譚政委，魯?shù)さ?，?磊，余永亮，許蘭杰，楊紅旗，楊 青，董 薇，李春明，安素妨，蘆海靈，梁慧珍

紅花光調(diào)控信號途徑關(guān)鍵基因的克隆及表達(dá)分析

譚政委，魯?shù)さ?，?磊，余永亮，許蘭杰，楊紅旗，楊 青，董 薇，李春明，安素妨，蘆海靈，梁慧珍*

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002

以藥用植物紅花為研究對象，克隆光信號途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，為紅花基因的功能研究提供參考。以紅花轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為參考，設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增方法從紅花中克隆得到HY5的全長cDNA和DNA序列。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對該基因進(jìn)行分析，預(yù)測編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，并通過熒光定量PCR方法檢測基因在紅花不同組織及花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況?；虻腸DNA全長為462 bp，編碼153個(gè)氨基酸，DNA全長為1941 bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析表明，CtHY5為親水性蛋白，定位于細(xì)胞核中。系統(tǒng)進(jìn)化樹及模體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明CtHY5與來自菊科的刺菜薊、黃花蒿、薇甘菊、向日葵、萵苣中的HY5進(jìn)化關(guān)系較近。定量分析表明，在白色紅花和紅色紅花中，基因均在花中表達(dá)量最高，其次為莖和苞片，在根中表達(dá)量最低。此外，除了根外，基因在白色紅花各組織中的表達(dá)量要明顯高于紅色紅花。首次從紅花中克隆得到了光信號途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，并研究了該基因在不同花色紅花品系中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

紅花；光信號途徑；HY5；基因克??；表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子HY5（ELONGATED HYPOCOTYL5）是基本亮氨酸拉鏈類（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子類的轉(zhuǎn)錄因子，最早是在擬南芥中克隆得到[1]。編碼的蛋白為光敏色素下游的核心光信號調(diào)節(jié)因子，在光信號通路中具有十分重要的作用，HY5的C末端具有特殊的bZIP結(jié)構(gòu)域，能夠直接與基因啟動子作用元件G-box（CACGTG）相結(jié)合，從而能調(diào)控基因的表達(dá)它能通過不同的感受光信號接收光信號，并將光信號傳遞給下游作用元件，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育[2-5]。

HY5廣泛參與植物生長發(fā)育各個(gè)生理過程的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。HY5通過結(jié)合基因上游的CUF-1元件與之協(xié)同調(diào)控?cái)M南芥幼苗葉綠素積累和光形態(tài)建成[6]，此外，HY5結(jié)合并正調(diào)控晝夜節(jié)律相關(guān)基因[7]，促進(jìn)礦物質(zhì)營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)[8-9]。最新研究表明，黃花蒿中AaHY5通過與AaWRKY9的啟動子結(jié)合來激活其表達(dá)，協(xié)同參與調(diào)控光和茉莉酸酯介導(dǎo)的青蒿素的生物合成[10]；番茄中SlHY5在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上直接調(diào)控果實(shí)成熟、花青素和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯效率[11]。在不同的光照條件下，HY5也可以直接結(jié)合花青素生物合成基因查耳酮合成酶（）基因、查耳酮異構(gòu)酶（）基因等，調(diào)節(jié)花青素的積累。光敏色素互作因子PIF3和HY5在光照下正調(diào)控花青素合成[12-13]。。

基因已經(jīng)從擬南芥(L.) Heynh[1]、蘋果Borkh.[14]、油菜Linn.[15]、梨Rehd.[16]、黃花蒿L(fēng)inn.[10]、番茄Linn.[17]、苦蕎(L.) Gaertn[18]等物種中完成了分離和鑒定。但是，目前在藥用植物紅花L.中尚未見基因的相關(guān)報(bào)道。

紅花，別名草紅花、紅藍(lán)花、刺紅花，為菊科紅花屬一年生雙子葉草本植物，其干燥花入藥，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效[19]，紅花花中主要的活性化合物是黃酮類化合物，目前從紅花中分離得到類黃酮化合物超過60種[20]。其花顏色多樣，如紅色、白色、黃色、橙色等，其花色差異推測可能是由類黃酮組成成分和含量不同引起的，然而相關(guān)分子機(jī)制還未見報(bào)道。

