王旭 徐靜 王笑笑 杜亞飛

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（石家莊 050000）

宮頸癌又稱子宮頸癌，系指發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及宮頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤［1］。miRNA 是小分子非編碼RNA，miR?218?5p 是miRNA 的一種，參與調(diào)控人類多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程［2］。miR?218?5p 在胃癌中表達(dá)下調(diào)，起到潛在的抑癌作用，可能成為新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物［3］。還有研究［4］結(jié)果顯示，miR?218?5p 在宮頸癌患者尿液、血清及組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR?218?5p 可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）也參與了多種癌癥的進(jìn)程，如lncRNA?CP 通過調(diào)控HIF?1α/VEGFA 軸影響腎透明細(xì)胞癌侵襲、遷移［5］。過表達(dá)VEGFA影響人肝癌HepG2 細(xì)胞生長［6］。通過miRcode 預(yù)測顯示VEGFA 是miR?218?5p 靶基因，但是關(guān)于miR?218?5p 和VEGFA 調(diào)控對宮頸癌細(xì)胞的研究尚不清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)主要探究miR?218?5p 靶向VEGFA 基因?qū)m頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料正常宮頸上皮細(xì)胞NC104 和宮頸癌細(xì)胞株HeLa、CaSki、C33A 和SiHa 購自美國ATCC 公司；胎牛血清、RPMI?1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒購自大連寶生物公司；Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司；Transwell 小室購自北京索萊寶生物公司；二辛可寧酸（BCA）試劑盒購自上海艾博抗生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組宮頸癌細(xì)胞株HeLa、CaSki、C33A 和HeLa 接種于含適量RPMI?1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清）的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%左右時進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將miR?NC、anti?miR?NC、miR?218?5p、anti?miR?218?5p、si?NC、si?VEGFA、miR?NC 和pcDNA?VEGFA、miR?218 和pcDNA?VEGFA 轉(zhuǎn)染至HeLa 細(xì)胞，分別作為miR?NC組、anti?miR?NC組、miR?218?5p組、anti?miR?218?5p 組、si?NC 組、si?VEGFA 組、miR?NC+pcDNA?VEGFA 組、miR?218?5p+pcDNA?VEGFA 組。

1.2.2 RT?qPCR 分析miR?218 和VEGFA 表達(dá)TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行RT?qPCR擴(kuò)增，2?ΔΔCT法計算miR?218?5p（U6為內(nèi)參對照）和VEGFA（GAPDH為內(nèi)參對照）相對表達(dá)量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用結(jié)合緩沖液調(diào)整各組細(xì)胞濃度為2 × 105個/mL。取5 μL 的Annexin V?FITC 加入細(xì)胞懸液中，再加入5 μL 的PI，在室溫下暗室孵育1 h。流式細(xì)胞分析染色情況，計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)分析遷移能力收集細(xì)胞，重懸于無血清RPMI?1640 培養(yǎng)基中。取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 上腔室，取500 μL 含10%胎牛血清的RPMI?1640 加入下室作為化學(xué)引誘劑。培養(yǎng)箱孵育24 h，除去未遷移細(xì)胞，Transwell 小室下表面用95%乙醇室溫固定15 min，結(jié)晶紫室溫染色15 min，計算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)RIPA 裂解液細(xì)胞中總蛋白，以SDS?PAGE 電泳分離細(xì)胞蛋白，并轉(zhuǎn)移PVDF 膜上。之后加入一抗溶液，4 ℃孵育膜過夜，之后用二抗室溫孵育膜1 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯色后，ImageJ 軟件分析免疫反應(yīng)條帶的灰度值。

1.2.6 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)miRcode 預(yù)測顯示VEGFA mRNA 的3'?UTR 區(qū)域含有的互補(bǔ)序列，將含有miR?218?5p 結(jié)合位點(diǎn)的野生WT?VEGFA 序列或突變MUT?VEGFA 系列插入到熒光素酶報告質(zhì)粒獲得熒光素酶報告載體。將野生型VEGFA 熒光素酶報告載體（WT?VEGFA）、突變型VEGFA 熒光素酶報告載體（MUT?VEGFA）與miR?218?5p mimics、miR?NC 分別共轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞，檢測細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個平行實(shí)驗(yàn)，獨(dú)立重復(fù)3 次。SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和LSD?t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細(xì)胞中miR?218?5p 和VEGFA 表達(dá)與正常宮頸上皮細(xì)胞NC104 比較，宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki、C33A 和SiHa 中miR?218?5p 表達(dá)降低，VEGFA mRNA 表達(dá)升高（t =22.063、20.402、18.965、16.713、14.737、14.610、15.524、13.519，均P<0.01）。以HeLa 細(xì)胞最為明顯，因此選擇HeLa細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 宮頸癌細(xì)胞中miR?218?5p 和VEGFA 表達(dá)Fig.1 Expression of miR?218?5p and VEGFA in cervical cancer cells

