的殺線蟲劑已經(jīng)很難控制根結(jié)線蟲的危害，因此尋找一種高效防治根結(jié)線蟲病害且對(duì)環(huán)境友好的技術(shù)顯得尤為重要。

研究表明，植物內(nèi)生菌能夠定殖于植物內(nèi)部，定殖后不僅能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，而且能誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)提高植株對(duì)逆境脅迫的抗性。

雖然利用植物內(nèi)生真菌防治線蟲植物寄生線蟲的研究較少，但是內(nèi)生真菌在防治線蟲方面發(fā)揮重要的作用。Hallmann和Sikora發(fā)現(xiàn)，番茄內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)二齡幼蟲有致死作用。Bajaj等發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢能夠減少大豆胞囊線蟲卵的數(shù)量。

本研究對(duì)天津市主要番茄種植區(qū)番茄根結(jié)線蟲病樣進(jìn)行采集，采用組織分離方法獲得其根結(jié)中的內(nèi)生真菌，利用真菌的分子生物學(xué)鑒定方法解析了番茄根結(jié)內(nèi)生真菌的群落多樣性；通過(guò)觸殺法測(cè)定內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲的生物活性，研究?jī)?nèi)生真菌誘導(dǎo)番茄對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究于2017—2020年在天津市各區(qū)進(jìn)行番茄根結(jié)線蟲病樣采集以及發(fā)生情況調(diào)查，并采集根結(jié)線蟲病樣。采樣地點(diǎn)見表1。

表1 根結(jié)線蟲病樣采樣地點(diǎn)

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

內(nèi)生真菌的分離參照Dababat方法，略有改進(jìn)。將新鮮的番茄根沖洗干凈，剪下根結(jié)用0.5%次氯酸鈉處理后，用無(wú)菌水漂洗3次，然后切成小段，將其挑到混有100 mg·L氨芐青霉素和150 mg·L硫酸鏈霉素的PDA平板上，用于檢測(cè)表面消毒情況，放置2 min后再挑到新的PDA平板上，每個(gè)平板放置5~6段。將培養(yǎng)基置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d檢查片段上長(zhǎng)出的菌落。不能在檢測(cè)表面消毒情況的平板上長(zhǎng)出，但是能從另一平皿的根結(jié)片段上長(zhǎng)出的菌株視為內(nèi)生真菌。對(duì)于長(zhǎng)出的真菌用單孢分離方法進(jìn)行純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定

將提取純化的DNA，用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×Flash PCRMaster Mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA模板2 μL，加ddHO將擴(kuò)增體系補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃，30 s；94℃，10 s；58℃，15 s；72℃，10 s；35個(gè)循環(huán)；72℃，1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送安升達(dá)（天津）生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性分析，確定菌株分類地位。

1.4 內(nèi)生真菌殺線蟲生物活性測(cè)定

內(nèi)生真菌發(fā)酵濾液準(zhǔn)備：在含有PDB的三角瓶中接入將活化的菌片（d=5 mm），置于溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為120 r·min的搖床上培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)的菌液于5 000 r·min離心15 min，獲得發(fā)酵上清液。供試線蟲（南方根結(jié)線蟲）由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害室分離鑒定，在番茄上擴(kuò)繁。待番茄上的線蟲成熟后，用自來(lái)水沖洗番茄根部，挑取新鮮的線蟲卵塊，置于0.1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次后，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化，將孵化的南方根結(jié)線蟲J2濃度調(diào)至1 000條·mL備用。

1.5 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)番茄對(duì)根結(jié)線蟲入侵抗性的測(cè)定

供試菌株：將1.4中篩選出的具有殺線蟲活性的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化?；罨蟮木杲臃N于200 mL PDB溶液中，置于溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min的搖床上恒溫培養(yǎng)3 d后，用滅菌過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，收集孢子并將濃度其調(diào)至1×10cfu·mL。

幼苗準(zhǔn)備：番茄種子55℃溫湯浸種30 min，然后用30℃左右溫水浸泡4~6 h，28℃培養(yǎng)箱中催芽48 h后，播于50孔育苗穴中，溫室育苗。待番茄苗齡至4~6片葉時(shí)取出洗凈，將根系分為均等的兩部分進(jìn)行分根移苗。

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)番茄對(duì)根結(jié)線蟲抗性測(cè)定采用裂根法試驗(yàn)，參照鄢小寧等方法，略有改進(jìn)。番茄分苗后7 d后，在分根一側(cè)接種菌株孢子液即挑戰(zhàn)根系，接種14 d后，在分根另一側(cè)（未接菌）接種南方根結(jié)線蟲1 000條·株稱為應(yīng)答根系。番茄苗接種南方根結(jié)線蟲3周后，檢測(cè)線蟲入侵?jǐn)?shù)量，參照劉維志方法配制酸性品紅溶液。將接種南方根結(jié)線蟲的根系取出，清洗干凈后，浸入酸性品紅溶液中，微波爐加熱3 min，染色后的根系置于4℃冷藏過(guò)夜后自來(lái)水清洗，剪碎，加入清水，用組織勻漿機(jī)破碎3次，每次20 s，將線蟲從根系組織中釋放出來(lái)，統(tǒng)計(jì)入侵線蟲數(shù)量，每個(gè)處理15株，3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 21.0軟件處理，用DMRT進(jìn)行多重比較。菌株處理后線蟲入侵率顯著降低的菌株，計(jì)算接種南方根結(jié)線蟲根系即應(yīng)答根系中線蟲入侵的降低率。