本研究根據(jù)前期紅花花期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過PCR擴(kuò)增，獲得了紅花HY5同源基因的cDNA序列，并以紅花葉片DNA為模板獲得基因的全長DNA序列。通過生物信息學(xué)的分析方法對CtHY5蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域，疏水性親水性，二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并對CtHY5進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。另外，檢測了該基因在不同花色的紅花品系、不同組織及不同花期的表達(dá)量，以期為進(jìn)一步闡明光調(diào)控紅花花青素及類黃酮生物合成調(diào)控的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為利用該基因改善紅花中藥材品質(zhì)提供理論參考。

1 材料

供試材料為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心藥用植物研究室收集的管狀花為紅色和白色紅花品系，經(jīng)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心梁慧珍研究員鑒定為菊科紅花屬植物紅花L.，種植于河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，自然條件生長，待植株生長至開花期，取根、莖、葉和苞片，并在管狀花從花冠總苞片露出的第1、2、3、4、5和6天取管狀花，分別標(biāo)為S1、S2、S3、S4、S5和S6期，所有組織部位和樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將采集的樣品立即放入液氮中保存，并轉(zhuǎn)移至?80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)銻NA提取。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照北京華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit試劑盒說明書提取樣品的總RNA，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA的質(zhì)量和完整性進(jìn)行檢測，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)對總RNA濃度進(jìn)行測定，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）說明書操作步驟（Code No. RR047A），將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。

2.2 DNA提取

按照北京華越洋DNA提取試劑盒提取紅花幼葉DNA樣品，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進(jìn)行檢測，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)對DNA濃度進(jìn)行測定。

2.3 CtHY5基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序的Unigene基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-ATGCAAGAGCAAGCTGCAA-3’，下游引物：5’-CTATTTCCTTTCTTGCATACCG-3’，分別以管狀花基本伸出苞片時(shí)的紅花管狀花cDNA和紅花幼葉DNA為模板，利用KOD酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到基因的全長cDNA和DNA序列，反應(yīng)程序如下：94 ℃、2 min（98 ℃、10 s，56 ℃、30 s，68 ℃、2 min）×35 循環(huán)68 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用生工Sangon Biotech SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（Lot.：AA24KA4369）回收目的片段，連接到TaKaRa pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入TaKaRa DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單菌落，PCR檢測后，將陽性菌落送往公司測序。通過DNAMAN軟件拼接出基因全長cDNA序列。

2.4 CtHY5基因序列的生物信息學(xué)分析

通過MEGA 7.0軟件比對基因全長cDNA和DNA序列，找出基因內(nèi)含子序列。利用ORF finder在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/）確認(rèn)的CDS序列，CtHY5蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)進(jìn)行分析，通過在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）完成；使用NCBI中的CD-Search（https://www.ncbi.nlm. nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb. cgi）對氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定。CtHY5蛋白的二級結(jié)構(gòu)使用在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp. fr/cgi- bin/npsa_ automat. pl?page=/NPSA/npsa_ sopma. html），三級結(jié)構(gòu)通過SWISSMODLE（https:// swissmodel. expasy. org/ interactive）進(jìn)行。通過TMHMM Server v2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）對CtHY5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；選用SignalP-5.0Server在線軟件(http://www.cbs. dtu.dk/services /SignalP/ index.php)以及PSORT在線軟件（https://www. genscript.com/psort.html）分別進(jìn)行信號肽預(yù)測和亞細(xì)胞定位分析。以CtHY5蛋白序列為模板，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast P模塊進(jìn)行比對分析，找出其它物種中CtHY5蛋白的同源序列，利用DNAMAN對CtHY5蛋白與其它物種的HY5同源蛋白的同源性進(jìn)行分析；通過MEGA7.0軟件中的Neighbor-joining構(gòu)建CtHY5蛋白系統(tǒng)化進(jìn)化樹，并通過Bootstrap方法對進(jìn)化樹進(jìn)行檢測，Bootstrap值設(shè)置為100。系統(tǒng)發(fā)育樹中序列的模體結(jié)構(gòu)采用MEME（https://meme-suite.org/meme/）在線網(wǎng)站進(jìn)行分析。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）

