植韻詩(shī)，李晨陽(yáng)，陳 鐵*

基于E2F5研究強(qiáng)心苷類化合物21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

植韻詩(shī)1, 2，李晨陽(yáng)1，陳 鐵1, 2*

1. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東 深圳 518055 2. 深圳大學(xué) 廣東省天然小分子創(chuàng)新藥物工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518055

探究強(qiáng)心苷類單體化合物21-hydroxy-neriaside的抗胃癌作用及機(jī)制。采用CCK-8法考察21-hydroxy-neriaside對(duì)胃癌HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞增殖的影響；觀察21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響；考察21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞集落形成的影響；采用RNA測(cè)序探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制；采用qRT-PCR驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果；考察shRNA-E2F轉(zhuǎn)錄因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）對(duì)GT112細(xì)胞E2F5表達(dá)的影響；采用Western blotting檢測(cè)21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞E2F5、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）、細(xì)胞周期D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期E2（Cyclin E2）和剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase，cleaved PARP]蛋白表達(dá)的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)、形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)均表明21-hydroxy-neriaside具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的活性，與時(shí)間和藥物濃度呈正相關(guān)。RNA測(cè)序、qRT-PCR和shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明21-hydroxy-neriaside通過(guò)調(diào)控E2F5影響細(xì)胞周期通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明21-hydroxy-neriaside組細(xì)胞中E2F5、c-Myc、Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05、0.01、0.001），cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）。21-hydroxy-neriaside具有抗胃癌活性，能夠通過(guò)下調(diào)E2F5表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞周期通路相關(guān)蛋白，抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

21-hydroxy-neriaside；強(qiáng)心苷類化合物；胃癌細(xì)胞；E2F轉(zhuǎn)錄因子5；細(xì)胞凋亡

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年報(bào)道，胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別占所有腫瘤發(fā)病率和死亡率的第5位和第4位[1]。胃癌具有發(fā)病率高、預(yù)后差、細(xì)胞和分子異質(zhì)性等特點(diǎn)，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[2]。我國(guó)屬于胃癌的高發(fā)區(qū)，胃癌患病率和死亡率超過(guò)世界平均水平的2倍，故胃癌是我國(guó)癌癥研究和防治的重點(diǎn)[3]。

當(dāng)前我國(guó)對(duì)于胃癌的治療主要為手術(shù)切除和化療[4]，但對(duì)于中晚期胃癌，化療發(fā)揮更為重要的作用。因此，發(fā)現(xiàn)新型、高效且低毒的化療藥物用以延長(zhǎng)晚期胃癌患者的生存期、提高患者的生存質(zhì)量和減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)勢(shì)在必行。長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等新型化療藥物均直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物，具有較好的抗腫瘤作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，天然來(lái)源的強(qiáng)心苷類化合物具有一定的抗癌作用，能夠抑制惡性細(xì)胞增殖[5]，使乳腺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[6-10]。21-hydroxy-neriaside（圖1）是從夾竹桃L.葉中提取的強(qiáng)心苷類單體化合物，外觀為白色無(wú)定形粉末，其分子式為C30H46O8，相對(duì)分子質(zhì)量為534.68。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，21-hydroxy-neriaside抗癌活性強(qiáng)，具有良好的藥物研究和臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。目前尚未有關(guān)于21-hydroxy-neriaside在抗胃癌方面的報(bào)道。本研究采用CCK-8法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、RNA測(cè)序、qRT-PCR、shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染和Western blotting技術(shù)，初步探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，進(jìn)一步明確強(qiáng)心苷類化合物的抗癌機(jī)制，為強(qiáng)心苷類化合物抗腫瘤的深入研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

胃癌HGC27、MGC803細(xì)胞購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；原位胃癌GT0603、GT112細(xì)胞由本課題組分離培養(yǎng)[12]。

圖1 21-hydroxy-neriaside的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 藥品與試劑

