徐 琪，潘 芬，孫 燕，石迎迎，于方圓，張 泓

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200062）

近年來(lái)，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）在世界范圍內(nèi)廣泛播散，臨床分離率逐年上升，成為公眾健康的一大威脅[1]。腸桿菌科細(xì)菌主要存在于人體的腸道，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道定植CRE是導(dǎo)致腸道感染或繼發(fā)機(jī)體其他部位感染的重要危險(xiǎn)因素[2]，且相較于院內(nèi)傳播，更多感染發(fā)生于既往腸道定植陽(yáng)性的患者中[3]。因此，對(duì)入院患者實(shí)施主動(dòng)篩查顯得尤為重要。主動(dòng)篩查對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)腸道定植CRE具有重要意義，對(duì)篩查陽(yáng)性的患者及早干預(yù)，不僅可以有效控制CRE在醫(yī)院范圍內(nèi)的流行和播散，還可以縮短患者住院時(shí)間，降低臨床病死率[4]。主動(dòng)篩查配合患者合理安置和接觸隔離，已被證實(shí)可以明顯減少兒童患者CRE的感染與定植[5]。

目前，國(guó)際上采用的CRE主動(dòng)篩查的方法較多，主要包括美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦方案、各種商品化顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法、含碳青霉烯類抗菌藥物的篩選法和分子檢測(cè)技術(shù)。臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)糞便樣本中的CRE主要面臨三大挑戰(zhàn)：快速檢測(cè)、低碳青霉烯類耐藥菌株的檢測(cè)和低水平CRE的檢測(cè)[6]。感染控制的成效體現(xiàn)在對(duì)CRE檢測(cè)陽(yáng)性的患者早期進(jìn)行接觸隔離，這就要求盡早檢出CRE，并及時(shí)采取措施。因此，一個(gè)良好的篩查試驗(yàn)必須盡量減少周轉(zhuǎn)時(shí)間，最大限度地提高靈敏度，保持合理的特異性。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦采用肉湯法，但這一方法僅可用于乳糖發(fā)酵的腸桿菌科細(xì)菌的篩查，且操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)（約4 d）；商品化顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法較肉湯法好，但不同流行地區(qū)性能評(píng)價(jià)差異較大、成本高，且尚未獲批用于臨床；含碳青霉烯類抗菌藥物的篩查方法存在暫無(wú)最佳藥物種類、濃度及抑菌圈大小統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的弊端；分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)CRE的快速檢測(cè)具有較高的靈敏度和可靠性，且被美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦作為檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的試驗(yàn)方法之一，但是需要特殊的試劑和設(shè)備，且檢測(cè)結(jié)果依賴特異性靶基因，若待測(cè)基因與目標(biāo)基因不同，會(huì)導(dǎo)致假陰性。本研究從臨床應(yīng)用的可行性和可靠性出發(fā)，以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法為參考方法，評(píng)價(jià)使用含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂平板（藥物篩選法）和粘貼10 μg美羅培南紙片的麥康凱瓊脂平板（紙片篩選法）對(duì)臨床糞便樣本進(jìn)行CRE篩查的效能，以期為臨床實(shí)驗(yàn)室選用合適的技術(shù)篩查CRE提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年7月—2020年3月上海市兒童醫(yī)院臨床送檢主動(dòng)篩查CRE的住院患兒糞便樣本306例。

1.2 儀器和試劑

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Bruker公司），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），麥康凱瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司），10 μg美羅培南紙片（英國(guó)OXIOD公司），麥康凱瓊脂干粉和美羅培南藥粉（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），一次性培養(yǎng)皿（浙江柏美特醫(yī)用塑料有限公司），2×Hieff PCR Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司），D2000 DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922，購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心）和經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序證實(shí)為產(chǎn)NDM-5的產(chǎn)氣腸桿菌。

1.3 方法

1.3.1 PCR法 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，參考文獻(xiàn)[7-11]設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增8種我國(guó)常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM、blaGIM、blaDIM、blaAIM），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳出現(xiàn)陽(yáng)性條帶且通過(guò)測(cè)序確認(rèn)為碳青霉烯酶基因?yàn)楹Y查陽(yáng)性，反之則為陰性。

1.3.2 藥物篩選法 挑取3～5 g糞便樣本，分區(qū)接種于含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂平板，置于5% CO2、（35±2）℃環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。若有菌落生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)情況良好，判斷為篩查陽(yáng)性，反之則為陰性。

1.3.3 紙片篩選法 挑取3～5 g糞便樣本，分區(qū)接種于麥康凱瓊脂平板上，再將含10 μg美羅培南的紙片貼于平板一區(qū)，置于5% CO2、（35±2）℃環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，判讀標(biāo)準(zhǔn)參照2019年CLSI M100-S29文件。以抑菌圈直徑≤19 mm為篩查陽(yáng)性，＞19 mm則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例/率表示。采用Kappa檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 3種方法CRE檢測(cè)結(jié)果

