范曉凡, 劉 勇, 譚新球，張戰(zhàn)泓, 張 卓, 史曉斌,*, 張德詠,*

(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 長沙 410125;3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 長沙 410125)

根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)最新發(fā)現(xiàn)，自然界中存在9 110種病毒，其中全球目前已報(bào)道的植物病毒約2 129種，許多植物病毒能夠?qū)Ｒ恍缘馗腥巨r(nóng)作物，對(duì)農(nóng)林生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。由于植物細(xì)胞壁屏障的存在，病毒無法直接感染植物，只能依賴于昆蟲介體的行為來實(shí)現(xiàn)其在宿主間的傳播(Whitfield and Rotenberg, 2015; 關(guān)桂靜等, 2017)。病毒對(duì)于昆蟲的影響可以分為直接影響和間接影響，前者是病毒與媒介結(jié)合后對(duì)介體昆蟲生理生化和行為的影響(施艷等, 2013; Blanc and Michalakis, 2016)，如:水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)可以提高黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps的存活率和產(chǎn)卵量，并促進(jìn)種群的增長(王前進(jìn)等, 2018);番茄黃化葉曲病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)可以促進(jìn)煙粉虱Bemisiatabaci的取食行為，增加刺探與取食頻率(Jahanetal., 2014)，從而促進(jìn)病毒的傳播。后者是指病毒的侵染可觸發(fā)寄主植物的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而在一定程度上影響介體昆蟲，以此改變介體昆蟲的生態(tài)適應(yīng)性,如:蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus, TuMV)可以導(dǎo)致植物胼胝質(zhì)沉積堵塞篩管的能力下降，從而有利于綠色桃蚜Myzuspersicae繁殖(Casteeletal., 2015);蘋果感染植原體CandidatusPhytoplasmamali后釋放大量的石竹烯，更容易吸引木虱(Mayeretal., 2008)。病毒依賴介體昆蟲進(jìn)行傳播，病毒對(duì)植物的侵染又可以對(duì)介體昆蟲產(chǎn)生影響，因此在植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者間形成了復(fù)雜的互作關(guān)系，其中寄主植物介導(dǎo)介體昆蟲與病毒的互作可能是決定田間病害流行的重要原因(Stoutetal., 2006)。

番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)最早在美國佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)，感病植株癥狀表現(xiàn)為葉脈間的褪綠黃化，葉緣卷曲，首先于下部葉片觀察到癥狀。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，整棵植株死亡，果實(shí)受到嚴(yán)重影響(Wintermantel and Wisler, 2006)。ToCV是一種韌皮部限制病毒，主要通過介體昆蟲煙粉虱以半持久非循環(huán)方式傳播(Polstonetal., 2014)，其寄主范圍非常廣泛，包括25科85種雙子葉植物，其中包括非常重要的經(jīng)濟(jì)作物番茄、南瓜、辣椒等(Fiallo-Olivé and Navas-Castillo， 2019)。由于MED煙粉虱的適應(yīng)性能強(qiáng)、寄主范圍廣、繁殖能力強(qiáng)，現(xiàn)已在全球范圍內(nèi)分布廣泛，對(duì)全世界的農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響(Fontetal., 2004)。目前關(guān)于ToCV的分子特征，煙粉虱傳播ToCV的方式與特性已經(jīng)做了充分的報(bào)道(Shietal., 2018; Weietal., 2019)，研究表明MED煙粉虱具有較強(qiáng)的獲毒和傳毒能力，但是對(duì)于ToCV暴發(fā)流行的原因尚不清楚，在煙粉虱攜帶病毒后，病毒對(duì)煙粉虱在不同寄主植物上的寄主選擇性和取食行為的影響仍缺乏研究。

為此，本研究將通過Y型嗅覺儀探究攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱對(duì)于ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆以及ToCV非寄主棉花的選擇趨向性差異，利用EPG技術(shù)比較攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱在4種植物上的取食行為，揭示煙粉虱攜帶ToCV后在不同寄主植物間的選擇和取食行為差異，為深入研究煙粉虱-寄主植物-病毒三者間的相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)，也為有效控制ToCV的傳播提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試蟲源：MED煙粉虱，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所張友軍研究員課題組饋贈(zèng)。MED煙粉虱種群長期飼養(yǎng)在溫度25～28℃、相對(duì)濕度60%～80%、光周期16L∶8D的溫室內(nèi)，以棉花為寄主繼代飼養(yǎng)。將初羽化的MED煙粉虱用微蟲籠夾至感染ToCV的番茄上獲毒48 h，獲得攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲。

