苗陽(yáng)陽(yáng)，張艷蕊，宋標(biāo)，劉旭桐，張安琪，呂金澤，張浩，張小華，歐陽(yáng)佳慧，李旺，曲善民

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319）

土地鹽堿化治理已成為全球農(nóng)業(yè)最重要的問(wèn)題之一，鹽分會(huì)導(dǎo)致耕地面積、作物生產(chǎn)力和作物質(zhì)量大幅度下降［1］。近年來(lái)，隨著氣候變化和人類(lèi)生產(chǎn)活動(dòng)的影響，土壤鹽堿化程度進(jìn)一步加重。鹽堿化影響了全世界20%的耕地，嚴(yán)重威脅著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的建設(shè)［2-3］。大慶地處松嫩平原西部，黑龍江省西南部，其土壤主要為蘇打鹽堿化草甸土和沼澤化草甸土。近年來(lái)，由于油田開(kāi)發(fā)和其他人為因素的影響，土壤鹽堿化逐漸加重［4］。堿蓬（Suaeda glauca）是藜科（Chenopodiaceae）堿蓬屬（Suaeda）植物，對(duì)鹽堿具有高度適應(yīng)性，能保護(hù)和改良土壤、消除裸露鹽堿荒灘，防止水土流失，對(duì)保持和重建鹽堿地生態(tài)有重要作用，被譽(yù)為鹽堿地改造的“先鋒植物”［5-6］。堿蓬作為真鹽生植物，體內(nèi)鹽含量相對(duì)較高，而絕大多數(shù)微生物生長(zhǎng)在低鹽環(huán)境中，因此推測(cè)堿蓬內(nèi)生菌屬于極端微生物之一的嗜鹽微生物，其內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌具有特殊的生理生化性質(zhì)，具有較高的研究?jī)r(jià)值［7］。

在當(dāng)前“綠水青山就是金山銀山”的生態(tài)理念下，資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)已成為我國(guó)發(fā)展的基本國(guó)策，綠色生態(tài)也成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的內(nèi)在要求。鑒于此，人們一直在努力尋找新的生物治理途徑——在不投入巨資改變鹽堿地原有性狀的前提條件下，通過(guò)微生物與植物的相互作用來(lái)提高植物的耐鹽堿性，改善鹽堿土狀況，其有望成為利用鹽堿地的新措施。植物促生細(xì)菌（plant growth promoting bacteria，PGPB）包括植物根際促生細(xì)菌（plant rhizosphere growth promoting bacteria，PGPR）和定殖于植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，是一類(lèi)可抑制有害生物的有益菌株［8-9］，可有效減輕植物的鹽堿脅迫損傷。合理施用PGPB可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量及通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來(lái)抵御生物和非生物脅迫［10］。由于鹽堿地土壤含鹽量和pH都較高，酸性和中性土壤中篩選得到的PGPB在鹽堿環(huán)境中很難存活定殖，在酸性、中性土壤中有很好促生效果的菌株在鹽堿土中很難發(fā)揮促生作用，所以普通促生細(xì)菌在鹽堿地應(yīng)用困難。近年來(lái)耐鹽堿促生細(xì)菌促進(jìn)鹽堿脅迫下植物生長(zhǎng)的研究備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)接種含ACC脫氨酶（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶）活性的根際促生菌可緩解鹽堿脅迫，減緩植物體內(nèi)乙烯積累，增加作物產(chǎn)量［11-12］。向君亮等［13］發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫條件下，將從大慶草原鹽堿土中分離出的耐鹽堿堀越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii）S11浸種苜蓿（Medicago sativa）后，能顯著促進(jìn)苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)。劉佳莉［14］從鹽堿土植物根際篩選的促生細(xì)菌可以增加鹽堿地大田中紫花苜蓿的生物量，提高紫花苜蓿的品質(zhì)。