通過qRT-PCR技術(shù)檢測基因在管狀花為紅色和白色2個(gè)紅花品系中根、莖、葉和苞片以及花不同發(fā)育時(shí)期1、S2、S3、S4、S5和S6期中表達(dá)量，利用Premier 5設(shè)計(jì)基因的熒光定量PCR引物，上游引物：5’-AAAGCCCGGCTG- ACAAAGA-3’，下游引物：5’-CGCACCTCCAACT- CCAACA-3’，內(nèi)標(biāo)參比基因?yàn)榛?，上游引物?’-CATCCATTATCCAACAATC-3’，下游引物：5’-AAGAGTAATCAGTCTCCA-3’，使用TaKaRa TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、3min，隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、28 s。通過熔解曲線分析監(jiān)測PCR擴(kuò)增的特異性，反應(yīng)程序從55 ℃到94 ℃ 0.1 ℃/s速度。每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次，通過2-ΔΔCt相對定量法對基因進(jìn)行表達(dá)水平分析。以Student's檢驗(yàn)（Student's-test）方法對基因在紅色和白色兩個(gè)紅花品系中不同組織和花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，＜0.05表示差異具有顯著水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 CtHY5基因的克隆

利用RT-PCR方法，從管狀花為紅色的紅花品系中得到了1個(gè)cDNA全長為462 bp的基因同源基因（圖1-A），命名為。為了進(jìn)一步對紅花基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以紅花幼苗DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序、比對分析發(fā)現(xiàn)紅花HY5基因DNA全長為1941 bp（圖1-B），包含4個(gè)外顯子，長度分別為97 bp、166 bp、157 bp和42 bp，3個(gè)內(nèi)含子，分別為1083 bp、320 bp、和76 bp（圖1-C）。

3.2 CtHY5基因的序列分析

紅花基因cDNA序列經(jīng)ORF finder在線軟件分析，顯示其具有1個(gè)長度為XX bp的完整讀碼框，編碼153個(gè)氨基酸（圖2-A），通過在線軟件Prot Param對CtHY5蛋白的氨基酸組成及比例進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Glu數(shù)量最多，占11.8%，trp和phe數(shù)量最少，占0.7%（表1）。其分子式為C711H1204N234O239S5，包含2393個(gè)原子，相對分子質(zhì)量為17 015，理論等電點(diǎn)為9.73，半衰期為30 h，帶正電荷氨基酸殘基和帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)目分別為29、23，脂肪系數(shù)為66.99，親水性指數(shù)為?1.014，不穩(wěn)定指數(shù)為58.82，表明CtHY5為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

A-紅花HY5 cDNA序列擴(kuò)增 B-紅花HY5 DNA序列擴(kuò)增 C-紅花HY5基因內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)示意圖

用NCBI的CD-Search分析CtHY5蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為bZIP-HY5-like、BRLZ和bZIP-1（圖2-A、B）。其中bZIP-HY5-like結(jié)構(gòu)域包括86位到136位共51個(gè)氨基酸，其序列RLKRLLRNRVSAQQARERKKAYLLELEVRVKELE KK NSEVEERFSTLQNENQ；BRLZ結(jié)構(gòu)域包括81位到143位共65個(gè)氨基酸，其序列KENKR LKRLLRNRVSAQQARERKKAYLLELEVRVKELEK KNSEVEERFSTLQNEN Q MLRHILK；bZIP-bZIP-1結(jié)構(gòu)域包括84位到143位共60個(gè)氨基酸，其序列KRLKRLLRNRVSAQQARERKKAYLLELEVRVKELEKKNSEVEERFSTLQNENQMLRHILK。

A-CtHY5基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，黑色方框代表起始密碼子和和終止密碼子 B-CtHY5蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

表1 CtHY5氨基酸成分

Table 1 Amino acid composition of CtHY5

氨基酸數(shù)量占比/%氨基酸數(shù)量占比/% Ala (A)15 9.8 Leu (L)12 7.8 Arg (R)1610.5 Lys (K)13 8.5 Asn (N) 7 4.6 Met (M) 5 3.3 Asp (D) 5 3.3Phe (F) 1 0.7 Gln (Q) 9 5.9Pro (P) 5 3.3 Glu (E)1811.8Ser (S)1711.1 Gly (G) 9 5.9Thr (T) 5 3.3 His (H) 2 1.3Tyr (Y) 1 0.7 Ile (I) 3 2.0Val (V)10 6.5