21-hydroxy-neriaside（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%）為天津中醫(yī)藥大學(xué)姜苗苗教授惠贈(zèng)；胎牛血清（批號(hào)2176404）、PBS（批號(hào)8120015）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰酶（批號(hào)J210006）、青鏈霉素（批號(hào)J210031）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AG29871451）購(gòu)自上海HyClone公司；發(fā)光A液和B液（批號(hào)1735602）購(gòu)自美國(guó)Millpore公司；蛋白酶抑制劑（批號(hào)HY-K0010）、磷酸酶抑制劑（批號(hào)HY-K0021）、Marker（批號(hào)01022134）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8凋亡試劑盒（批號(hào)BJ05203090）購(gòu)自北京Bioss公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)SHBH2446V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PVDF膜（批號(hào)R7KA8936A）購(gòu)自美國(guó)Immobilon-PSQ公司；E2F轉(zhuǎn)錄因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）抗體（批號(hào)9）、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）抗體（批號(hào)12）、細(xì)胞周期E2（Cyclin E2）抗體（批號(hào)7）、細(xì)胞周期D1（Cyclin D1）抗體（批號(hào)4）、剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase，cleaved PARP]抗體（批號(hào)15）、β-actin抗體（批號(hào)32）、脫脂奶粉（批號(hào)17）、HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)24）、HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（批號(hào)31）購(gòu)自美國(guó)CST公司；RNA提取試劑盒（批號(hào)DP315-R）購(gòu)自北京天根生化科技公司；熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)RR820A）購(gòu)自大連寶生物工程公司；RIPA細(xì)胞裂解液（批號(hào)MAO152-Jan-18H）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑盒（批號(hào)251808）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 儀器

AC2-4S8-NS型二級(jí)生物安全柜、371型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000c型超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；AXIO-Axiocam 503 color型倒置顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）；6000 EXP TOUCH型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器公司）；EPOCH2NS型吸收光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳儀、T100型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞用含100 U/mL雙抗（青霉素和鏈霉素）、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞，消化離心后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。分別加入終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積DMSO。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1～2 h后取出，振蕩1 min后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，分別加入終濃度為8、16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄。

2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為500個(gè)/mL，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液至12孔板中，培養(yǎng)48 h后，分別加入終濃度為16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對(duì)照組加入等體積DMSO。培養(yǎng)48 h后更換為新鮮預(yù)溫不含藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后棄去培養(yǎng)基，每孔用PBS清洗2次后，無(wú)水甲醇固定15 min，棄無(wú)水甲醇，每孔加入0.5 mL結(jié)晶紫染液染色20 min，洗凈多余染料后室溫干燥并拍照。計(jì)數(shù)每孔中染色的集落數(shù)，以DMSO處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照，計(jì)算腫瘤細(xì)胞集落形成抑制率。

集落形成抑制率＝(對(duì)照組集落數(shù)－給藥組集落數(shù))/對(duì)照組集落數(shù)

2.5 RNA測(cè)序

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.25×105個(gè)/mL，加入4 mL細(xì)胞懸液至6 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。加入終濃度為16 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對(duì)照組加入等體積DMSO。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL的TRIzol試劑，反復(fù)吹打均勻后轉(zhuǎn)移EP管中，對(duì)提取的RNA樣本進(jìn)行Illumina建庫(kù)測(cè)序后，得到原始數(shù)據(jù)及clean-reads，將原始基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用R語(yǔ)言包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.6 cDNA合成及qRT-PCR驗(yàn)證

“2.5”項(xiàng)下提取出的總RNA滿足質(zhì)檢條件后，根據(jù)常規(guī)反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合液置于PCR儀中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取足夠?qū)嶒?yàn)使用體積的對(duì)照組及給藥組cDNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配制PCR反應(yīng)液（β-actin作為內(nèi)參），根據(jù)差異基因上下調(diào)表達(dá)情況選擇候選基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用2?ΔΔCt方法計(jì)算趨勢(shì)表達(dá)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次。通過(guò)Primer Bank查詢引物序列并合成引物（表1）。

