延永，王靜，田攀

（商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院,陜西商洛 726000）

原發(fā)性痛經(jīng)是女性經(jīng)期前后出現(xiàn)的一種周期性腹部疼痛[1-3]，對患者的正常生活、工作及精神產(chǎn)生較大的影響，嚴重者會影響生命和生育功能[4-5]。治療原發(fā)性痛經(jīng)大多直接采用甾體激素類藥物或前列腺素拮抗劑[6]，大量使用這類藥物會對女性內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不良影響。桃紅四物湯是活血化瘀的經(jīng)典方，以具有強勁破血之力的桃仁、紅花為主，用甘溫的熟地黃和當歸來養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、滋陰補肝，芍藥滋陰養(yǎng)血，以提補血之力，川芎調(diào)暢氣血、行氣活血，以提活血之功。全方配伍得當，使瘀血祛、新血生、氣機暢，具有化瘀生新、標本兼治的顯著特點[7]，被推崇為調(diào)經(jīng)之要方。王嬌[8]將84例原發(fā)性痛經(jīng)患者隨機分為對照組（西醫(yī)對癥治療）和觀察組（桃紅四物湯加減治療）治療，對照組和觀察組總有效率分別為78.57%和95.24%，證明桃紅四物湯加減治療原發(fā)性痛經(jīng)的效果優(yōu)于西醫(yī)對癥治療的效果。目前，桃紅四物湯的研究大都集中于驗證古代配方功效[9-11]，較少探究其制劑類型與方劑配比對藥效發(fā)揮的影響。貼劑是治療痛經(jīng)最直接的方式，具有效率高、使用便捷、利于保存等優(yōu)點[12-14]。貼劑在治療原發(fā)性痛經(jīng)這類病癥部位較為明確的疾病時所展現(xiàn)出的巨大優(yōu)勢，為改良桃紅四物湯的貼劑新劑型提供了理論依據(jù)。本研究以探究制劑類型與方劑配比對藥效發(fā)揮的影響為目的，對制劑成型工藝、基質(zhì)配方、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性檢測等進行研究，通過單因素試驗和響應(yīng)曲面法優(yōu)化，以期開發(fā)出集療效好、儲存時間長、使用舒適便捷等優(yōu)點為一體的桃紅四物痛經(jīng)貼，為桃紅四物劑型改良提供了方法基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桃仁采集于商洛市商州區(qū)黃沙嶺，白芍、當歸采集于山陽縣漫川關(guān)鎮(zhèn)，紅花、川芎、熟地黃購于商洛市怡康大藥房（北新街店）。中藥材由商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院張亦琳副教授鑒定。

1.2 儀器與試劑

TK-12B型透皮實驗擴散池、UV-225型紫外分光光度計（大連儀器制造有限公司）、HH-2型恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司）。

明膠（CP）（鄭州富太化工有限公司）、甘油（CP）（河北九星化工產(chǎn)品有限公司）、微粒硅膠（CP）（山東萍聚生物科技有限公司）、氧化鋅（CP）（海順新材料有限公司）、無紡布（山東聚福源包裝有限公司）、聚丙烯酸鈉（CP）（武漢興眾誠科技有限公司），對照品［苦杏仁苷（批號：110820-201607，純度>98%）、芍藥苷（批號：D1016A，純度>98%）、 阿魏酸（批號：F103702，≥99.5%）］（AP）（南京源植生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 桃紅四物痛經(jīng)貼的制備

處方組成：紅花（9 g）、桃仁（6 g）、川芎（15 g）、熟地黃（10 g）、當歸（15 g）、白芍（8 g）。

浸膏的制備：中藥粉碎后過100目篩，加入到100 mL的圓底燒瓶中，用3倍比例的純凈水浸泡2 h。隨后將體系置于100℃的油浴鍋中加熱3 h，冷卻后，過濾，剩余濾渣重復(fù)上述提取過程，將兩次得到的濾液合并。轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，水浴90～100℃溫度下減壓蒸至稠膏狀，再加入5倍量體積的甲醇，混勻后靜置30 min，待沉淀完全后，取其上清液，減壓除去甲醇至稠膏狀，即得浸膏（1 mL流浸膏相當于原藥材1 g），進而計算浸膏得率。