入侵降低率=[（對(duì)照應(yīng)答根系中入侵線蟲數(shù)量-菌株處理應(yīng)答根系中入侵線蟲數(shù)量）/對(duì)照應(yīng)答根系中的入侵線蟲數(shù)量]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲發(fā)生情況

筆者對(duì)天津市各區(qū)進(jìn)行番茄根結(jié)線蟲病樣采集以及發(fā)生情況調(diào)查。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天津市武清區(qū)、寶坻區(qū)、西青區(qū)、薊州區(qū)、北辰區(qū)等主要蔬菜產(chǎn)區(qū)的根結(jié)線蟲病發(fā)生較為普遍，且呈現(xiàn)一種快速上升的發(fā)展態(tài)勢(shì)，對(duì)當(dāng)?shù)卦O(shè)施蔬菜生產(chǎn)造成了極大的危害，嚴(yán)重影響了設(shè)施蔬菜的產(chǎn)量、效益和可持續(xù)發(fā)展，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)根結(jié)線蟲造成蔬菜產(chǎn)量損失高達(dá)80%以上,甚至絕產(chǎn)。

2.2 內(nèi)生真菌多樣性分析分子生物學(xué)鑒定

結(jié)果顯示，從番茄根結(jié)中共計(jì)分離到81種內(nèi)生真菌（表2），其中分離頻率最高的真菌是鐮刀菌屬真菌，共計(jì)47株，占總數(shù)量的58%（圖1）。除鐮刀菌屬外還包括淡紫擬青霉、枝孢霉、毛殼菌、青霉菌等。由此可見，尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌是番茄根結(jié)中主要的內(nèi)生真菌，這些真菌被根結(jié)線蟲攜帶進(jìn)根結(jié)內(nèi)，與根結(jié)線蟲形成病害復(fù)合體，造成根結(jié)腐爛。

表2 番茄根結(jié)內(nèi)生真菌ITS鑒定分析

圖1 番茄根結(jié)內(nèi)生真菌分離頻率

2.3 內(nèi)生真菌殺線蟲活性生物分析

從分離得到的內(nèi)生真菌中篩選到4株殺線蟲活性較好的內(nèi)生真菌分別為枝頂孢霉、、毛殼菌sp.，擬青霉sp.，處理48 h殺線蟲活性分別為91.5%，95.0%，72.8%，86.4%（表3）；內(nèi)生尖孢鐮刀菌殺線蟲活性較低為21.8%，其余菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲J2無(wú)毒殺活性。

表3 內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲J2生物活性測(cè)定

2.4 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)番茄對(duì)根結(jié)線蟲抗性測(cè)定

由表4可知，內(nèi)生真菌、、sp.及sp.在挑戰(zhàn)根結(jié)接種后，應(yīng)答根系中根結(jié)線蟲的入侵率顯著降低。4株內(nèi)生真菌中枝孢霉誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)根結(jié)線蟲入侵的抗性最強(qiáng)，入侵率降低48.96%；其次為，入侵率降低34.48%；sp.和sp.入侵率較低，分別為17.17%，25.10%。

表4 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)番茄對(duì)根結(jié)線蟲抗性

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生真菌對(duì)根結(jié)線蟲的作用方式主要包括2種：直接作用（產(chǎn)生殺線蟲活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物）、間接作用（改變寄主植物的生理生化反應(yīng)）。Strom等從玉米和大豆根系中分離得到626株內(nèi)生真菌，屬真菌是玉米和大豆中最常見的具有殺線蟲活性的內(nèi)生真菌，大豆根系中內(nèi)生真菌群落多樣性與胞囊線蟲的種群密度成正相關(guān)。沈清清等從鬼針草內(nèi)分離的內(nèi)生真菌GF1，發(fā)酵液原液作用12 h對(duì)線蟲的校正死亡率達(dá)到94%以上。Daneshkhah等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌印度梨形孢（）在擬南芥根部定殖后，能夠提高自身抗性，顯著降低線蟲生命力、感染性和繁殖力。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的作用不是單一的，本研究結(jié)果也支持這一結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)，枝頂孢霉、、毛殼菌sp.，擬青霉sp.對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有較強(qiáng)的致死活性，處理48 h后，死亡率70%以上；內(nèi)生真菌枝孢霉誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)根結(jié)線蟲入侵的抗性最強(qiáng)，入侵率降低48.96%；其次為，入侵率降低34.48%；sp.和sp.入侵率較低，分別為17.17%和25.10%。Vu等發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生鐮刀菌接種后，香蕉穿孔線蟲（）在應(yīng)答根系的入侵率降低30.0%~38.5%；Dababat等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生鐮刀菌Fo162菌株接種后誘導(dǎo)其抗性，答根系的根結(jié)減少21%~36%，研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。

內(nèi)生真菌誘導(dǎo)植株抗性與定殖時(shí)間緊密相關(guān)，F(xiàn)uchs等發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生鐮刀菌Fo47在接種初期誘導(dǎo)番茄對(duì)枯萎病的抗性，但是隨著時(shí)間的增加，菌株在植物體內(nèi)定殖后，抗性逐漸消失。因此，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)寄主植物對(duì)根結(jié)線蟲的抗性的持續(xù)時(shí)間有待進(jìn)一步研究。