3.3 CtHY5基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-Prot Scale在線工具對CtHY5蛋白的親水/疏水性分析表明，其中正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性，通過分析表明，CtHY5蛋白負(fù)值數(shù)量多于正值數(shù)量，且第10位纈氨酸（Val，V）具有最高分值1.144，疏水性最強(qiáng)，第84位賴氨酸（Lys，K）具有最低分值?3.044，親水性最強(qiáng)（圖3）。

圖3 CtHY5蛋白疏水性/親水性預(yù)測

通過ExPASY中的SOPMA tool預(yù)測CtHY5蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CtHY5蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（α-helices）占58.17%，無規(guī)則卷曲（random coil）占36.60%，β-折疊（β-turn）和延伸鏈（extended strand）較少，分別為3.92%和1.31%（圖4-A）。為了進(jìn)一步了解紅花HY5蛋白的結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL對CtHY5蛋白進(jìn)行同源建模，得到紅花HY5蛋白的三維空間模型（圖4-B），ExPAsy structure assessment程序評測推導(dǎo)，CtHY5蛋白模型6iak.1.A得分為0.74，與來自雞中CREB3蛋白序列的相似性為34.78%，并且，該蛋白可能以同源二聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)功能。

利用SignalP-5.0 Server在線軟件對CtHY5蛋白的氨基酸序列進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明，該蛋白中無信號肽存在，為非分泌蛋白。為了進(jìn)一步對CtHY5的功能進(jìn)行預(yù)測，通過PSORT在線軟件對CtHY5蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，結(jié)果表明CtHY5定位于細(xì)胞核的概率為95.7%，定位與細(xì)胞質(zhì)中的概率僅為4.3%，這與CtHY5作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中調(diào)控基因表達(dá)的功能預(yù)測相一致。

3.4 CtHY5蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI Blastp查找CtHY5在其他物種中的同源氨基酸序列，比對分析發(fā)現(xiàn)，CtHY5與刺菜薊s Linn. HY5的相似性最高，為96.08%，與向日葵Linn. HY5的相似性為88.05%，與薇甘菊Kunth HY5的相似性為86.71%，與黃花蒿L(fēng)inn. HY5的相似性為84.71%，與萵苣Linn. HY5的相似性為82.91%。與其他物種中HY5類似，CtHY5具有此類蛋白所特有的典型的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合域，這些結(jié)構(gòu)在不同物種中保守性較高，也是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能所必須的（圖5）。

通過在NCBI、UniProt數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道中搜索已克隆研究的其物種中HY5，與CtHY5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，分析CtHY5與其他物種中HY5的進(jìn)化關(guān)系，從進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，CtHY5與菊科中的刺菜薊、黃花蒿、薇甘菊、向日葵、萵苣中的HY5親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹種聚為一支，而與來自其它科植物如芝麻、煙草、玉米、風(fēng)信子中的HY5親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖6）。

A-CtHY5二級結(jié)構(gòu) B-CtHY5三級結(jié)構(gòu)

●表示被酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化的絲氨酸位點(diǎn); 橫線代表蛋白的堿性區(qū)域，*標(biāo)志為代表亮氨酸重復(fù)序列，方框?yàn)榱涟彼崂溄Y(jié)構(gòu)域

通過MEME對系統(tǒng)進(jìn)化樹中17個(gè)HY5序列進(jìn)行模塊結(jié)構(gòu)分析，分析表明基序列1和3最保守，在所有分析序列中都存在，基序5和6較特異，基序5只在油菜、玉米和風(fēng)信子中存在，而基序6只在紅花和刺菜薊中存在。從模塊結(jié)構(gòu)特征可以看出，親緣關(guān)系越近的物種中模塊基序結(jié)構(gòu)越相似。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在所有分析序列中，只有刺菜薊的模體基序與紅花HY5一樣，均含有4個(gè)模塊基序，分別為基序1、2、3和6，這預(yù)示著它們可能具有相似的功能（圖6）。

