劉勇 陸婉秋

哮喘是常見的慢性氣道疾病，其臨床表現(xiàn)主要為反復喘息、咳嗽、氣促和胸悶，通常在夜間和（或）凌晨發(fā)作或加劇。哮喘嚴重影響患兒健康，并給社會帶來沉重的負擔，以及對家庭和主要照顧者都有一定程度的負面影響。目前大多認為哮喘是一種由免疫、遺傳、環(huán)境等因素導致的多因素疾病，其遺傳與多個基因位點有關。研究者報道，IL-13 基因R110Q（IL-13 R110Q）、IL-4 基因-590C>T（IL-4-590C>T）、β腎上腺素能受體基因R16G（ADRB2 R16G）、IgE 高親和力受體β 鏈基因E237G（FcER1B E237G）組成的四位點模型是哮喘易感基因的最佳預測模型。單核苷酸多態(tài)性與藥物治療關系密切，并且與哮喘的易感性及其嚴重程度有關。劉艷琳等研究顯示，實現(xiàn)哮喘個體化治療需要以藥物基因檢測作為方向，然而，目前國內相關臨床數(shù)據(jù)有限，仍然需要大樣本研究來獲取更可靠的臨床數(shù)據(jù)。本研究主要分析了198 例兒童哮喘4 種相關基因（IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G）的多態(tài)性，描述哮喘兒童的遺傳特征，觀察并分析了哮喘相關藥物基因檢測結果指導哮喘患兒個體化治療后的臨床療效，進而為哮喘患兒的個體化治療提供臨床數(shù)據(jù)支持。

對象與方法

一、研究對象

選取2019 年7 月到2021 年9 月在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科門診確診的396 例非急性發(fā)作期輕-中度哮喘兒童作為研究對象。干預組198例，行四基因位點的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測；對照組198 例，未行四基因位點的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測。入組標準：①非急性發(fā)作期的輕-中度哮喘兒童，哮喘的診斷及分級標準參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》；②初診支氣管哮喘且未規(guī)范治療；③貴州省內本地居民。排除標準：合并引起咳嗽、喘息為主要癥狀的其他疾病，包括支氣管異物、肺結核、先天性心臟病、先天性呼吸系統(tǒng)畸形、支氣管狹窄、胃食管反流病、先天性免疫缺陷病等。此研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準［批件號：2021 倫審第（155）號］，所有患兒的監(jiān)護人均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 干預組DNA 的提取

干預組行四基因位點的多態(tài)性及哮喘藥物基因檢測。收集患兒口腔雙側內腮頰黏膜拭子，并置于專用離心管，?20 ℃冰箱保存，送至上海解碼醫(yī)學檢驗所，應用天根口腔拭子基因組DNA 提取試劑盒（美國Agena Bioscience 公司），按試劑盒說明書步驟提取DNA。

2. 基因多態(tài)性分析

將提取的DNA 樣本經(jīng)過PCR、擴增、純化、引物延伸、純化、點樣等步驟，最后運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS） 對IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 4 個哮喘易感基因位點的單核苷酸多態(tài)性（SNP）進行基因分型。其中IL-13 R110Q位點有3 種基因型，分別為AA、AG、GG；IL-4-590C > T 位點有3 種基因型，分別為TT、CT、CC；ADRB2 R16G 位點有3 種基因型，分別為AA、AG、GG；FcER1B E237G 位點有3 種基因型，分別為AA、AG、GG。將4 個基因位點均不攜帶風險等位基因純合子者定義為哮喘基因檢測陰性，任一基因位點攜帶風險等位基因純合子者定義為哮喘基因檢測陽性。

3. 藥物基因檢測

對常見的三大類支氣管哮喘控制藥物基因［包括糖皮質激素誘導轉錄因子1（GLCCI1）基因 rs37973、低親和力IgE 受體（FcER2）基因rs28364072、促腎上腺皮質激素釋放激素受體1（CRHR1）基因 rs242941、細胞色素氧化酶P450 3A5（CYP3A5）基因 rs776746、ADRB2 基因rs1042713、ⅩⅩⅡ型α1 鏈膠原（COL22A1）基因rs6988229、CRHR2 基因 rs7793837、腺苷酸環(huán)化酶9（ADCY9）基因 rs2230739、白三烯C4 合成酶（LTC4S） 基因 rs730012、5-脂氧化酶（ALOX5）基因 rs2115819］進行治療反應檢測，最終得到個體化用藥提示結果，并分為療效較好、療效欠佳2 類。