1.1.2供試毒源：單獨(dú)侵染ToCV(GenBank登錄號(hào): KC887999.1)的番茄采自山東壽光，并且經(jīng)過PCR以及小RNA測(cè)序檢測(cè)無其他病毒復(fù)合侵染。將毒株移栽至湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室，在不同隔間中單獨(dú)培養(yǎng)，分別采用蟲傳的方法獲取毒株。

1.1.3供試植物：茄科植物：番茄Lycopersiconesculentum(鉆紅美娜)、辣椒Capsicumannuum(新選益都紅)；豆科植物：豇豆Vignaunguiculata(盈豇888)；錦葵科植物：棉花Gossypiumspp. (中棉所63)。 將供試種子播種于育苗盆中，放至于溫度26±1℃、相對(duì)濕度60%～80%、光周期14L∶10D的溫室內(nèi)培育至發(fā)芽，隨后將發(fā)芽的植株移栽到花盆中進(jìn)行培養(yǎng)?；ㄅ杈?00目紗網(wǎng)封蓋，避免煙粉虱及其他害蟲污染寄主植物，保證植株的健康生長。

1.2 MED煙粉虱雌成蟲對(duì)寄主植物選擇行為的生物測(cè)定

用Y型嗅覺儀測(cè)定MED煙粉虱雌成蟲對(duì)4種植物的趨性行為反應(yīng)，將處于同一長勢(shì)的棉花、番茄、豆角和辣椒分別放入4個(gè)味源瓶中，兩兩進(jìn)行組合，每個(gè)玻璃臂通過硅膠管分別與氣體流量計(jì)、味源瓶、活性碳、空氣泵相連。打開氣閥通氣4 h后，取饑餓處理2 h的100頭未攜帶ToCV煙粉虱成蟲，將其引入Y型管的管柄中，用錫箔紙蓋住進(jìn)行避光處理，控制管中氣體流速在400 mL/min，每30 min觀察一次。煙粉虱進(jìn)入Y型管管柄2/3處可視為選擇，待2/3的煙粉虱選擇完畢后，記錄兩個(gè)管柄內(nèi)做出選擇的煙粉虱數(shù)量。同時(shí)，取100頭飼毒48 h的煙粉虱成蟲，將其引入Y型管的管柄中，按以上方法測(cè)試攜帶ToCV煙粉虱對(duì)4種植物的取食偏好性。每次測(cè)定后需更換Y型管，消除誤差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。實(shí)驗(yàn)在平均溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度60%～80%的安靜房間中進(jìn)行。

1.3 EPG技術(shù)分析MED煙粉虱雌成蟲在4種寄主植物上的取食行為

利用DC-EPG Giga-8(荷蘭瓦赫寧根大學(xué))刺吸電位技術(shù)監(jiān)測(cè)攜帶和未攜帶ToCV煙粉虱口針在健康的ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆與ToCV非寄主棉花上的取食行為差異。將初羽化2-5 d的供試煙粉虱雌成蟲饑餓處理2 h后，將其放置于生物冰袋上短暫麻醉后迅速將一段2～3 cm、直徑12.5 μm的金絲一端粘連在煙粉虱的前胸背板上，另一端與EPG工作傳感器的銅線粘連，同時(shí)將植物電極插入植株生長的土壤中。當(dāng)煙粉虱口針刺入植株組織時(shí)，回路接通，電流信號(hào)經(jīng)電流放大器放大后，由轉(zhuǎn)換器將其轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，再由STYLET軟件(荷蘭瓦赫寧根大學(xué))記錄并以波形數(shù)據(jù)的形式儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中。每頭煙粉虱記錄8 h，每次記錄結(jié)束后，更換新的植物和煙粉虱。攜帶ToCV和煙粉虱對(duì)于番茄、辣椒和豇豆以及棉花的取食行為各測(cè)定15頭成蟲。實(shí)驗(yàn)在平均溫度25±1℃，相對(duì)濕度60%～80%的安靜房間中進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS16.0。采用單因素ANOVA比較分析攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱對(duì)4種健康寄主植物的選擇偏好性；繪圖采用SigmaPlot 12.0。

