黃鼎力 鄒宛蕓 張 英 劉 慶

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院疼痛科，四川瀘州 646000

腦卒中后中樞痛（central post-stroke pain，CPSP）是一種由各種腦血管意外導(dǎo)致的相關(guān)疼痛，其發(fā)生率為8%～11%[1-2]。CPSP 疼痛程度劇烈，常用的鎮(zhèn)痛藥物效果不佳[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，對(duì)組織損傷做出迅速反應(yīng)，并釋放大量炎癥因子[4]。TLR4/NF-κB 信號(hào)通路能明顯增加小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[5-6]，右美托咪定是一種選擇性α2 受體激動(dòng)劑，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)炎癥有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用[7-8]。此外，右美托咪定能抑制損傷腦組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)[9-10]。因此右美托咪定可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)活動(dòng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化改善CPSP 大鼠的疼痛。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（Abcam，貨號(hào)：ab235662）；Iba-1、NeuN 抗體（Abcam，貨號(hào)：ab178846、ab177487）；TLR4、NF-κB、pNFκB 抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AF8171、AF1246、AF5881）；右美托咪定（四川國(guó)瑞藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：1909242）；Ⅳ型膠原酶（Gibco，貨號(hào)：17104019）。熱板儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司；PL-200）；微量進(jìn)樣針（Hamilton）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

90 只SD 大鼠（雄性，240～280 g，6～8 周齡）由西南醫(yī)科大學(xué)城北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)倫理委員會(huì)審批（2016-1A）。隨機(jī)選取30 只為假手術(shù)組，進(jìn)行丘腦腹后外側(cè)核（ventralis posterolateral，VPL）注射生理鹽水進(jìn)行傷口對(duì)照。剩余60 只進(jìn)行VPL 注射Ⅳ型膠原酶，造模后3 d 測(cè)定熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL），TWL 較術(shù)前降低2 s 即認(rèn)為出現(xiàn)疼痛[11]。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)即為右側(cè)VPL 出現(xiàn)卒中，且疼痛行為學(xué)改變[12]。將TWL 異常的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和干預(yù)組，每組30 只。造模后第4 天開(kāi)始干預(yù)。干預(yù)組連續(xù)7 d 腹腔注射右美托咪定50 μg/kg，該劑量為治療復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征大鼠的最佳劑量[13]。模型組注射等量生理鹽水。

1.3 疼痛行為學(xué)檢測(cè)

每組大鼠10 只，于造模前1 天（T0）、造模后第10 天（T1）、17 天（T2）、31 天（T3）檢測(cè)TWL[13]。

1.4 Western blot 檢測(cè)各組大鼠VPL 中TLR4、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及pNF-κB 的表達(dá)

在T3時(shí)，各組取5 只大鼠采用Western blot 檢測(cè)各組大鼠VPL 中TLR4、NF-κB 及pNF-κB 的表達(dá)，心臟灌注去除全身血液，取材。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育抗體，顯影；經(jīng)Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 免疫熒光染色檢測(cè)大鼠VPL 神經(jīng)元和Iba-1 的表達(dá)情況

在T3時(shí)，采用免疫熒光染色檢測(cè)大鼠VPL 神經(jīng)元和Iba-1 的表達(dá)情況。左心灌注后，固定、脫水、包埋，切片，孵育抗體。采用熒光顯微鏡觀察。經(jīng)cellSens軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定TNF-α、IL-6 和IL-1β水平

在T3時(shí)，取10 mg 膠原酶注射點(diǎn)周圍腦組織，充分研磨勻漿，離心10 min（4 000 r/min），取上清液。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)定TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)量采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，假手術(shù)組及模型組TWL 組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05) 。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較模型組、干預(yù)組T1～T3時(shí)TWL 低于T0時(shí)，T2～T3時(shí)TWL低于T1時(shí)，T3時(shí)TWL 低于T2時(shí)(P <0.05)；組間比較：模型組T1～T3時(shí)TWL 低于假手術(shù)組，干預(yù)組T1～T3時(shí)TWL 高于模型組(P <0.05)。見(jiàn)表1～2。

