董鳴豪，武云杰，李鈉鉀，汪忠坪，王保興，汪代斌，馬 嘯，趙龍杰，葉協(xié)鋒，李 奇，江厚龍*

增碳減氮對植煙土壤微生物的影響

董鳴豪1，武云杰1，李鈉鉀2，汪忠坪1，王保興3，汪代斌2，馬 嘯4，趙龍杰4，葉協(xié)鋒1，李 奇5*，江厚龍2*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.中國煙草總公司重慶市公司，重慶 400023；3.云南中煙工業(yè)有限責任公司，昆明 650202；4.重慶市煙草公司豐都分公司，重慶 408200；5.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，杭州 310008）

為探究不同增碳減氮措施對植煙土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以云煙116為研究對象，設(shè)置常規(guī)施肥（CF）和3個增碳減氮處理[常規(guī)施肥減氮10%，分別加施菇渣有機肥750 kg/hm2（MO）、高碳基肥600 kg/hm2（HB）、生物有機肥750 kg/hm2（BO）]，測定其土壤碳氮養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，MO處理土壤全碳和有機質(zhì)含量較常規(guī)施肥CF分別顯著增加了23.62%和25.05%；與CF相比，MO處理酸桿菌門、綠彎菌門兩個優(yōu)勢菌門相對豐度更高，慢生根瘤菌屬（）相對豐度也明顯高于其他處理；HB處理上述菌群相對豐度僅次于MO處理，BO處理上述菌群相對豐度最低，而鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬等致病菌屬在HB處理中相對豐度最低。研究表明，菇渣有機肥配合減氮措施在促進土壤碳、氮養(yǎng)分釋放，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提升養(yǎng)分利用率方面效果最佳。

有機肥；減量施氮；土壤微生物

烤煙作為一種重要的經(jīng)濟作物，產(chǎn)量對其經(jīng)濟效益有重要影響。多年來，由于對產(chǎn)量的片面追求，重施氮肥現(xiàn)象在煙葉生產(chǎn)中普遍存在，造成了土壤有機質(zhì)降低、酸化板結(jié)等問題，阻礙了土壤養(yǎng)分供應[1-2]，導致土壤微生物數(shù)量減少，煙葉質(zhì)量下降。同時，過量氮肥大量淋失造成了環(huán)境污染[3-4]，已經(jīng)成為制約我國優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)主要因素之一。

近年來，隨著人們對發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的重視，有機肥廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5-9]。研究表明[10-11]，有機肥可有效增加土壤有機質(zhì)，提升土壤碳氮比，改善土壤理化性質(zhì)，進而促進土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與煙株養(yǎng)分吸收，增加土壤微生物多樣性，從而促進烤煙產(chǎn)質(zhì)量提升。金亞波等[12]研究表明，施用有機物料可以提升植煙土壤速效養(yǎng)分，增加土壤大團聚體比例，提升團聚體穩(wěn)定性。陳山等[13]研究表明，生物炭可以顯著提升植煙土壤有機碳、有機質(zhì)含量，改善土壤碳氮比。姜佰文等[14]研究發(fā)現(xiàn)，減氮配施有機肥可顯著提升植株干物質(zhì)積累量，提高土壤養(yǎng)分利用率。因此人們把目光聚集在增施有機肥與控制化肥氮用量上，以期探索出能夠滿足節(jié)肥增效和可持續(xù)發(fā)展的土壤改良措施。錢旎等[15]對重慶12個區(qū)(縣)煙田土壤的養(yǎng)分分析表明，pH適宜的土壤僅占全市煙區(qū)土壤的38.8%，土壤堿解氮和速效鉀含量偏高，需要嚴格控制氮肥用量，進一步加強土壤改良，以提升煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在重慶煙區(qū)開展了增施有機物料并減少化肥氮施用試驗，研究其對土壤碳、氮養(yǎng)分和土壤微生態(tài)的影響，為植煙土壤改良和優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2020年5—9月在重慶市豐都縣太平壩鄉(xiāng)（E 108°9′，N 29°44′）進行，供試烤煙品種為云煙116。土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分為：有機質(zhì)18.75 g/kg，全氮2.03 g/kg，堿解氮85.22 mg/kg，pH 5.23，速效磷183.82 mg/kg，速效鉀289.83 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)4個處理，如表1所示。CF，常規(guī)施肥氮111 kg/hm2，(N)∶(P2O5)∶(K2O)=1∶1∶3；各處理減氮的同時，保持磷鉀肥用量不變。磷肥、鉀肥分別用過磷酸鈣和硫酸鉀補充，肥料種類及養(yǎng)分含量見表2。