2.7 shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，取2 mL細(xì)胞懸液接種到6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，對(duì)其進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染（shRNA-序列為GGAGGTACCCATTCCAGAAAT）。轉(zhuǎn)染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察E2F5表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’)大小/bp E2F5F: TTCAGCAGGATCTATTAGTGGAG191 R: AGATAACAGTCCCAAGTTTCCAT191 β-actinF: TGTCACCAACTGGGACGATA165 R: GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA165

2.8 Western blotting檢測(cè)E2F5、c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2和cleaved PARP蛋白表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.25×105個(gè)/mL，加入4 mL細(xì)胞懸液至6 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為16 μmol/L的21-hydroxy-neriaside，對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入6×Loading buffer，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h；分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，顯影。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 9、Image J和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，隨著21-hydroxy-neriaside濃度的增加，其對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞存活率的抑制作用逐漸增強(qiáng)。如表2所示，隨著作用時(shí)間的積累，21-hydroxy-neriaside對(duì)GT0603和MGC803細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）呈下降趨勢(shì)，藥物的抑制作用增強(qiáng)；而21-hydroxy-neriaside對(duì)GT112和HGC27細(xì)胞的IC50在藥物處理72 h后略微上升，但仍低于藥物處理24 h的IC50，說(shuō)明21-hydroxy-neriaside對(duì)其增殖有一定的抑制作用。21-hydroxy-neriaside對(duì)GT112、GT0603和HGC27細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)，故以上述3個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)21-hydroxy-neriaside的濃度設(shè)置為16、20 μmol/L，處理時(shí)間為48 h。

3.2 21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3所示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，伸展性良好，細(xì)胞間排列緊密，形狀基本上是不規(guī)則的多邊形（MGC803細(xì)胞則相對(duì)規(guī)則），胞體飽滿，漂浮細(xì)胞較少；各給藥組細(xì)胞隨藥物濃度增加，細(xì)胞的增殖速度減慢，胞間的縫隙明顯變大，胞體逐漸萎縮變圓，從培養(yǎng)皿脫落并漂浮于培養(yǎng)基表面，體積和密度顯著降低而失去正常細(xì)胞形態(tài)。21-hydroxy-neriaside對(duì)4種胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，其結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)基本相符。

3.3 21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞集落形成的影響

胃癌細(xì)胞經(jīng)16、20 μmol/L的21-hydroxy-neriaside處理48 h后，觀察細(xì)胞克隆數(shù)目和克隆體積大小，如圖4所示，各給藥組細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少（＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明21- hydroxy-neriaside對(duì)3種胃癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。

圖2 21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

表2 各細(xì)胞系在21-hydroxy-neriaside處理下不同時(shí)間點(diǎn)的IC50

Table 2 IC50 of each cell line at different time points under the treatment of 21-hydroxy-neriaside

細(xì)胞系t/hIC50/(μmol·L?1)細(xì)胞系t/hIC50/(μmol·L?1) GT112細(xì)胞2417.38±0.01MGC803細(xì)胞2434.06±0.02 4813.93±0.01 4824.59±0.01 7216.64±0.01 7222.44±0.01 GT0603細(xì)胞2413.53±0.01HGC27細(xì)胞2431.34±0.04 4812.07±0.01 487.60±0.02 7211.50±0.01 729.40±0.02

圖3 21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、MGC803、GT0603和GT112細(xì)胞形態(tài)的影響

3.4 RNA測(cè)序探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制

如圖5所示，對(duì)GT112、GT0606、HGC27細(xì)胞的給藥組和對(duì)照組進(jìn)行差異分析，分別篩選出483、825、361個(gè)基因，3個(gè)細(xì)胞的共有差異基因?yàn)?4個(gè)。