306例糞便樣本中，有37例PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為12.1%（37/306），其中以產(chǎn)blaNDM-5酶的產(chǎn)氣腸桿菌為主，占35.1%（13/37）。PCR法陽(yáng)性CRE菌株碳青霉烯酶基因型分布及藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果見(jiàn)表1。有6例樣本藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果均為陽(yáng)性，但PCR法未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因。

2.2 藥物篩選法

306例糞便樣本中，有53例藥物篩選法CRE陽(yáng)性，陽(yáng)性率為17.32%（53/306）。經(jīng)培養(yǎng)分別為大腸埃希菌（15例）、產(chǎn)氣腸桿菌（13例）、肺炎克雷伯菌（12例）、陰溝腸桿菌（10例）、奇異變形桿菌（2例）和弗勞地檸檬酸桿菌（1例），其中36株為產(chǎn)酶菌株（表1），17株未檢測(cè)到酶型。藥物篩選法和PCR法一致性程度較好（Kappa值為0.77，P＜0.05），敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為97.3%、93.7%、67.9%、99.6%和94.1%。

2.3 紙片篩選法

306例糞便樣本中，有47例紙片篩選法CRE陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)15.4%（47/306）。經(jīng)培養(yǎng)分別為產(chǎn)氣腸桿菌（14例）、大腸埃希菌（12例）、肺炎克雷伯菌（9例）、陰溝腸桿菌（9例）、弗勞地檸檬酸桿菌（2例）和奇異變形桿菌（1例）。其中34株為產(chǎn)酶株（表1），13株未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶基因。紙片篩選法和PCR法CRE一致性程度較強(qiáng)（Kappa值為0.78，P＜0.05），篩查的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為91.9%、95.2%、72.3%、98.8%和94.8%。

表1 PCR法陽(yáng)性菌株碳青霉烯酶基因型分布及藥物篩選法、紙片篩選法CRE篩查結(jié)果 例

3 討論

CRE的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶或超廣譜β-內(nèi)酰胺酶合并膜孔蛋白缺失、外排泵過(guò)度表達(dá)，以及青霉素結(jié)合蛋白突變等，其中最主要的耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶，KPC-2、NDM和OXA-48樣酶是目前我國(guó)CRE臨床分離株中最為常見(jiàn)的3種碳青霉烯酶型別[12]。同樣，這3種酶型在糞便樣本分離的CRE菌株中也最為常見(jiàn)[13-14]。盡管檢測(cè)效能不一，表型檢測(cè)和分子技術(shù)均能夠識(shí)別出產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌。對(duì)感染者和攜帶者進(jìn)行篩查是預(yù)防CRE傳播的2個(gè)主要途徑。分子檢測(cè)技術(shù)可靠性強(qiáng)，且能對(duì)碳青霉烯酶分型，可有效指導(dǎo)臨床抗感染治療，但需要特殊設(shè)備，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，操作繁瑣、耗時(shí)，成本較高，不適合在基層臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。有學(xué)者指出，目前對(duì)于CRE攜帶者的篩查仍然主要依賴于篩選培養(yǎng)基[15]。本研究將臨床送檢主動(dòng)篩查CRE的糞便樣本直接接種于含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，或在樣本接種的一區(qū)粘貼10 μg美羅培南紙片，結(jié)果顯示，藥物篩選法篩查CRE的敏感性和特異性分別為97.3%和93.7%，紙片篩選法篩查CRE的敏感性、特異性分別為91.9%和95.2%，且2種方法與PCR法的一致性均較好。此外，這2種方法還具有操作簡(jiǎn)便、成本低，可較快獲得檢測(cè)結(jié)果，易于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，藥物篩選法和紙片篩選法對(duì)于產(chǎn)KPC酶腸桿菌科細(xì)菌的篩查效能均較強(qiáng)，可能與此產(chǎn)酶菌株高水平耐藥有關(guān)[16-17]，對(duì)于以產(chǎn)KPC-2酶CRE為主的醫(yī)療機(jī)構(gòu)適用性更強(qiáng)。在臨床應(yīng)用上，無(wú)論從成本、技術(shù)，還是從可行性、可靠性出發(fā)，2種含碳青霉烯類抗菌藥物的篩選法性能均優(yōu)于或至少可以與其他篩選方法相媲美，可及時(shí)有效地指導(dǎo)臨床抗感染防控工作的開(kāi)展。