4. 治療方法

干預組與對照組的吸入性糖皮質激素（ICS）治療方案均按照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》執(zhí)行，在治療隨訪期間根據(jù)患兒病情適當加用硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑。個體化治療方案中的藥物包括3 大類：①糖皮質激素（激素），如丙酸氟替卡松、布地奈德、二丙酸倍氯米松；②β受體激動劑，如沙美特羅、福莫特羅、沙丁胺醇；③白三烯調節(jié)劑，如孟魯司特。干預組根據(jù)哮喘藥物基因檢測的結果選擇上述療效較好的ICS 治療。其中經(jīng)丙酸氟替卡松吸入氣霧劑治療90 例、布地奈德治療60 例、二丙酸倍氯米松治療48 例。對照組使用的激素類型同干預組，其中丙酸氟替卡松吸入氣霧劑治療90 例、布地奈德治療60 例、二丙酸倍氯米松治療48 例。藥物用量與用法：丙酸氟替卡松吸入氣霧劑1 撳/次，早晚各1 次；吸入用布地奈德混懸液1 mg/次，早晚各1 次；丙酸倍氯米松吸入氣霧劑2 撳/次，早晚各1 次。

5. 觀察指標

根據(jù)患兒的年齡選擇以下相應的哮喘控制評估工具對個體化治療后的療效進行評價：①哮喘控制測試（ACT）評分，適用于≥12 歲的患兒，評分范圍5～25 分，≤19 分為控制不佳，20～24 分為良好控制，25 分為完全控制。②兒童哮喘控制測試（C-ACT）評分，適用于4～11 歲的患兒，評分范圍5～27 分，24～27 分為哮喘完全控制，20～23分為哮喘部分控制，≤19 分為哮喘未控制。③兒童呼吸和哮喘控制測試（TRACK）評分，適用于≤5 歲的患兒，< 80 分為控制不佳，≥80 分為哮喘控制?？紤]本研究中C-ACT 與TRACK 兩個評分工具有年齡重疊，故統(tǒng)一年齡 ≤5 歲的患兒采用TRACK評分進行評價，年齡6～11 歲的患兒以C-ACT 進行評價。分別于入組時、治療1 個月、治療3 個月對患兒進行問卷評分。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、干預組與對照組患兒的性別構成和年齡比較

干預組198 例患兒中，男133 例、女65 例，年齡（4.4±2.7）歲。對照組198 例患兒中，男128例、女70 例，年齡（4.6±2.8）歲。2 組患兒的性別構成、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（P 均>0.05）。

二、干預組患兒哮喘相關基因多態(tài)性分析

干預組患兒IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 基因型的頻數(shù)和頻率見表1，IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 等位基因的頻數(shù)和頻率見表2。IL-13 R110Q 基因實際頻數(shù)與預期頻數(shù)對比=0.068，P = 0.794；IL-4-590C>T 基因實際頻數(shù)與預期頻數(shù)對比=2.462，P = 0.117；ADRB2 R16G 基因實際頻數(shù)與預期頻數(shù)對比= 5.760，P = 0.016；FcER1B E237G 基因實際頻數(shù)與預期頻數(shù)對比=0.967，P = 0.325，位點分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。IL-13 R110Q 位點風險基因型GG、IL-4-590C>T 位點風險基因型TT、ADRB2 R16G 位點風險基因型AA 的比例較高，而FcER1B E237G 位點的風險基因型GG 比例最低。經(jīng)哮喘基因檢測結果提示，陽性134 例、占67.7%，陰性64 例、占32.3%。

表1 干預組198 例哮喘患兒IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 基因型頻數(shù)及頻率

表2 干預組198 例哮喘患兒IL-13、IL-4、ADRB2、FcER1B 等位基因頻數(shù)及頻率

三、干預組與對照組的療效分析

入組時，2 組ACT、C-ACT 和TRACK 評分比較差異均無統(tǒng)計學意義（P 均> 0.05）。治療1 個月后，干預組C-ACT、TRACK 評分均優(yōu)于對照組（P 均> 0.05）；治療3 個月后，干預組的哮喘控制評分均優(yōu)于對照組（P 均< 0.05），見表3。

