金丹青，顧鵬程，王玉杰，胡尚欽，汪軍成，馬小樂，司二靜，姚立蓉，李葆春

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

禾本科鵝觀草屬是小麥族中最大的屬，在抗病方面的農(nóng)藝學(xué)特性值得被關(guān)注[1-4]。偏穗鵝觀草（Roegneria komarovii（Nevski）Nevski）為鵝觀草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于我國，除新疆、青海、西藏外，分布遍及全國，多生長在海拔100～2 300 m的山坡和草地[5]。它具有較強(qiáng)的抗寒能力，對土壤要求不嚴(yán)格，抗旱、耐鹽堿，在抗病性鑒定中表現(xiàn)為抗條銹病，是小麥的二級基因源。除此之外，其粗蛋白含量高，可消化率高，是優(yōu)良的牧草，同時在涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙、調(diào)節(jié)小氣候等方面也起到了不可忽略的作用。通過體細(xì)胞雜交技術(shù)將偏穗鵝觀草的有利基因引入小麥，創(chuàng)造優(yōu)異變異材料，對于小麥抗性遺傳改良具有重要意義。良好的偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立，能夠為建立偏穗鵝觀草與小麥的原生質(zhì)體融合技術(shù)，創(chuàng)建遠(yuǎn)緣雜交后代，利用該優(yōu)良基因庫奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)的研究，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。邢莉萍等[6]以鵝觀草屬的鵝觀草為材料，利用其幼穗未成熟種子幼胚為外植體，使用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加終質(zhì)量濃度為2～5 mg/L的2，4-D，3～6 mg/L的麥草畏，0～0.5 mg/L的6-BA中的任意1種或2種，在黑暗條件下成功誘導(dǎo)出鵝觀草的愈傷組織，但試驗過程中采用的是升汞對種子進(jìn)行消毒處理，升汞屬劇毒化學(xué)品，不易處理，對環(huán)境造成傷害。關(guān)于偏穗鵝觀草無毒條件下種子消毒及其愈傷組織誘導(dǎo)的研究報道很少[7-8]，同時對于偏穗鵝觀草無菌實生苗胚軸愈傷組織的快速誘導(dǎo)及繁殖方法更是未見報道。

本研究探討無升汞處理偏穗鵝觀草種子并以其無菌苗的葉片、葉柄、胚軸為外植體，通過調(diào)整培養(yǎng)基配方來獲得偏穗鵝觀草大量優(yōu)質(zhì)的愈傷組織，調(diào)整繼代培養(yǎng)基，獲得繼代培養(yǎng)愈傷組織，以便獲取大量有活力的細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)，為下一步的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及小麥與偏穗鵝觀草原生質(zhì)體融合做準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試偏穗鵝觀草（Roegneria komarovi（iNevski）Nevski）種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲取分別采用不同體積分?jǐn)?shù)（45%、50%、55%）的濃硫酸對偏穗鵝觀草種子進(jìn)行脫皮催芽處理，配合酒精及次氯酸鈉進(jìn)行消毒，并分別設(shè)置消毒時間對消毒效果進(jìn)行比較（表1），篩選無菌苗培養(yǎng)最佳條件。發(fā)芽條件統(tǒng)一為黑暗環(huán)境，溫度28℃，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值5.8。統(tǒng)計了不同方法和處理時間對偏穗鵝觀草種子消毒效果及消毒后種子發(fā)芽率的影響，以期篩選出最適消毒條件。

表1 偏穗鵝觀草種子消毒的不同方法和處理時間設(shè)置Tab.1 Different sterilization methods and processing time of seeds of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

1.2.2 愈傷誘導(dǎo)外植體選擇分別選取無菌實生苗的葉片、葉柄和胚軸作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，分別接入培養(yǎng)基1（MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）、培養(yǎng)基2（MS+1.0 mg/L氨氯吡啶酸+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）中25～30 d，誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，每種外植體在2種培養(yǎng)基中均處理6瓶，每瓶中接入外植體4～20個，通過對愈傷組織誘導(dǎo)情況的觀察來初步篩選較優(yōu)激素組合[9-10]和外植體。