EPG數(shù)據(jù)記錄和波形識(shí)別使用EPG style+a與EPG style+d軟件(Giga-8 DC-EPG系統(tǒng)，荷蘭瓦赫寧根大學(xué))，根據(jù)湯清波等(2011)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)np, C, pd, E1, E2和G波6種波形進(jìn)行歸納統(tǒng)計(jì)；分析前先檢測(cè)數(shù)據(jù)的方差齊性和正態(tài)性，若符合正態(tài)分布，則采用T檢驗(yàn)比較分析攜帶和未攜帶ToCV煙粉虱的取食差異；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用log10轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 ToCV對(duì)MED煙粉虱雌成蟲寄主選擇行為的影響

通過Y型嗅覺儀對(duì)煙粉虱雌成蟲的寄主選擇行為進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果如圖1。對(duì)于未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲，辣椒和番茄的引誘力最強(qiáng)；其次是棉花；豇豆的吸引力最弱。當(dāng)煙粉虱成蟲攜帶了ToCV，再對(duì)這4種植物進(jìn)行選擇時(shí)，選擇番茄、辣椒的煙粉虱數(shù)量仍然是最多的，豇豆對(duì)其吸引力仍然是最弱的；但是與未攜帶ToCV的煙粉虱(對(duì)照)相比，攜帶ToCV的煙粉虱對(duì)番茄、辣椒分別與其他植株進(jìn)行選擇時(shí)，選擇最喜愛的番茄與辣椒的煙粉虱數(shù)量顯著減少(P<0.05)；對(duì)棉花與番茄、辣椒分別進(jìn)行選擇時(shí)，選擇棉花的煙粉虱的數(shù)量沒有顯著變化(P>0.05)；對(duì)棉花和豇豆進(jìn)行選擇時(shí)，選擇棉花的煙粉虱的數(shù)量出現(xiàn)顯著減少(P<0.05)；對(duì)豇豆與番茄、辣椒進(jìn)行選擇時(shí)，選擇豇豆的煙粉虱的數(shù)量沒有顯著變化(P>0.05)；對(duì)豇豆與棉花進(jìn)行選擇時(shí)，選擇豇豆的煙粉虱的數(shù)量出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。

圖1 攜帶ToCV和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲對(duì)4種寄主植物的選擇

2.2 攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲取食行為的變化

2.2.1在ToCV寄主上取食行為的變化：在ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲非韌皮部取食行為EPG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1, 3和5。攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在番茄、辣椒和豇豆上的總刺探次數(shù)顯著高于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，但是總刺探時(shí)間顯著短于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，C波(非韌皮部取食)總時(shí)間均無顯著差異(P>0.05)，而攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲第1次刺探到第1次E波(韌皮部取食)出現(xiàn)時(shí)間在三者上都有明顯的推遲，顯著晚于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)；但是攜帶ToCV的煙粉虱與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲相比在番茄和豇豆上的第1次刺探發(fā)生時(shí)間顯著提前，而在辣椒上的第1次刺探發(fā)生時(shí)間無顯著差異(P>0.05)。攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲對(duì)番茄、辣椒和豇豆的韌皮部的取食行為EPG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2, 4和6。攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲在番茄、 辣椒和豇豆上的E1波 (韌皮部分泌唾液)總時(shí)間、 E1波數(shù)量、 E1波平均時(shí)間、E2波數(shù)量與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲相比均無顯著差異(P>0.05)，但是攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲的E2波(韌皮部吸食汁液)總時(shí)間與未攜帶ToCV的煙粉虱相比顯著減少(P<0.05)，E波潛在指數(shù)也顯著降低(P<0.05)；而攜帶和未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在番茄和豇豆上的E2波平均時(shí)間無顯著差異(P>0.05)，在辣椒上的出現(xiàn)了顯著的減少(P<0.05)。

表1 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的 MED煙粉虱雌成蟲在番茄植株上取食的非韌皮部的EPG參數(shù)

表2 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在番茄植株上取食的韌皮部的EPG參數(shù)

表3 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在辣椒植株上取食的非韌皮部的EPG參數(shù)

表4 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在辣椒植株上取食的韌皮部的EPG參數(shù)