貼劑的制備：將所需量的明膠倒入燒杯，加入其2倍量的純凈水浸泡30 min至明膠全部溶解，置于60℃恒溫水浴鍋內(nèi)加熱20 min，再依次加入所需量的甘油、聚丙烯酸鈉、氧化鋅0.1 g、微粒硅膠0.1 g，攪拌，至初溶液變?yōu)槿榘咨恼吵頎罡囿w，此時加入桃紅四物浸膏1 g，攪拌混合均勻后，趁熱涂抹于切割好的無紡布上，要求膏體厚度適中，待膏貼表面蓋上保護膜后再取下時不粘著為止，蓋上保護膜后，置封口袋中密封，既得桃紅四物痛經(jīng)貼。

1.3.2 桃紅四物痛經(jīng)貼的考察指標與評分標準

以桃紅四物痛經(jīng)貼的累積透皮率、累積釋放度、粘著力及賦形性作為評價指標對痛經(jīng)貼進行打分，權(quán)重比為 3：3：2：2，計算各項評分的總和。評分指標如表1所示。

表1 桃紅四物痛經(jīng)貼的評分指標

透皮率試驗：取體重為100～105 g的健康大白鼠，脫頸椎處死后，去毛后剝?nèi)⊥暾つw，除去皮下脂肪和結(jié)締組織，分別用蒸餾水、生理鹽水沖洗干凈后，裁剪成3 cm×3 cm規(guī)格，外側(cè)貼覆試驗樣品，固定于透皮擴散池上（皮膚樣品內(nèi)側(cè)朝向擴散液），在池內(nèi)注滿擴散液（30%乙醇），于（32±1）℃，300 r/min 條件下進行試驗。分別于 1，2，4，6，8，10 h從取樣口吸取擴散液1 mL，并補充相同體積的30%乙醇溶液。采用《中國藥典》方法[15]，分別測定苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷的含量，計算Q累積透皮率。

式中，Cn為第n個取樣點測得成分質(zhì)量濃度，Vn為接收室中溶液體積，Ci為第i(n-1)個取樣點測得成分質(zhì)量濃度，Vi為取樣1.0mL，A為有效滲透面積。

釋放度試驗：以Franz擴散池為釋放裝置，將透析膜固定于供給池和接收池之間，將痛經(jīng)貼剪成面積2.5 cm2的圓形小片，緊密貼于半透膜上，釋放接收液為生理鹽水，體積6.4 mL，溫度（37±1）℃，攪拌速度 300 r/min，分別于1，2，4，6，8，10 h 取樣，每次1 mL，同時補加1 mL生理鹽水，0.22 μm的微孔濾膜過濾后，采用《中國藥典》方法[15]，分別測定苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷的含量，計算Q累積釋放率。

式中，Cn為第n個取樣點測得藥物質(zhì)量濃度，Vn為接收室中溶液體積，Ci是第i（n-1）個取樣點測得成分質(zhì)量濃度，Vi為取樣1.0 mL，W為痛經(jīng)貼中的各有效成分含量。

粘著力：將桃紅四物痛經(jīng)貼在18～25℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境下放置2 h取出后，揭掉其保護膜，粘著面向上后固定在傾斜板中央。然后從斜面上部將9 mm不銹鋼球連續(xù)滾落5次，記錄在檢測處粘住次數(shù)。

賦形性：將桃紅四物痛經(jīng)貼在37℃和相對濕度64%的環(huán)境中放置1 h取出后，固定在平整且與水平面保持60°的鋼板上24 h，對膏面進行評價。