表1 試驗處理設(shè)計

表2 試驗主要肥料信息

4月11日進行煙田整地、施肥及起壟，所有物料于起壟前一天條施。煙苗于5月7日進行移栽，大田管理參照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)措施。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤樣品采集 于移栽后90 d（2020年8月7日）采集煙草根際土壤樣品。每個小區(qū)按照S形取樣法選取6株煙，挖取根部，采用抖根法采集根際土壤。將各點土樣混勻，去除植物根系及其余雜物后，過1 mm篩置于10 mL無菌管中，用于16S rRNA和ITS基因高通量測序。

于移栽后120 d（2020年9月7日）采集煙草0～20 cm耕層土壤樣品，每個小區(qū)按照S形取樣法選取6個點的土壤混勻合成1個土樣。土樣取好后于陰涼處風干，剔除異物研磨過篩后，檢測土壤碳、氮指標。

1.3.2 土壤碳、氮指標分析[16]有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法；堿解氮測定采用堿解擴散法；全氮采用凱氏定氮法；采用VarioEL III型元素分析儀測定樣品中全碳含量；腐殖質(zhì)采用熊毅-傅積平改進法。1.3.3 土壤微生物測定 采用Fast DNA? Spin Kit（Qbiogene，Inc.USA）試劑盒提取土壤總DNA。細菌16S rRNA用338F（5'-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'）引物進行PCR擴增，真菌ITS用ITS5- 1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2-2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，合格后使用NovaSeq6000進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 23.0，和https://magic.novogene.com/平臺進行數(shù)據(jù)分析制圖。

2 結(jié) 果

2.1 對土壤碳、氮養(yǎng)分含量的影響

由表3可知，各增碳減氮處理土壤全碳、有機質(zhì)含量較CF均有提升，其中MO土壤全碳、有機質(zhì)含量較CF顯著提升了23.62%、25.05%。土壤腐殖質(zhì)中，各增碳減氮處理土壤胡敏酸含量均顯著高于CF，以HB土壤胡敏酸含量最高，其次為BO。

2.2 對土壤微生物結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 土壤微生物樣本測序結(jié)果 對4個處理共12個樣品進行基因高通量測序，得到787?791個Raw reads，對低質(zhì)量與短長度序列及嵌合體進行過濾后，得到優(yōu)質(zhì)序列440?418條，平均長度為413.17 bp。以97%的一致性進行OTUs聚類，得到2180個OTU。從土樣中獲得16S細菌和ITS真菌粗讀數(shù)后，經(jīng)過質(zhì)量篩選和嵌合體過濾，回收細菌54?757～72?962個，真菌82?569～94?543個，均為高質(zhì)量讀數(shù)。序列被聚為2180個細菌OTU和1345個真菌OTU，其中CF、MO、HB、BO特有細菌OTU數(shù)目分別為298、140、87、130，特有真菌OTU分別為218、169、163、301。由圖1A可以看出，在細菌中，抽樣讀數(shù)大約在5000以下時，細菌種（屬）類數(shù)迅速增加；讀數(shù)在5?000～15?000之間，細菌種（屬）數(shù)緩慢增加；讀數(shù)超過15?000之后，其種（屬）類數(shù)的增長逐漸趨于平緩；由圖1B可以看出，在真菌中，抽樣讀數(shù)大約在10?000以下時，真菌種（屬）類數(shù)迅速增加；讀數(shù)在10?000～20?000之間，真菌種（屬）數(shù)緩慢增加；讀數(shù)超過20?000之后，其種（屬）類數(shù)的增長逐漸趨于平緩。由此說明所取得土壤微生物樣品具有代表性。

表3 不同處理土壤碳、氮養(yǎng)分含量

注：不同小寫字母表示在＜0.05（Tukey's-b test）水平上差異顯著。下同。

Note: different lowercase letter indicates significant difference at＜0.05(Tukey's-b test). The same as below.