圖6 不同植物基于HY5氨基酸序列的鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹及模體分析

3.5 CtHY5基因表達(dá)分析

利用RT-PCR檢測基因的各組織中表達(dá)，結(jié)果顯示基因在紅花所有組織中均有表達(dá)，在花中表達(dá)量最高，其次是苞片和莖，在根中表達(dá)量最低，并且白色紅花的苞片和花中基因表達(dá)量都明顯高于紅色紅花（＜0.01）（圖7-A）。

*表示差異顯著，P＜0.05，**表示差異極顯著，P＜0.01

對基因在花發(fā)育的不同時(shí)期定量分析結(jié)果表明，紅色紅花品系中基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后降低又增加的表達(dá)趨勢，而白色紅花品系中基因的表達(dá)量則呈現(xiàn)先降低后增加的表達(dá)趨勢，并表現(xiàn)出白色紅花品系中基因的表達(dá)量要整體高于紅色紅花，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，白色和紅色紅花品系中基因的表達(dá)量在花發(fā)育的S1、S4和S6時(shí)期差異極顯著（＜0.01），S2和S5期差異顯著（＜0.05），S3期差異不明顯（圖7-B）。

4 討論

HY5屬于bZIP類轉(zhuǎn)錄因子家族，最早是在擬南芥中克隆得到[1]。HY5作為光敏色素下游的核心光信號調(diào)節(jié)因子，在光信號途徑中發(fā)揮著重要的作用[21-22]。依據(jù)紅花轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，本研究克隆得到一個(gè)基因的cDNA和DNA全長序列，其DNA序列具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析顯示，CtHY5與為親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成和無規(guī)則卷曲組成，僅含有少量β-折疊和延伸鏈，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示CtHY5蛋白呈拉鏈形狀，并且以同源二聚體的形式存在。亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白定位于細(xì)胞核中，這與其轉(zhuǎn)錄因子作用角色相一致，這些結(jié)果與已報(bào)道的云梨、苦蕎中的HY5分析結(jié)果相一致[16, 22]。

序列分析表明，紅花基因編碼153個(gè)氨基酸，與擬南芥、苦蕎和番茄中HY5相比氨基酸序列相對較短[11, 16, 22]。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，與黃花蒿中HY5蛋白類似[10]，CtHY5蛋白也具有高度靈活、無序的N末端，這可能是造成CtHY5蛋白比其它植物中HY5同源蛋白相對較短的原因之一。并且，HY5蛋白N端含有一個(gè)酪蛋白激酶（casein kinase II）的磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以與具有E3泛素連接酶活性的COP1（constitutively photomorphogenic 1）蛋白直接相互作用。COP1與HY5在植物光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用相反，在黑暗條件下，COP1進(jìn)入細(xì)胞核與HY5互作并將其泛素化，并促進(jìn)26S蛋白酶對它的降解。而光照條件下，HY5被活化并相應(yīng)光照參與其他生理反應(yīng)調(diào)節(jié)過程[23-24]。本研究中CtHY5蛋白具有COP1蛋白磷酸化位點(diǎn)，這暗示著在紅花中HY5極大可能通過與COP1蛋白互作參與植物光信號生理調(diào)節(jié)過程。

前人研究發(fā)現(xiàn)，HY5可以直接影響約3 000個(gè)基因的表達(dá)，基因可以通過其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合啟動子區(qū)域的順式元件調(diào)控基因其表達(dá)，這些順式元件包括T/G box（CACGTT），E-box（CAATTG），GATA-box（GATGATA），ACE-box（ACGT），Z-box（ATACGGT），C-box（GTCANN），hybrid C/G（G）和C/A boxes，通過結(jié)合于含有這些順式元件的基因參與植物光信號、生物節(jié)律、開花時(shí)間、營養(yǎng)元素、植物激素響應(yīng)等各個(gè)生理過程[25-26]。最近的研究表明，基因在植物逆境脅迫響應(yīng)中也起著非常重要的作用，在番茄中，HY5還可以通過結(jié)合于冷脅迫信號途徑關(guān)鍵因子CBF（C-repeat binding factors）基因啟動子區(qū)域激活其表達(dá)，從而增強(qiáng)番茄的抗冷性[27]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，HY5可以結(jié)合于基因啟動子的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的順式元件B（GGCCACGCCA）上并促進(jìn)該基因在紫外、強(qiáng)光照和低溫脅迫下的表達(dá)，從而提高植物的抗脅迫反應(yīng)[28]。本研究克隆的CtHY5也具有其典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與擬南芥、番茄等植物一樣，該結(jié)構(gòu)域也位于CtHY5蛋白的堿性區(qū)域內(nèi)，并且氨基酸序列具有高度的保守性，通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，基因在紅花的根、莖、葉、苞片和花等組織中呈現(xiàn)組成型表達(dá)，在擬南芥中，在根、下胚軸、莖和花器官中也呈現(xiàn)組成型表達(dá)，大量的研究表明，基因參與擬南芥光形態(tài)建成、側(cè)根發(fā)育、生物及非生物脅迫的多個(gè)生理過程[22]，這暗示著基因也可能參與紅花生長發(fā)育的多個(gè)生理過程中。