表5 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在豇豆植株上取食的非韌皮部的EPG參數(shù)

表6 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在豇豆植株上取食的韌皮部的EPG參數(shù)

2.2.2在ToCV非寄主上取食行為的變化：在ToCV非寄主棉花上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲非韌皮部取食行為EPG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7。攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲在棉花上的總刺探次數(shù)顯著高于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，總刺探時(shí)間顯著短于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)，而C波總時(shí)間在兩者間均無明顯差異(P>0.05)，攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲第1次刺探到第1次E波出現(xiàn)時(shí)間都存在明顯的推遲，顯著晚于未攜帶ToCV的煙粉虱的(P<0.05)；對(duì)于第1次刺探發(fā)生時(shí)間，攜帶ToCV的煙粉虱與未攜帶ToCV的煙粉虱相比在棉花上則沒有顯著差異(P>0.05)。在ToCV非寄主棉花上，攜帶和未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲的韌皮部的取食行為EPG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8。攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲在棉花上的E1波總時(shí)間、E1波數(shù)量、E1波平均時(shí)間、E2波數(shù)量與未攜帶ToCV的煙粉虱雌蟲均無顯著差異(P>0.05)，但是攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲的E2波總時(shí)間和平均時(shí)間與未攜帶ToCV的煙粉虱相比都顯著減少(P<0.05)，E波潛在指數(shù)也均顯著降低(P<0.05)。

表7 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在棉花植株上取食的非韌皮部的EPG參數(shù)

表8 攜帶ToCV與未攜帶ToCV的MED煙粉虱雌成蟲在棉花植株上取食的韌皮部EPG參數(shù)

3 討論

ToCV是一種在全球范圍內(nèi)引起嚴(yán)重作物病害的植物病毒，它的傳播依賴于昆蟲介體煙粉虱。傳播病毒的過程分為獲毒、持毒和傳毒3個(gè)過程(史曉斌等, 2012)，當(dāng)介體昆蟲獲取了一定量的病毒粒子后，它必須將病毒粒子轉(zhuǎn)移到新的寄主上才能完成傳毒，完成病毒在未被侵染寄主間的擴(kuò)散。因此，介體昆蟲對(duì)寄主的選擇行為變化直接影響著病毒的傳播，直接關(guān)系到病毒最終的擴(kuò)散范圍(Gandon, 2018)。大量研究表明，無毒的介體昆蟲與攜帶病毒的介體昆蟲在對(duì)于健康植株和感病植株選擇中存在明顯的差異，通常表現(xiàn)為無毒的介體昆蟲趨向于選擇帶毒植株，而帶毒的介體昆蟲則趨向于選擇健康植株或者沒有明確趨向(Eigenbrodeetal., 2018)，這種趨性的改變將擴(kuò)大寄主的范圍，加劇病毒的傳播。如有研究發(fā)現(xiàn)植物病毒能夠通過一種類似炎癥的免疫信號(hào)，級(jí)聯(lián)激發(fā)介體昆蟲煙粉虱腦部產(chǎn)生Caspase依賴的凋亡性神經(jīng)退行，削弱其嗅覺和視覺的辨別能力，增強(qiáng)了帶毒昆蟲對(duì)于健康寄主的趨向，有利于病毒的傳播(Wangetal., 2020)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙粉虱雌成蟲未攜帶ToCV時(shí)，它對(duì)于番茄和辣椒的選擇性最強(qiáng)，這是由于番茄和辣椒的揮發(fā)物中存在吸引煙粉虱的物質(zhì)。當(dāng)煙粉虱雌成蟲攜帶了ToCV時(shí)，病毒會(huì)影響煙粉虱對(duì)外界信息的辨別能力，因此它對(duì)于喜食的番茄、辣椒趨向性減弱，這將促有助于煙粉虱盡快轉(zhuǎn)移寄主，將病毒傳播出去。同時(shí)，本研究結(jié)果(圖1)表明，病毒侵染可以增強(qiáng)煙粉虱對(duì)本來具有弱選擇性的ToCV寄主豇豆的選擇，這將導(dǎo)致煙粉虱定殖的隨機(jī)性增大，從而增加了病毒在植物間的擴(kuò)散機(jī)會(huì)；通過間種煙粉虱非嗜好植物來對(duì)其進(jìn)行驅(qū)避的作用也會(huì)大大降低，增加了煙粉虱與病毒在田間流行的幾率。