圖1 細菌（A）與真菌（B）稀釋曲線

2.2.2 對土壤微生物α多樣性的影響 微生物群落Alpha多樣性可以體現(xiàn)微生物群落多樣性與豐富度，其中Shannon指數(shù)越高，多樣性越高，物種分布越均勻；Chao1指數(shù)則代表了樣品中包含的物種總數(shù)，即群落豐富度。如表4所示，各處理測序深度指數(shù)均在0.99以上，說明測序結(jié)果可以反映樣本真實情況。各增碳減氮處理細菌OTUs數(shù)目即觀測的物種數(shù)均少于CF處理，其中HB與CF差異最?。桓魈幚鞸hannon指數(shù)均低于CF，但差異不顯著；CF Chao1指數(shù)顯著高于MO和BO。真菌Alpha多樣性分析表明，MO處理OTUs數(shù)目、Shannon指數(shù)與Chao1指數(shù)均高于其他處理，而HB、BO處理的OTUs數(shù)目、Shannon指數(shù)與Chao1指數(shù)均低于CF，但各處理之間差異不顯著。

表4 微生物Alpha多樣性統(tǒng)計表

2.2.3 對土壤微生物β多樣性的影響 運用NMDS對4個處理土壤微生物群落組成差異進行了分析（圖2），各處理點間距離代表差異程度。由圖2A可知，CF細菌群落組成與其余各處理細菌群落組成存在差異，MO細菌群落組成與CF差異最大；HB和BO細菌群落組成較為接近。由圖2B可知，CF與其余各處理真菌組成存在差異，MO、HB真菌群落與CF差異更加明顯，說明菇渣有機肥與高碳基肥對真菌群落結(jié)構(gòu)影響更大。

MRPP分析表明（表5），CF-MO的細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)為組內(nèi)差異大于組間差異，其余兩兩處理間細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)差異均表現(xiàn)為組間差異大于組內(nèi)差異（值大于0說明微生物群落結(jié)構(gòu)組間差異大于組內(nèi)差異；Observe delta值越大說明組內(nèi)差異大，Expect delta值越大說明組間差異大）。在細菌中，BO-CF的組間差異最大，BO-HB的組內(nèi)差異最??；真菌中，CF-HB的組內(nèi)差異最小，BO-HB和BO-MO的組間差異均最大。

2.2.4 對土壤微生物群落構(gòu)成的影響 由圖3可知，在門水平上，土壤細菌優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、unidentified_Bacteria、綠彎菌門（Chloroflexi），其豐度之和超過細菌總豐度的75%。與CF相比，MO、HB、BO處理變形菌門相對豐度分別降低了16.07%、21.59%、13.62%，而酸桿菌門、unidentified_Bacteria、綠彎菌門相對豐度均有6.15%～42.99%的提升。其中，酸桿菌門與綠彎菌門相對豐度均以MO處理最高。此外，所有增碳減氮處理中WPS-2相對豐度均高于常規(guī)施肥的土壤；HB處理芽單胞菌門、擬桿菌門相對豐度提升優(yōu)于其余處理。

圖2 土壤微生物細菌（A）和真菌（B）NMDS分析圖

表5 微生物MRPP分析表

由圖4可知，在屬水平上，各處理優(yōu)勢細菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（）、、TM7、JG30a-KF-32、芽單胞菌屬（）、慢生根瘤菌屬（）和r。在優(yōu)勢屬中，MO、HB、BO處理鞘氨醇單胞菌屬、較CF相對豐度降低，JG30a-KF-32、慢生根瘤菌屬相對豐度較CF有所提升，其中MO、BO處理的JG30a-KF-32、慢生根瘤菌屬相對豐度最高。BO處理褚氏桿菌屬相對豐度高于CF，HB、BO處理芽單胞菌屬相對豐度較CF明顯提升。同時，各處理TM7相對豐度較CF均明顯降低。

圖3 門水平上的細菌相對豐度

圖4 屬水平上的細菌相對豐度

根據(jù)各處理不同細菌屬水平相對豐度進行顯著差異分析，由圖5可知，CF與BO有6個細菌屬具有顯著差異，BO優(yōu)勢菌屬相對豐度顯著高于CF，HB優(yōu)勢菌屬慢生根瘤菌屬（）顯著高于CF；其余處理間顯著性差異菌屬均為稀有菌屬。