HY5在植物色素生物合成調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用，HY5可以直接結(jié)合于植物的花青素生物合成途徑相關(guān)基因、基因的啟動子區(qū)域ACE元件上，調(diào)控這些基因的表達(dá)[12]。此外，HY5基因還調(diào)控類胡蘿卜素合成基因及葉綠素合成基因、、的表達(dá)[29]。為了探索基因在紅花色素合成調(diào)控中的作用，本實(shí)驗(yàn)對基因在2個(gè)不同花色紅花品系的不同組織、花發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明基因在紅花管狀花中表達(dá)量比其它組織部位都高，并且隨著花發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)表達(dá)量增加的趨勢，并且在管狀花為白色的紅花品系中的表達(dá)量要明顯高于管狀花花為紅色紅花品系中，這說明CtHY5可能參與了紅花花色素的合成或積累調(diào)控過程，但其調(diào)控機(jī)制可能不同于其它植物，這為后續(xù)CtHY5調(diào)控紅花花色素的機(jī)制提供了思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and expression analysis of, a key gene involved in light signaling pathway in

TAN Zheng-wei, LU Dan-dan, LI Lei, YU Yong-liang, XU Lan-jie, YANG Hong-qi, YANG Qing, DONG Wei, LI Chun-ming, AN Su-fang, LU Hai-ling, LIANG Hui-zhen

Henan Sesame Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China

HY5 (ELONGATED HYPOCOTYL5) is a key transcription factor in light signaling pathway. In this study, thegene was cloned from, and the bioinformatics and expression profile analysis ofwere performed with bioinformatics and quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) methods to provide a reference for the functional study of thegene.Based on the transcription data of safflower, primers were designed and the full-length cDNA ofwere cloned from safflower to obtain DNA sequences. The characteristics of physiochemical properties, structures and function of the deduced CtHY5protein were determined using a series of bioinformatics tools. The expression ofin different tissues and flower development stages of safflower was detected by fluorescence quantitative PCR.The full length cDNA sequence ofgene was 462 bp, encoding 153 amino acids, while the full length DNA sequences ofgene were 1 941 bp, containing four exons and three introns. Bioinformatics analysis showed that CtHY5 was hydrophilic protein and was located in the nucleus. Phylogenetic tree and motif structure analysis revealed that CtHY5 was more closely related to HY5 homologous protein in,,,and, which all of them belonged to Asteraceae. The results of qRT-PCR analysis showed that the expression ofgene was the highest in the flowers, followed by stems and bracts, and the lowest in roots. And the expression ofgene in all tissues of safflower was significantly higher in white safflower line than that in red safflower line.CtHY5, the key transcription factor of light signaling pathway, was first isolated from safflower in this study. The expression pattern ofin different lines of safflower was studied, which laid a foundation for further study on its biological function.

L.; light signaling pathway; HY5; gene clone; expression analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2022)18 - 5825 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.026

2022-02-11

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-21）；河南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)自由探索類項(xiàng)目（YDZX20214100001804）；河南省農(nóng)科院新興學(xué)科發(fā)展專項(xiàng)（2022XK03）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102110379、222102110466）；河南省農(nóng)科院自主創(chuàng)新專項(xiàng)基金（2022ZC64）

譚政委（1983—），男，助理研究員，從事分子生藥學(xué)研究。Tel: (0371)65738565 E-mail: zhwtan@126.com

梁慧珍（1968—），女，研究員，從事藥用植物遺傳育種及品質(zhì)改良工作。Tel: (0371)65751589 E-mail: lhzh66666@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]