表1 假手術(shù)組、模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較（，n=10）

表1 假手術(shù)組、模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較（，n=10）

注 與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與本組T0 比較，cP ＜0.05；與本組T1比較，dP ＜0.05；與本組T2 比較，eP ＜0.05。TWL：熱縮足反射潛伏期

表2 假手術(shù)組、模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較（，n=10）

表2 假手術(shù)組、模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)TWL 比較（，n=10）

注 與模型組比較，aP ＜0.05；與本組T0 比較，cP ＜0.05；與本組T1比較，dP ＜0.05；與本組T2 比較，eP ＜0.05。TWL：熱縮足反射潛伏期

2.2 三組VPL 中TLR4、NF-κB、pNF-κB 表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組VPL 中TLR4 及pNFκB 的表達(dá)升高（P ＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組VPL 中TLR4 及pNF-κB 的表達(dá)降低（P ＜0.05）；三組VPL 中NF-κB 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 三組大鼠VPL 中TLR4、NF-κB、pNF-κB 表達(dá)比較（n=5）

2.3 三組VPL 變化情況

與假手術(shù)組比較，模型組VPL 神經(jīng)元數(shù)量減少（P ＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組VPL 神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 三組大鼠丘腦腹后外側(cè)核中NeuN 蛋白的免疫熒光圖像（n=6）

2.4 三組VPL 中炎癥因子及Iba-1 比較

模型組VPL 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及Iba-1較假手術(shù)升高（P ＜0.05），干預(yù)組VPL 中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及Iba-1 較模型組降低（P ＜0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

圖3 三組大鼠VPL 中Iba-1 比較（n=5）

表3 三組大鼠炎癥因子表達(dá)情況比較（，n=6）

表3 三組大鼠炎癥因子表達(dá)情況比較（，n=6）

注 與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白介素

3 討論

本研究采用VPL 注射膠原酶的方法建立CPSP模型，VPL 是人類CPSP 的重要病變位置之一[15-16]。在當(dāng)前研究中，大鼠從造模3 d 開(kāi)始，TWL 明顯降低，并持續(xù)至造模后31 d。結(jié)合VPL 神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，構(gòu)建CPSP 模型成功。同時(shí)，VPL 中的Iba-1 和炎癥因子的表達(dá)明顯上調(diào)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在CPSP 大鼠的中樞敏化中起著重要作用。

中樞敏化與參與了CPSP 的發(fā)生發(fā)展[17]。大腦神經(jīng)損傷后增殖活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種促炎性細(xì)胞因子使痛覺(jué)信號(hào)在丘腦的傳遞被明顯放大，導(dǎo)致中樞敏化的發(fā)生[18-19]。TLR4 與多種炎癥疾病密切相關(guān)[10，20]。TLR4能增強(qiáng)NF-κB 的磷酸化并非促進(jìn)其表達(dá)，而NF-κB磷酸化是其活化的標(biāo)志。pNF-κB 可增強(qiáng)炎癥因子的表達(dá)及釋放[21-22]。TLR4 高表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的增值活化及炎癥因子的釋放[23]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，T3時(shí)CPSP 大鼠的丘腦腹后外側(cè)核中TLR4、pNF-κB 表達(dá)上調(diào)，結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1 的上調(diào)，證實(shí)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與CPSP大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞引起神經(jīng)炎癥的病理過(guò)程。

右美托咪定能夠改善器官的缺血再灌注損傷、抑制促炎信號(hào)通路和減少細(xì)胞死亡[24-25]。在當(dāng)前研究中，CPSP 大鼠的TWL 及VPL 中Iba-1、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)均被右美托咪定所抑制，提示右美托咪定能顯著改善CPSP 大鼠的疼痛，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB 信號(hào)的活動(dòng)也受到右美托咪定的抑制。因此，當(dāng)前研究結(jié)果提示TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可能參與右美托咪定抑制VPL 的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)炎癥過(guò)程。

綜上所述，腹腔注射右美托咪定對(duì)CPSP 大鼠產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛作用，其機(jī)制可能是通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化及神經(jīng)炎癥進(jìn)展。