圖5 各處理細菌屬水平顯著性差異分析

由圖6可知，門水平上真菌優(yōu)勢菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門(Mortierellomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、合霉菌門(Chytridiomycot)、隱菌門(Rozellomycota)、油壺菌門（Olpidiomycota），其中增碳減氮處理子囊菌門相對豐度占比均超過50%。與CF相比，增碳減氮處理子囊菌門相對豐度分別降低了8.56%、7.12%、1.28%。同時，較CF，各處理均提升了被孢霉門相對豐度；MO提升了毛霉門相對豐度；HB、BO提升了擔子菌門相對豐度。合霉菌門、隱菌門在各處理中相對豐度均較小且在不同處理中相對豐度變化不大。

圖6 門水平上的真菌相對豐度

由圖7可知，屬水平上真菌優(yōu)勢菌屬為短梗蠕孢屬（）、被孢霉屬（、鐮刀菌屬（）、無梗囊霉屬（）、毛霉菌屬（）、木霉菌屬（和腐質(zhì)霉屬（），各處理優(yōu)勢菌屬相對豐度之和占各群落總豐度的51.45%～58.45%。與CF相比，MO、BO、HB處理短梗蠕孢屬相對豐度均有所降低，而被孢霉屬、無梗囊霉屬及毛霉菌屬相對豐度明顯提升。MO與HB處理木霉菌屬相對豐度較CF降低，而BO處理木霉菌屬相對豐度較CF升高。

根據(jù)各處理不同真菌屬水平相對豐度進行差異顯著性分析，由圖8可知，BO處理菌屬相對豐度顯著高于CF，MO處理被孢霉屬顯著高于CF。其余處理間菌屬均差異不顯著。

圖7 屬水平上的真菌相對豐度

圖8 各處理真菌屬水平差異顯著性分析

2.3 土壤環(huán)境因子與微生物群落的相關(guān)性分析

對土壤微生物與土壤養(yǎng)分的冗余分析結(jié)果表明（圖9），RDA1和RDA2上的解釋量分別為27.1%和21.65%，胡敏酸、富里酸對細菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著（<0.05），其中富里酸影響最大。對真菌而言，在RDA1和RDA2上的解釋量分別為22.93%和20.37%，全氮、全碳、堿解氮、有機質(zhì)、腐殖酸、胡敏酸對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著（<0.05），富里酸影響較?。?0.05）。

注：TN，全氮；TC，全碳；AN，堿解氮；OM，有機質(zhì)；HA，腐殖酸；MA，胡敏酸；FA，富里酸。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，各增碳減氮處理可提升土壤有機質(zhì)與全碳含量，這與王興龍等[17]和于法輝等[18]研究結(jié)果一致。一方面增碳減氮處理可直接提升土壤碳含量，另一方面有機肥的施用為微生物繁殖提供碳源，促進了土壤微生物活性提升，進而增加了土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化潛力[19]。

Alpha多樣性指數(shù)是評價微生物群落豐富度與多樣性的重要指標，多樣性指數(shù)越高表明多樣性與豐富度越高[20]。本研究中增碳減氮處理并未顯著改變土壤真菌群落豐富度，但降低了細菌群落豐富度，其中MO、BO處理細菌群落Chao1指數(shù)顯著低于CF，這可能是由于氮肥的減少降低了部分富養(yǎng)型微生物的相對豐度，導致物種分布均勻度降低和微生物群落豐富度與多樣性下降[20-21]。