表3 ICS 治療前后干預組與對照組的哮喘控制評分比較（x±s） 單位：分

討 論

兒童哮喘的患病率呈逐年上升趨勢。越來越多的研究顯示，哮喘的發(fā)病機制是多種基因、免疫和環(huán)境因素共同作用的結果。近年來，國內外許多學者對哮喘相關基因進行了大量的研究，尤其是隨著全基因組關聯(lián)研究的廣泛開展，迄今已發(fā)現(xiàn)近1000 個哮喘候選基因。我國鮑一笑教授團隊通過大量研究發(fā)現(xiàn)，由IL-13 R110Q、IL-4-590C>T、ADRB2 R16G、FcER1B E237G 組成的4位點模型是最佳的兒童哮喘易感基因預測模型，并且該模型與哮喘預測指數(shù)和特應性相關，推測其可作為預測學齡前喘息兒童未來是否會發(fā)展為哮喘的有力工具，該團隊提出基因多態(tài)性對藥物治療反應差異的影響是未來個體化藥物治療的一個主要研究方向。

1 型輔助性T 淋巴細胞（Th1）/ Th2 失衡是哮喘主要的免疫發(fā)病機制，Th2 產(chǎn)生的IL-13 和IL-4 起了重要的作用。多項研究表明，IL-4 基因和IL-13 基因與兒童哮喘密切相關，曹華等研究顯示，導致兒童哮喘的主要因素是IL-4 基因和IL-13基因之間的相互作用。舒磊等研究報道，IL-13 rs20541（即 R110Q）SNP 與哮喘患兒的發(fā)病呈強相關。廖興娟等報道，IL-4-590C/T 位點的多態(tài)性可能與貴陽地區(qū)的兒童哮喘有關。

目前，對ADRB2 基因的研究主要集中在編碼區(qū)第16 和第27 位的多態(tài)性，但是各種報道的結果并不完全一致。馮媛元等的研究表明，ADRB2基因的rs1042713 位點，即ADRB2 R16G 多態(tài)性，不僅與兒童哮喘的易感性有關，而且在一定程度上影響哮喘患兒對治療的反應。 但陳更業(yè)等研究表明，β-2AR 基因16 位點基因多態(tài)性和中國漢族兒童哮喘易感性無關。一項關于沙特阿拉伯哮喘人群的研究亦報道ADRB2 基因SNP 與哮喘無關。上述研究顯示ADRB2 基因SNP 分布不一致的原因可能是不同地域和環(huán)境存在差異。

FcER1B 主要參與IgE 介導的Ⅰ型超敏反應，使肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放炎癥介質和分泌細胞因子。郭素華等研究報道，兒童喘息的發(fā)病和FcER1β 基因多態(tài)性有關，風險型基因不僅是喘息的危險因素，而且影響喘息發(fā)作的嚴重程度，但并非哮喘的主導因素。劉婷等研究顯示，哮喘、特應性與E237G 基因突變可能無關。

隨著我國兒童哮喘相關標準與指南的推出并不斷更新，大部分兒童哮喘得到有效控制，但仍有部分哮喘患兒難以控制，隨著藥物基因組學的開展，這為兒童哮喘個體化治療提供了方向。多項研究利用基因檢測臨床指導哮喘患兒的個體化治療，均取得一定的成效。

本研究顯示，IL-13 R110Q 位點風險基因型GG、IL-4-590C/T 位 點 風 險 基 因 型TT、ADRB2 R16G 位點風險基因型AA 的比例較高，而FcER1B E237G 位點的風險基因型GG 比例最低，是否表明FcER1B 基因不是本地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的因素，這仍需要大樣本數(shù)據(jù)的支持。另有研究顯示，哮喘患兒哮喘基因檢測陽性者占67.7%，在臨床工作中哮喘基因檢測可考慮作為預測哮喘風險的檢查之一。本研究同時通過哮喘藥物基因檢測結果為患兒制定ICS 個體化治療方案后，治療后3 個月干預組患兒的哮喘控制評分均優(yōu)于對照組，這為本地區(qū)兒童哮喘的精準治療提供了一定的臨床數(shù)據(jù)支持。然而，目前尚缺乏利用藥物基因組學指導兒童哮喘治療的大樣本研究，期望未來開展更多人群、更多位點的研究，最終實現(xiàn)兒童哮喘精準醫(yī)療的目的。