介體昆蟲的取食行為直接影響著病毒的獲取與傳播，因此病毒對(duì)于介體昆蟲取食行為的影響直接決定著病毒傳播的效率。對(duì)于ToCV這種非循環(huán)性病毒而言，介體昆蟲的獲毒與傳毒過程均在較短時(shí)間內(nèi)完成，因此刺探取食次數(shù)的增加、頻繁地更換取食位點(diǎn)和寄主轉(zhuǎn)移對(duì)于它來說更為有利和高效(Maucketal., 2016; 王世藩等, 2020)。Moreno-Delafuente等(2013)發(fā)現(xiàn)TYLCV可以通過操控?zé)煼凼男袨閬泶龠M(jìn)自己的傳播，如影響煙粉虱對(duì)于寄主的選擇，加強(qiáng)煙粉虱的刺探及取食行為；Wang等(2015)對(duì)蚜蟲唾液中的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzymes, ACEs)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ACE1基因和ACE2基因的同時(shí)敲除會(huì)增強(qiáng)蚜蟲取食能力，它能夠很快地刺探到寄主的韌皮部；周涵宇等(2018)發(fā)現(xiàn)將褐飛虱Nilapawatalugens相關(guān)的唾液蛋白基因干擾后，在取食水稻的6 h內(nèi)，褐飛虱韌皮部取食的時(shí)間明顯縮短，部分干擾目的基因后的褐飛虱無法成功取食到韌皮部，這說明當(dāng)病毒侵染介體昆蟲時(shí)，可能是通過抑制或者促進(jìn)了某些基因的表達(dá)，從而對(duì)介體昆蟲的取食行為造成影響。

本研究通過EPG測(cè)定發(fā)現(xiàn)攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲與未攜帶ToCV的煙粉虱雌成蟲相比，在ToCV寄主番茄、辣椒、豇豆與ToCV非寄主棉花上刺探取食的總刺探次數(shù)顯著增多；同時(shí)，第1次刺探到韌皮部的時(shí)間顯著推遲，對(duì)韌皮部吸食汁液的時(shí)間(E2波總時(shí)間)與總刺探時(shí)間顯著減少(表1～8)。盡管有研究表明，金絲的存在會(huì)影響煙粉虱的取食行為，12.5 μm的金絲與5 μm的鉑絲相比，金絲的存在會(huì)顯著增加煙粉虱的刺探次數(shù)，減少對(duì)韌皮部的取食時(shí)間(Chesnais and Mauck, 2018)，但是本研究所有的處理均采用粗細(xì)一致的金絲，意在探究ToCV病毒對(duì)于煙粉虱取食行為的影響，在分析時(shí)可以忽略金絲對(duì)于煙粉虱取食的影響。結(jié)果中在ToCV寄主上刺探次數(shù)的增加表明帶毒煙粉虱在到達(dá)植物皮部取食過程中可能會(huì)遇到更多阻礙，從而需要更多的刺探嘗試，這會(huì)提高病毒的傳播效率；而韌皮部分泌唾液時(shí)間的推遲與取食時(shí)間減少也可能促使煙粉虱對(duì)現(xiàn)有寄主的取食情況感到不滿足，從而促使它反復(fù)尋找新的宿主，這有利于病毒的傳播與流行。在ToCV非寄主上取食行為的變化與在ToCV寄主上的一致，說明病毒是直接影響了煙粉虱從而導(dǎo)致取食行為發(fā)生了變化，通過影響介體昆蟲、操控它的取食行為來促進(jìn)自身的傳播。而在這4種不同的寄主植物上，煙粉虱攜帶病毒前后的第一次刺探開始的時(shí)間變化并不一致，這說明第一次刺探時(shí)間可能還會(huì)受寄主植物的葉片結(jié)構(gòu)影響，導(dǎo)致有些刺探時(shí)間明顯提前，而有些顯著推后。無論病毒對(duì)介體昆蟲的直接、間接的影響都是來促進(jìn)自身的傳播的，若能夠掌握昆蟲體內(nèi)病毒受體的特性，研究出能夠阻礙受體與病毒的結(jié)合的物質(zhì)，這將對(duì)控制病毒的傳播有重大意義。