培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 500 lx，濕度70%，pH值5.8。

1.2.3 胚軸的愈傷誘導(dǎo)采用正交試驗設(shè)計9種培養(yǎng)基（表2），將長0.5～1.0 cm的無菌苗胚軸接種到培養(yǎng)基中，研究6-BA、2，4-D和NAA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂、0.1 g/L肌 醇，pH值5.8。每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)包含30個胚軸，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計胚軸的誘導(dǎo)率。根據(jù)誘導(dǎo)率篩選適合偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織的外源激素。

表2 愈傷誘導(dǎo)正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal test for callus induction

1.2.4 外源激素用量的選擇 首先根據(jù)1.2.3優(yōu)選出適合誘導(dǎo)偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織的外源激素[11-13]，在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對外源激素用量進(jìn)行優(yōu)化[14-16]，設(shè)最佳外源激素質(zhì)量濃度分別為1、5、7 mg/L等3個梯度，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂、0.1 g/L肌醇，pH值5.8。將培養(yǎng)7 d的實生苗胚軸組織接種于以上3種不同質(zhì)量濃度外源激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.5 愈傷組織的繼代培養(yǎng)挑選顏色鮮亮、質(zhì)地疏松的愈傷組織接種于誘導(dǎo)愈傷組織效果較好的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長狀況。根據(jù)第1次繼代培養(yǎng)的結(jié)果，以后每25～30 d繼代一次，每次繼代選擇增殖力較強(qiáng)的愈傷。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理，采用正交設(shè)計統(tǒng)計分析方法，對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行直觀分析，用minitab 15軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌實生苗的獲取

偏穗鵝觀草種子最適催芽和消毒方法為：種子置于50%的濃硫酸中在條件為30℃，210 r/min的搖床里振蕩1 h做脫皮催芽處理，之后用蒸餾水洗去濃硫酸并置于超凈工作臺。隨后用無菌水清洗種子，然后75%的酒精振蕩沖洗3 min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉振蕩沖洗15 min，最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得偏穗鵝觀草無菌種子（圖1）。之后用無菌濾紙吸干接入MS培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后得到無菌苗。

圖1 偏穗鵝觀草無菌實生苗Fig.1 Sterile seedlings of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.2 愈傷組織外植體選擇

利用組合培養(yǎng)基1（MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）、培養(yǎng)基2（MS+1.0 mg/L氨氯吡啶酸+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂）分別培養(yǎng)偏穗鵝觀草葉片、葉柄和胚軸。結(jié)果顯示（表3），胚軸最易誘導(dǎo)出愈傷組織，葉柄誘導(dǎo)次之，而葉片的誘導(dǎo)效果最差。2種培養(yǎng)基愈傷組織生長速度無明顯差別，以培養(yǎng)基1為例，10 d左右部分胚軸的兩端切口處開始膨大，呈淡黃色（圖2-a）；15 d后發(fā)現(xiàn)胚軸兩端不同程度膨大（圖2-b）；20 d左右發(fā)現(xiàn)胚軸在接觸培養(yǎng)基的部位有少量愈傷形成（圖2-c）；28 d后絕大部分莖段有黃綠色愈傷生成（圖2-d）。從材料來源分析，偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)是胚軸優(yōu)于葉柄、葉片，且培養(yǎng)基1比培養(yǎng)基2更容易誘導(dǎo)胚軸形成愈傷組織。

表3 不同外植體及不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)率Tab.3 Induction rates of different explants and culture mediums %

圖2 不同時期偏穗鵝觀草愈傷組織Fig.2 Callus of Roegneria komarovii Nevski）Nevski in different periods

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度對于胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的影響