1.4 單因素試驗設(shè)計

前期研究發(fā)現(xiàn)，粘著劑明膠、保濕劑甘油和表面活性劑聚丙烯酸鈉對痛經(jīng)貼綜合評分和質(zhì)量影響較大，故選這三種輔料做單因素試驗?；|(zhì)基礎(chǔ)配方為：聚丙烯酸鈉（0.25 g）、甘油（1.5 mL）、氧化鋅（0.1 g）、微粒硅膠（0.1 g）、明膠（0.2 g）。 在其他條件不變的情況下，分別調(diào)整明膠質(zhì)量為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g，甘油體積為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，聚丙烯酸鈉的質(zhì)量為 0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 g，測試明膠、甘油、聚丙烯酸鈉質(zhì)量對桃紅四物痛經(jīng)綜合評分及質(zhì)量的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

單因素試驗結(jié)果得到三個單因素的三組最佳水平，根據(jù)Design-Expert 8設(shè)計軟件，按照響應(yīng)面法的設(shè)計，以痛經(jīng)貼的累積透皮率、累積釋放度、粘著性及賦形性等指標的綜合評分為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化的因素水平

1.6 驗證試驗

對響應(yīng)面優(yōu)化的試驗結(jié)果，重復(fù)三次，放大10倍、20倍測試，檢查新工藝得到桃紅四物痛經(jīng)貼的累積透皮率、累積釋放度、粘著力、賦形性等指標的綜合評分，驗證該工藝制備桃紅四物痛經(jīng)貼的穩(wěn)定性。

1.7 桃紅四物痛經(jīng)貼的質(zhì)量檢查

隨機選取的10片桃紅四物痛經(jīng)貼，分別稱量單片重量，進行重量差異檢查；分別將桃紅四物痛經(jīng)貼放置在高溫、高濕環(huán)境（溫度：40℃，濕度：85%～90%）和室溫（溫度：25℃，濕度：55%～60%）放置30 min，對其進行含膏量、重量差異、含量測定的檢查。含膏量檢查、有效成分（苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷）含量測定采用《中國藥典》方法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃紅四物提取浸膏得率

將1.3.1中經(jīng)二次煎煮提取藥液256 mL濃縮后，得流浸膏47.82 g，浸膏得率為18.62%，浸膏得率較高、質(zhì)量較好。說明通過二次煎煮可以高效提取桃紅四物各藥材的主要成分，煎煮提取方法適用于桃紅四物復(fù)方制劑的制備。

2.2 桃紅四物痛經(jīng)貼制備工藝優(yōu)化單因素試驗

單因素試驗對桃紅四物痛經(jīng)綜合評分結(jié)果見表3，隨著明膠質(zhì)量的增多，桃紅四物痛經(jīng)貼的綜合評分明顯上升；但明膠質(zhì)量增加到一定程度，再增加明膠質(zhì)量，桃紅四物痛經(jīng)貼的有效成分累積釋放度、累積透皮率及賦形性等指標變差，從而導(dǎo)致綜合評分降低?？赡茉蚴沁^多的加入明膠會導(dǎo)致桃紅四物痛經(jīng)貼流動性和涂抹性變差。因此，選用明膠質(zhì)量為0.15，0.20，0.25 g作為響應(yīng)面的試驗水平。甘油體積的增加，在一定范圍內(nèi)會使桃紅四物痛經(jīng)貼的綜合評分出現(xiàn)上升現(xiàn)象，但甘油體積增加到一定程度，再增加甘油體積，桃紅四物痛經(jīng)貼的粘度會急劇降低，使得桃紅四物痛經(jīng)貼的粘度系數(shù)大幅度減小，綜合評分降低。因此，選擇甘油體積為1.0，1.5，2.0 mL作為響應(yīng)面試驗的三個水平。聚丙烯酸鈉質(zhì)量對桃紅四物痛經(jīng)貼的綜合評分影響與甘油相似。適量的聚丙烯酸鈉有利于提升桃紅四物痛經(jīng)貼的粘度和涂抹性，同時不會對有效成分的累積透皮率和累積釋放度產(chǎn)生較大的影響。但過多的加入聚丙烯酸鈉會導(dǎo)致流動性變小、粘度增大，使其賦形性和有效成分的累積透皮率及累積釋放度降低，影響綜合評分。因此，選用聚丙烯酸鈉質(zhì)量為0.25，0.30，0.35 g響應(yīng)面試驗的三個水平。