經(jīng)過(guò)篩查44個(gè)差異基因發(fā)現(xiàn)，3個(gè)胃癌細(xì)胞株的共同下調(diào)基因有36個(gè)，共同上調(diào)基因有1個(gè)。為了探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌細(xì)胞增殖所涉及到的細(xì)胞通路調(diào)控過(guò)程，對(duì)上述44個(gè)共有差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，將相關(guān)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（圖6），在20條差異基因富集的通路中，富集顯著的通路有細(xì)胞周期、-谷氨酰胺和-谷氨酸代謝、細(xì)胞衰老、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等。其中，細(xì)胞周期通路中有4個(gè)重要差異基因［、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，）、細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合物亞基13（anaphase promoting complex subunit 13，）、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白4（hyaluronan binding protein 4，）]在表達(dá)量上發(fā)生了顯著變化。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

圖5 21-hydroxy-neriaside處理后HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞的差異基因Venn圖

3.5 qRT-PCR驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果

根據(jù)RNA測(cè)序的結(jié)果，4個(gè)重要差異基因中只有、、基因共同下調(diào)。和下調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)；而下調(diào)抑制癌細(xì)胞增殖，據(jù)此本研究選擇作為研究對(duì)象，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)重要差異基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證21-hydroxy-neriaside調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。如圖7所示，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞中基因表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01、0.001），與RNA測(cè)序結(jié)果一致。

3.6 shRNA-E2F5對(duì)GT112細(xì)胞E2F5表達(dá)的影響

如圖8所示，shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染效率大于95%，且成功轉(zhuǎn)染E2F5后，細(xì)胞中E2F5蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.001），能夠抑制癌細(xì)胞增殖，達(dá)到殺傷胃癌細(xì)胞的作用。

3.7 Western blotting檢測(cè)21-hydroxy-neriaside對(duì)HGC27、GT0603和GT112細(xì)胞E2F5、c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2和cleaved PARP蛋白表達(dá)的影響

KEGG分析顯著富集的通路有細(xì)胞周期，細(xì)胞周期信號(hào)通路中、、為E2F5的下游基因。如圖9所示，與對(duì)照組比較，給藥組c-Myc、Cyclin D1、Cyclin E2、E2F5的蛋白表達(dá)水平均明顯下降（＜0.05、0.01、0.001），cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）。表明21-hydroxy-neriaside通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

A-免疫熒光檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后GT112細(xì)胞中E2F5蛋白表達(dá) B-Western blotting檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后GT112細(xì)胞中E2F5蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較：***P＜0.001

4 討論

當(dāng)前胃癌的發(fā)病率仍然偏高，且病死率一直居高不下。近年來(lái)，化療藥取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，然而在胃癌治療中，化療藥選擇有限，而且在長(zhǎng)期的藥物治療中，還存在細(xì)胞耐藥性的問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)潛在有效的抗腫瘤藥物并明確其抗腫瘤機(jī)制將有效改善目前胃癌治療的困境。本研究通過(guò)CCK-8法、形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)21-hydroxy-neriaside的體外抗腫瘤作用。RNA測(cè)序表明，細(xì)胞周期通路上有4個(gè)重要差異基因（、、、）的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，然而，只有、、基因明顯下調(diào)。

E2F5是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，其結(jié)合位點(diǎn)存在于許多基因的啟動(dòng)子中，其下游轉(zhuǎn)錄基因與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，能夠調(diào)控細(xì)胞周期。研究表明，在前列腺腫瘤細(xì)胞和肝腫瘤細(xì)胞中，E2F5的表達(dá)上調(diào)[13-14]。CDKN1A是一種抑癌基因，參與由DNA損傷引起的p53/TP53介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，并抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）活性，從而阻斷關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期。在胃癌細(xì)胞中，CDKN1A表達(dá)水平較低[15]。ANAPC13是細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C）的組成部分，同時(shí)也是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的E3泛素連接酶（E3 ubiquitin ligase mind bomb 2，MIB2），可以控制有絲分裂和調(diào)控細(xì)胞周期G1期。APC/C復(fù)合物主要通過(guò)細(xì)胞分裂周期蛋白20（cell division cycle 20，CDC20）和E-鈣黏蛋白基因來(lái)協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期，二者的失調(diào)會(huì)引起細(xì)胞染色體的異常變化或癌癥的發(fā)生[16-17]。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