2.2 過表達(dá)miR?218?5p 對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響與miR?NC 組比較，miR?218?5p 組細(xì)胞miR?218?5p 表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞遷移數(shù)、Bcl?2、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低（t= 15.638、28.950、14.205、46.396、14.445、15.974、17.820，均P<0.01）。見圖2。

圖2 過表達(dá)miR?218?5p 對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR?218?5p on apoptosis and migration of cervical cancer cells

2.3 抑制VEGFA 表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響與si?NC 組比較，si?VEGFA 組細(xì)胞VEG?FA mRNA 表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞遷移數(shù)、Bcl?2、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)降低（t= 15.604、30.009、14.708、56.389、16.480、17.508，均P<0.01）。見圖3。

圖3 抑制VEGFA 表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響Fig.3 The effect of inhibiting VEGFA expression on apoptosis and migration of cervical cancer cells

2.4 miR?218?5p 靶向調(diào)控VEGFA 表達(dá)StarBase預(yù)測結(jié)果得出，miR?218?5p 與VEGFA 存在靶向結(jié)合關(guān)系，見圖4A。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果，miR?218?5p mimics 和WT?VEGFA 共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的相對熒光素酶活性與miR?NC 和WT?VEGFA 共轉(zhuǎn)染后比較降低（t=13.729，P<0.01）；miR?218?5p mimics和MUT?VEGFA 共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的相對熒光素酶活性與miR?NC 和MUT?VEGFA 共轉(zhuǎn)染后比較無顯著變化（t=0.567，P=0.694），見圖4B。與miR?NC 組比較，miR?218?5p 組細(xì)胞VEGFA mRNA 表達(dá)降低（t = 16.207，P < 0.01）；與anti?miR?NC 比較，anti?miR?218?5p 組細(xì)胞VEGFA mRNA 表達(dá)升高（t =16.477，P<0.01），見圖4C。

圖4 miR?218?5p 靶向調(diào)控VEGFA 表達(dá)Fig.4 MiR?218?5p targeted regulation of VEGFA expression

2.5 上調(diào)VEGFA 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR?218?5p 過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響與miR?218?5p+pcDNA?NC 組比較，miR?218?5p+pcDNA?VEGFA組細(xì)胞VEGFA mRNA 表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞遷移數(shù)、Bcl?2、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)升高（t= 15.387、37.358、17.350、64.723、16.260、18.335、16.307，均P<0.01）。見圖5。

圖5 上調(diào)VEGFA 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR?218?5p 過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響Fig.5 Up?regulation of VEGFA expression can reverse the effects of miR?218?5p overexpression on apoptosis and migration of cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌指發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位，發(fā)病原因目前尚不清楚，目前治療方案以手術(shù)和放射治療為主，亦可采用中西醫(yī)綜合治療，但中晚期患者治愈率很低［7］。極早診斷有利于宮頸癌預(yù)后改善，并降低其病死率和病發(fā)率。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR?218?5p 是一種抑癌基因，已有研究證實(shí)miR?218?5p 在胰腺癌、膀胱癌、口腔鱗癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR?218?5p 表達(dá)可通過靶向下調(diào)PPME1、CCNE2/SMC4、LPCAT1 進(jìn)而抑制這些腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明miR?218?5p 作為抑癌基因阻礙腫瘤發(fā)展進(jìn)程［8］。有研究結(jié)果顯示，miR?218?5p 在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，miR?218?5p 可通過靶向LYN/NF?κB 信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示miR?218?5p 有望成為宮頸癌潛在標(biāo)記物［9］。本研究結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞系（HeLa、CaSki、C33A、SiHa）中miR?218?5p 表達(dá)降低，過表達(dá)miR?218?5p 可降低宮頸癌HeLa 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，增加細(xì)胞凋亡率，而Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl?2、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示過表達(dá)miR?218?5p 可促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡和抑制遷移，可作為抑癌基因參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

為進(jìn)一步探究miR?218?5p 抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究通過miR?code 預(yù)測顯示VEGFA 是miR?218?5p 靶基因，雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)和RT?qPCR 實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了miR?218?5p 可靶向負(fù)調(diào)控VEGFA。VEGF 家族成員眾多，而VEGFA 是其主要成員，與機(jī)體生長發(fā)育、轉(zhuǎn)移、血管形成、遷移等相關(guān)，目前的研究顯示，VEGFA 在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，受上游多個miRNA 調(diào)控，進(jìn)而參與宮頸癌發(fā)展［10-12］。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞系（HeLa、CaSki、C33A、SiHa）中VEGFA 表達(dá)升高，抑制VEGFA 可降低宮頸癌HeLa 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，增加細(xì)胞凋亡率，而Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl?2、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示抑制VEGFA 抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)VEGFA 逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR?218?5p 對宮頸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響，進(jìn)一步提示miR?218?5p 通過靶向下調(diào)VEGFA 來發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述，miR?218?5p 靶向下調(diào)VEGFA 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移，miR?218?5p 有可能成為宮頸癌治療的分子靶點(diǎn)。本研究只著重研究體外實(shí)驗(yàn)研究，關(guān)于體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)及miR?218?5p 調(diào)控下游mRNA 或信號通路需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。