2.3.1 正交試驗的極差分析 由表4可知，R2，4-D＞R6-BA＞RNAA,因素B（2，4-D）的極差最大，因素C（NAA）的極差最小。說明這3個因素對無菌苗胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響大小為：2，4-D＞6-BA＞NAA。正交表中均值越大，則說明代表該因子的水平越好。比較各因子的K值，最大值分別是：因素A的K1、因素B的K2和因素C的K3。從誘導(dǎo)率的極差分析結(jié)果可知，最優(yōu)組合為A1B2C3，即0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.6 mg/L NAA。

表4 偏穗鵝觀草胚軸愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal test of callus induction with hypocotyl from Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.3.2 正交試驗的方差分析對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以反映各因子之間的差異，結(jié)果表明（表5），因素B（2，4-D）對胚軸的影響顯著，因素A（6-BA）、C（NAA）對胚軸的誘導(dǎo)作用不顯著，此結(jié)果與極差分析的結(jié)果相符合（表4）。所以，最終確定2，4-D為本試驗中誘導(dǎo)偏穗鵝觀草愈傷組織的最佳激素。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)定2，4-D質(zhì)量濃度梯度，篩選出最優(yōu)2，4-D為5.0 mg/L。

表5 偏穗鵝觀草胚軸誘導(dǎo)的方差分析Tab.5 Variance analysis of hypocotyl induction of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

2.4 偏穗鵝觀草愈傷組織增殖培養(yǎng)

將得到的顏色黃綠、質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成直徑約0.1～0.2 cm的小塊，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)愈傷組織最佳增殖培養(yǎng)基（MS+5.0 mg/L 2，4-D+0.1 g肌醇+30 g/L蔗糖+5 g瓊脂）中，培養(yǎng)25～30 d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的誘導(dǎo)愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖，最終獲得顏色黃綠、結(jié)構(gòu)致密的優(yōu)良愈傷組織材料（圖3），將作為原生質(zhì)體培養(yǎng)的材料及其他研究材料。

圖3 偏穗鵝觀草愈傷組織的繼代培養(yǎng)Fig.3 Subculture of callus of Roegneria komarovii（Nevski）Nevski

3 結(jié)論與討論

本研究篩選到偏穗鵝觀草愈傷組織誘導(dǎo)最佳外植體為胚軸，胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L 2，4-D+0.1 g肌 醇+30 g/L蔗糖+5 g瓊脂。利用此培養(yǎng)基能夠成功對誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，為小麥和偏穗鵝觀草原生質(zhì)體融合提供技術(shù)支持。

根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物的任何器官都可以作為外植體，但不同組織器官培養(yǎng)成功的難易程度不同，同一植物不同的組織器官再生能力也有很大差異，并且接種材料的部位、植株年齡以及植株的生理狀態(tài)等都會直接影響組織器官的再生。本試驗所選的3種外植體中，胚軸誘導(dǎo)的效果最好，葉柄次之，葉片最差，這可能與取材部位的細(xì)胞分化程度有關(guān)系，胚軸在幼苗階段處于旺盛的生長狀態(tài)，分生細(xì)胞豐富，易誘導(dǎo)分化；也可能是不同外植體中所含有的內(nèi)源激素不同或細(xì)胞的極性差異。

愈傷組織培養(yǎng)初期，一定濃度的生長素類物質(zhì)是誘導(dǎo)脫分化、愈傷組織生長的必要條件[17]。從正交試驗分析可以看出，2，4-D對誘導(dǎo)偏穗鵝觀草胚軸形成愈傷影響最大，可見，2，4-D對外植體誘導(dǎo)愈傷起著關(guān)鍵作用，這與張獻(xiàn)龍等[18]的報道相一致。除此之外，也有研究者配合使用2，4-D和6-BA[19-22]或NAA[23-24]進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但是在分析過程中，并沒有對2，4-D和6-BA的交互作用進(jìn)行分析。本試驗研究了2，4-D、6-BA及NAA這3種植物生長物質(zhì)對偏穗鵝觀草愈傷誘導(dǎo)的影響，獲得的愈傷多疏松，但其他植物生長物質(zhì)對愈傷誘導(dǎo)的影響及不同形態(tài)愈傷的誘導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。