2.3 桃紅四物痛經(jīng)貼制備工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗得到最佳因素水平，進行Box-Benhnken中心組合的試驗設(shè)計，以桃紅四物痛經(jīng)貼的累積透皮率、累積釋放度、粘著性及賦形性等為指標進行綜合評分為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4。

表4 桃紅四物痛經(jīng)貼制備工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

表5可見，所建立的多元回歸模型差異顯著（F=36.9＞1，P＜0.000 1）， 模型失擬項不顯著（P=0.056 3＞0.05），說明該模型能夠?qū)?yōu)化的工藝進行真實模擬。其決定系數(shù)R2=0.979 4，測量信噪比為14.724，說明該模型的契合度足夠好，各因素的變異概率較低，且因素選擇合理。從各因素對桃紅四物痛經(jīng)貼綜合評分影響的F值大小可判斷，各因素對桃紅四物痛經(jīng)貼綜合評分影響的順序為：B（甘油體積）＞C（聚丙烯酸鈉質(zhì)量）＞A（明膠質(zhì)量）。根據(jù)軟件模擬模型預(yù)測綜合評分回歸方程為：Y=88.32 －0.3125A+0.8B －0.4875C －0.225AB －0.1AC+0.2250BC－5.84A2－1.46B2－1.63C2。 預(yù)測最優(yōu)工藝的配料比為：明膠0.20 g、甘油1.64 mL、聚丙烯酸鈉0.30 g，綜合評分為88.43分。

圖1是該模型模擬的明膠、甘油、聚丙烯酸鈉的含量對桃紅四物痛經(jīng)貼綜合評分影響趨勢的響應(yīng)面，在模擬的響應(yīng)面圖形上，有明顯的凸起，說明在該模型模擬的綜合評分的響應(yīng)面可以預(yù)測出綜合評分的最大值。由圖1（a）和圖1（b）可見，明膠質(zhì)量對綜合評分的影響最大，隨著明膠質(zhì)量的增加，桃紅四物痛經(jīng)貼的綜合評分顯著提高，但過量的明膠會導(dǎo)致桃紅四物痛經(jīng)貼流動性和涂抹性變差，對其有效成分累積釋放度、累積透皮率和賦形性綜合評分產(chǎn)生明顯影響，體現(xiàn)在響應(yīng)面上就是明膠對應(yīng)的一側(cè)坡度最陡。響應(yīng)面底部是各因素對桃紅四物痛經(jīng)貼綜合評分的等高線，等高線的形狀可反映兩個因素的交互作用。由圖1所示，各因素相互作用的等高線形狀為明顯的橢圓形，說明各因素之間有一定的交互作用。

圖1 各因素兩兩交互對桃紅四物痛經(jīng)貼綜合評分的影響

2.4 桃紅四物痛經(jīng)貼制備工藝的驗證

經(jīng)驗證，桃紅四物痛經(jīng)貼的綜合評分為89.12分（RSD＝51.98%），與預(yù)測產(chǎn)率基本一致。對工藝放大10倍，20倍進行試驗，所制得貼劑與小試結(jié)果基本一致。驗證結(jié)果說明本研究模擬的模型準確可行，優(yōu)化出桃紅四物痛經(jīng)貼工藝具有很好的穩(wěn)定性。