增碳減氮處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響較大，各增碳減氮處理細菌群落酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度上升，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度降低。研究表明，酸桿菌門作為一種嗜酸菌，不但受土壤pH影響，還受到有機質(zhì)含量等因素影響[22]，本研究中，MO處理有機質(zhì)顯著高于CF，同時酸桿菌門相對豐度較CF明顯提升，表明有機質(zhì)可以促進酸桿菌門豐度提升；此外，酸桿菌門多屬于寡營養(yǎng)類群，土壤氮營養(yǎng)減少時也有利于其種群繁殖[23]。酸桿菌門、綠彎菌門參與碳循環(huán)[24]，尤其是綠彎菌門具有將大分子有機物降解至小分子有機物的能力[25]，主要參與土壤碳、氮的固定[26-28]。MO處理的酸桿菌門、綠彎菌門、慢生根瘤菌屬（）相對豐度最高，表明MO處理對土壤碳、氮的固定能力有明顯提升。子囊菌門、被孢霉門（Mortierellomycota）為真菌中的優(yōu)勢菌門，而各增碳減氮處理子囊菌門相對豐度均低于CF。研究表明[29]，施用氮肥可以提升子囊菌門相對豐度，因此其相對豐度的下降應與減氮有關(guān)。在真菌群落屬水平上，各增碳減氮處理被孢霉屬（）、無梗囊霉屬（）及毛霉菌屬（）相對豐度提升，短梗蠕孢屬相對豐度降低，腐質(zhì)霉屬相對豐度以BO處理最高。無梗囊霉屬可以促進煙株養(yǎng)分吸收、提升煙株抗病性[30]，進而促進煙株生長。本研究也發(fā)現(xiàn)HB處理鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬相對豐度均低于CF，鐮刀菌屬與腐質(zhì)霉屬均屬于致病菌[31]，其豐度降低有利于降低病害發(fā)生。此外，HB處理在綠彎菌門豐度僅次于MO處理，這與施河麗[20]等研究結(jié)果中高碳基肥可相對提升土壤有機質(zhì)含量并降低鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬等致病菌屬豐度的結(jié)果一致?？梢钥闯觯琈O處理相較其他處理可更好的提升碳、氮代謝相關(guān)菌群豐度；HB處理可降低致病菌群豐度。

4 結(jié) 論

增碳減氮措施可不同程度的改善土壤碳、氮養(yǎng)分狀況以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤腐殖酸是影響土壤微生物的關(guān)鍵因素。常規(guī)施肥減氮10%并增施菇渣有機肥750 kg/hm2處理對土壤碳養(yǎng)分增幅最大，提升慢生根瘤菌屬、無梗囊霉屬等碳氮代謝菌群相對豐度。

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Effects of Different Measures of Increasing Carbon and Decreasing Nitrogen on Soil Microbes in Tobacco Planting Fields

DONG Minghao1, WU Yunjie1, LI Najia2, WANG Zhongping1, WANG Baoxing3, WANG Daibin2, MA Xiao4, ZHAO Longjie4, YE Xiefeng1, LI Qi5*, JIANG Houlong2*

(1. Tobacco College of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. China National Tobacco Corporation Chongqing Company, Chongqing 400023, China; 3. Yunnan Tobacco Industrial Co., Ltd., Kunming 650202, China; 4. Chongqing Tobacco Company Fengdu Branch, Chongqing 408200, China; 5. Zhejiang Tobacco Industrial Co., Ltd., Hangzhou 310008, China)

In order to explore the effects of different carbon-increasing and nitrogen-reducing measures on soil nutrients and microbial community structure of tobacco planting fields, taking flue-cured tobacco Yunyan 116 as the research object, conventional fertilization (CF) and 3 carbon-increasing and nitrogen-reducing treatments [On the basis of conventional fertilization, reduce nitrogen by 10% and add mushroom residue organic fertilizer 750 kg/hm2(MO), high carbon base fertilizer 600 kg/hm2(HB), and biological organic fertilizer 750 kg/hm2(BO)] were conducted, and the soil carbon and nitrogen nutrients and microbial community structure were determined. The results showed that compared with the conventional fertilization CF, the contents of total carbon and organic matter in the soil treated with MO were significantly increased by 23.62% and 25.05%, respectively; The relative abundance of the two dominant bacterial phyla, Acidobacteria and Chloroflexi, was higher in MO treatment, and the relative abundance ofwas also significantly higher than that in other treatments. The relative abundance of the above bacterial groups in the HB treatment was just lower than the MO treatment, and the relative abundance of the above bacterial groups in the BO treatment was the lowest. The relative abundance of HB treatment was the lowest among pathogenic bacteria such asand. The results from this study have shown that mushroom residue organic fertilizer combined with nitrogen reduction measures has the best effect in promoting the release of soil carbon and nitrogen nutrients, improving soil microbial community structure, and improving nutrient utilization.

organic fertilizer; reduced nitrogen application; soil microorganisms

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.004

S572.01

A

1007-5119（2022）04-0022-10

中國煙草總公司重慶市公司項目[A2020NY01-1303（1）；（A20201NY01-1304）]

董鳴豪（1996-），男，主要從事煙草栽培生理研究。E-mail：dmh6096@foxmail.com

，E-mail：李 奇，liqi@zjtobacco.com；江厚龍，jhl513@163.com

2021-11-21

2022-06-29