另外，本研究結(jié)果顯示，將美羅培南紙片抑菌圈直徑≤19mm判定為紙片篩選法陽(yáng)性，敏感性低于藥物篩選法，可能與糞便樣本中存在大量其他病原菌或CRE菌株總量較低有關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上粘貼藥敏紙片來(lái)檢測(cè)產(chǎn)A類或B類酶的CRE時(shí)，檢測(cè)限均較其他篩選培養(yǎng)基高1～2個(gè)對(duì)數(shù)值[18-19]；也可能與指定篩選陽(yáng)性的紙片抑菌圈直徑大小有關(guān)，BLACKBURN等[20]將美羅培南抑菌圈直徑≤34 mm作為判定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)菌量在102～104CFU/mL時(shí)敏感性均≥95%。但2種篩選方法在篩查產(chǎn)金屬酶CRE上均存在一定的局限性，有學(xué)者指出，篩選培養(yǎng)基在檢測(cè)A類酶（KPC）方面表現(xiàn)良好，CRE檢測(cè)限為101～102CFU/mL，而B(niǎo)類酶的檢測(cè)限為102～103CFU/mL[6]。因此，這2種方法更適合在以產(chǎn)A類酶CRE為主的醫(yī)院推廣。本研究中，有6例樣本藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果均為陽(yáng)性，但PCR篩選法為陰性，考慮該CRE菌株可能存在其他耐藥機(jī)制，如產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶聯(lián)合膜孔蛋白缺失或突變等；還有1株產(chǎn)NDM-1+IMP-4酶的肺炎克雷伯菌，2種篩選培養(yǎng)基均顯示陰性。鑒于碳青霉烯酶及其他耐藥基因可以通過(guò)質(zhì)?；蛘献釉谀c桿菌科及非腸桿菌科菌株之間水平傳播，因此為了減少耐藥菌株的播散，仍建議將此類樣本列為CRE篩選陽(yáng)性。

本研究尚有一定的局限性，在以糞便樣本中產(chǎn)B類NDM酶為主的兒童醫(yī)院開(kāi)展，對(duì)于A類（KPC）酶的檢測(cè)結(jié)果代表性稍差。此外，還缺乏對(duì)產(chǎn)D類（OXA-48）酶CRE菌株的篩查檢測(cè)。有研究發(fā)現(xiàn)，使用基于培養(yǎng)的方法檢測(cè)產(chǎn)D類酶菌株較困難[19]，因?yàn)榇祟惥晖ǔ?duì)碳青霉烯類以及廣譜頭孢菌素類抗菌藥物有較低的最小抑菌濃度，因此主要依賴PCR技術(shù)來(lái)篩查[21]。有研究在對(duì)重癥監(jiān)護(hù)病房患者的直腸拭子采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩查產(chǎn)OXA-48酶CRE時(shí)發(fā)現(xiàn)，整體敏感性和特異性分別高達(dá)95.7%和100.0%[22]。對(duì)于OXA-48酶流行的地區(qū)（如北非國(guó)家），Supercarba培養(yǎng)基對(duì)此類產(chǎn)酶菌株表現(xiàn)出較高的敏感性（80%）和特異性（98.5%）[23]。

后續(xù)我們將開(kāi)展多中心臨床研究，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。針對(duì)紙片篩選法，在篩查臨床糞便樣本時(shí)可適當(dāng)增大抑菌圈直徑，以最大限度地提高CRE的檢出率；針對(duì)藥物篩選法，ADLER等[18]發(fā)現(xiàn)，在以色列這樣的CRE高流行地區(qū)，采用含1 μg/mL亞胺培南的麥康凱瓊脂平板是檢測(cè)CRE攜帶者最合適的方法。后續(xù)我們還將探索篩查臨床糞便樣本最適合的抑菌圈直徑，進(jìn)而評(píng)價(jià)含1 μg/mL亞胺培南的麥康凱瓊脂平板的檢測(cè)能力及臨床應(yīng)用價(jià)值。

CRE在世界范圍內(nèi)的傳播是公共衛(wèi)生安全的一個(gè)重大威脅，需要醫(yī)療機(jī)構(gòu)共同努力，確保迅速、準(zhǔn)確地檢測(cè)并實(shí)施有效的感染控制戰(zhàn)略，這是防止醫(yī)院內(nèi)多重耐藥甚至廣泛耐藥細(xì)菌感染進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。藥物篩選法和紙片篩選法均可用于糞便樣本CRE菌株的篩查，可作為臨床常規(guī)篩查CRE攜帶者的有效方法。目前國(guó)際上對(duì)CRE篩查方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此需要臨床微生物實(shí)驗(yàn)室根據(jù)當(dāng)?shù)氐腃RE流行病學(xué)、周轉(zhuǎn)時(shí)間要求，以及現(xiàn)有的資源確定最佳方法，并不斷探索完善，以最大程度提高篩查的準(zhǔn)確性，有效控制感染播散。