2.5 桃紅四物痛經(jīng)貼的質(zhì)量檢查

桃紅四物痛經(jīng)貼平均重量為3.515 g，重量差異在±1%以內(nèi)，貼劑較為輕盈，使用舒適。含膏量平均值為5.813 g/100 cm2，經(jīng)測定，單個貼劑中苦杏仁苷、阿魏酸、芍藥苷的含量分別為5.31%，0.68%，1.38%，單片貼膏有效成分含量越多，一定范圍內(nèi)越有利于提升貼劑療效。將桃紅四物痛經(jīng)貼分別置于高溫、高濕環(huán)境（溫度：40℃，濕度：85%～90%）30 min，桃紅四物痛經(jīng)貼各項指標變化在5%以內(nèi)，制備的桃紅四物痛經(jīng)貼性質(zhì)較穩(wěn)定，各項指標均符合貼劑標準[15]。

3 討論與結(jié)論

本研究以桃紅四物湯為基礎(chǔ)，對常用于凝膠膏劑的基質(zhì)配料比進行改良優(yōu)化，研制出一款對于原發(fā)性痛經(jīng)治療效率較高的桃紅四物痛經(jīng)貼。具體工藝配方為：桃紅四物浸膏1.0 g，明膠0.20 g，甘油1.64 mL，聚丙烯酸鈉0.30 g，氧化鋅0.1 g，微粒硅膠0.1 g，水0.4 g。經(jīng)驗證，制備的桃紅四物痛經(jīng)貼平均重量為3.515 g，重量差異限度在±1%以內(nèi)。膏面整體光潔平滑、無多余顆粒物、氣泡和殘留物。粘度適中、使用時不易脫落。含膏量較大，含膏量平均值為5.813 g/100 cm2，且高溫、高濕環(huán)境比較穩(wěn)定。該工藝可根據(jù)實際制備需求放大。

秦嶺是我國重要的野生中藥資源寶庫[16]。據(jù)統(tǒng)計，僅陜西省的秦嶺區(qū)域內(nèi)可入藥的天然草藥植物就達到3 210種[17]，其中，不乏大量可用于有效治療痛經(jīng)，活血養(yǎng)血的珍貴藥草。由紅花、桃仁、川芎、熟地黃、當歸、白芍配伍而成的桃紅四物湯被譽為養(yǎng)血祛瘀、溫經(jīng)止痛的經(jīng)典名方，對女性痛經(jīng)具有標本兼治的療效。本研究通過對桃紅四物痛經(jīng)貼劑的制劑成型工藝、基質(zhì)配方、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性檢測等的研究，創(chuàng)新性開發(fā)出桃紅四物湯的貼劑新劑型，實現(xiàn)了桃紅四物藥湯的體外實施，能有效地避免藥物分子與生物效應(yīng)對機體的刺激傷害，減少副作用，具有給藥直接、方便實施、安全穩(wěn)定等特點[18-20]，解決湯劑煎藥過程繁瑣、儲存困難的難題，有效提升了患者的依從性。桃紅四物湯成分復(fù)雜，與同類型化學藥物的研究和開發(fā)相比較具有更大的難度，本研究將西藥中普遍開展的藥物傳輸系統(tǒng)研究應(yīng)用于中藥制劑的開發(fā)過程，創(chuàng)新性將桃紅四物有效成分的累積釋放度、累積透皮率引入新劑型的評價體系中，有效克服了貼劑受底物活性成分受分子量、親水/親油性和熔點等因素影響較大的弊端，為發(fā)展桃紅四物新劑型、新產(chǎn)品提供新的研究思路，推動了中藥事業(yè)的不斷進步。在后續(xù)研究中，應(yīng)著重關(guān)注中藥貼劑體外藥物釋放、湯劑體內(nèi)藥物釋放與治療效果的差異，開展不同劑型、不同處理方式、不同用藥位置治療效果產(chǎn)生影響的作用機制研究[21-22]，不斷規(guī)范治療程序，為貼劑藥效發(fā)揮、提升治療效果提供臨床依據(jù)。