CDKN1A和ANAPC13的正常表達(dá)不利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其表達(dá)下調(diào)則利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)；而E2F5的正常表達(dá)利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其表達(dá)下調(diào)則可抑制癌細(xì)胞的增殖。qRT-PCR和shRNA-E2F5慢病毒轉(zhuǎn)染表實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，胃癌細(xì)胞E2F5表達(dá)下調(diào)，與RNA測(cè)序的結(jié)果一致，可以證明RNA測(cè)序結(jié)果的正確性。研究表明，c-Myc為E2F5調(diào)控的下游蛋白，Cyclin E2、Cyclin D1為c-Myc調(diào)控的下游蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞增殖[18-21]。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)21-hydroxy-neriaside處理后，GT112、GT0603和HGC27細(xì)胞中c-Myc、Cyclin E2和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，與RNA測(cè)序結(jié)果一致；cleaved PARP蛋白表達(dá)水平升高，表明21-hydroxy-neriaside可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上，21-hydroxy-neriaside可能通過(guò)調(diào)控E2F5來(lái)影響細(xì)胞周期通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanisms of cardiac glycoside monomeric compound 21-hydroxy-neriaside on inhibiting proliferation of gastric cancer cells based on E2F5

ZHI Yun-shi1, 2, LI Chen-yang1, CHEN Tie1, 2

1. School of Pharmaceutical Sciences, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518055, China 2. Guangdong Natural Small Molecule Innovative Drug Engineering Technology Research Center, Shenzhen University, Shenzhen 518055, China

To explore anti-tumor effect and mechanisms of cardiac glycoside monomeric compound 21-hydroxy-neriaside against gastric cancer.The effect of 21-hydroxy-neriaside on proliferation of gastric cancer HGC27, MGC803, GT0603 and GT112 cells was investigated by CCK-8 method; The effect of 21-hydroxy-neriaside on morphology of HGC27, MGC803, GT0603 and GT112 cells was observed; The effect of 21-hydroxy-neriaside on colony formation of HGC27, GT0603 and GT112 cells was observed; RNA sequencing was used to explore the possible mechanism of 21-hydroxy-neriaside inhibiting gastric cancer cell proliferation; qRT-PCR was used to verify RNA sequencing results; The effect of shRNA-E2F transcription factor 5 (E2F5) on E2F5 expression of GT112 cells was investigated; Western blotting was used to detect the effect of 21-hydroxy-neriaside on E2F5, cellular-myelocytomatosis viral oncogene (c-Myc), cell cycle D1 (Cyclin D1), cell cycle E2 (Cyclin E2) and cleaved poly(ADP-ribose) polymerase (cleaved PARP) protein expressions in HGC27, GT0603 and GT112 cells.CCK-8 assay, morphological observation and cell clone formation assay showed that 21-hydroxy-neriaside had the activity of inhibiting the proliferation of gastric cancer cells, which was positively correlated with time and drug concentration. RNA sequencing, qRT-PCR and shRNA-E2F5 lentiviral transfection experiments showed that 21-hydroxy-neriaside affected cell cycle pathways by regulating E2F5, thereby inhibiting tumor cell growth. The results of Western blotting showed that the protein expression levels of E2F5, c-Myc, Cyclin D1 and Cyclin E2 in 21-hydroxy-neriaside group were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001), and cleaved PARP protein expression level was significantly increased (< 0.001).21-Hydroxy-neriaside has anti-gastric cancer activity. It can affect cell cycle pathway-related proteins by down-regulating E2F5 expression, inhibit the growth of gastric cancer cells, and promote tumor cell apoptosis.

21-hydroxy-neriaside; cardiac glycoside; gastric tumor cells; E2F transcription factor 5; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5712 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.014

2022-05-23

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目（B2020031）

植韻詩(shī)（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲赴┧幚韺W(xué)。E-mail: 2070245062@email.szu.edu.cn

陳 鐵，男，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橄滥[瘤干細(xì)胞的靶向治療和腫瘤藥理。E-mail: tiechen@szu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]