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽(yù)，具有一定的耐鹽堿能力，適當(dāng)?shù)柠}堿脅迫不會(huì)對(duì)苜蓿的產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)造成影響，而中、重度鹽堿會(huì)抑制苜蓿生長(zhǎng)［15］。隨著草原以及耕地土壤鹽堿化程度的加劇，可種植苜蓿的土地面積也逐漸減少［16］。因此提高苜蓿的耐鹽堿能力對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展和鹽堿地改良具有重要意義。本試驗(yàn)應(yīng)用前期篩選的堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌澆灌紫花苜蓿幼苗根部，并根據(jù)松嫩平原鹽堿地鹽堿成分情況，以中性鹽（NaCl、Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=9∶1∶1∶9混合，并設(shè)置0、100、150、200 mmol·L-1鹽堿濃度脅迫苜蓿幼苗，研究堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿幼苗生長(zhǎng)及生理的影響，為提高苜蓿耐鹽堿性，改善鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及生理影響提供依據(jù)，為研制和開(kāi)發(fā)鹽堿土壤生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 堿蓬采樣區(qū)概況 鹽堿樣地位于黑龍江省大慶市采油三廠(chǎng)第五礦區(qū)周?chē)莸?，地理位置?6°41′-46°42′N(xiāo)，124°59′-124°60′E，試驗(yàn)于2019年6月采樣。該地屬于大陸性半干旱溫帶草原氣候，降水量最大時(shí)期為7月。土壤為鹽堿土，pH為8.7～9.3，主要優(yōu)勢(shì)植物有堿蓬、鵝觀(guān)草（Roegneria kamoji）、羊草（Leymus chinensis）、大籽蒿（Artemisia sieversiana）等。

1.1.2 供試菌株 分別為前期從上述鹽堿地采樣區(qū)采集的堿蓬根內(nèi)、根際土壤及莖內(nèi)分離的JG1、JT4和JJ5（表1），經(jīng)鑒定后保存在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

表1 堿蓬根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌菌株Table 1 Rhizobacteria and endophytic bacteria of S.glauca

1.1.3 供試種子 紫花苜蓿種子龍牧801（M.sativaLongmu No.801）由黑龍江省畜牧研究所提供，保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基［17］。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將分離自堿蓬根際土壤及不同組織的細(xì)菌菌株JG1、JT4和JJ5接種于LB液體培養(yǎng)基，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，待菌體濃度達(dá)到106cfu·mL-1時(shí)終止培養(yǎng)。

1.2.2 苜蓿幼苗培養(yǎng)及處理 細(xì)沙洗凈150℃高溫持續(xù)烘干5 h后，121℃滅菌26 min，連續(xù)滅菌5次，待冷卻后裝入75%乙醇消毒且杯底扎有網(wǎng)眼的塑料杯（直徑5.0 cm，高11.5 cm），將其放入水培盒中（長(zhǎng)24 cm，寬15 cm，高5 cm，350 g·杯-1）。選取顆粒飽滿(mǎn)且大小一致的苜蓿種子消毒（75%浸泡30 s，用無(wú)菌水每次1 min清洗4～5次）后于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽后移栽至塑料杯中。每處理水培盒內(nèi)加200 mL Hoagland有氮營(yíng)養(yǎng)液，使其從杯底由下至上浸濕［18］，幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中用無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)充水分。

待苜蓿幼苗長(zhǎng)出真葉后，每杯定苗15株，幼苗根部澆灌堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌菌懸液，25 mL·杯-1，澆灌7 d后將NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3按照9∶1∶1∶9鹽堿比例混合，鹽堿溶液濃度為0、100、150、200 mmol·L-1，25 mL·杯-1澆灌苜蓿幼苗根部。每15 d澆灌200 mL Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，自然光照45 d收獲幼苗測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 鹽堿脅迫下苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量的測(cè)定 隨機(jī)選5株紫花苜蓿用直尺測(cè)量絕對(duì)高度和分枝數(shù)。分別測(cè)量地上和根部鮮重［19-20］。各指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 鹽堿脅迫下苜蓿根系耐鹽堿性生理指標(biāo)的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）顯色法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用酸性茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量，以上試驗(yàn)方法參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［21］。

1.3.3 鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的測(cè)定 采用SPAD-502Plus葉綠素儀（KONICA MINOLTA，INC公司）測(cè)定葉片葉綠素含量。

1.3.4 綜合耐鹽堿性評(píng)價(jià)指標(biāo) 采用隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法，對(duì)與抗性呈正相關(guān)參數(shù)的株高、分枝數(shù)、地上和根鮮重、脯氨酸、POD、SOD、葉綠素采用公式：Fi=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）計(jì)算；對(duì)與抗性呈負(fù)相關(guān)參數(shù)的MDA，采用公式：Fi=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）計(jì)算。式中：Xi為i個(gè)指標(biāo)值；Xmin為i指標(biāo)的最小值；Xmax為i指標(biāo)的最大值。然后分別對(duì)細(xì)菌菌株處理的紫花苜蓿耐鹽堿隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，求平均值后得到該處理的隸屬度值，隸屬度值越大，該細(xì)菌菌株對(duì)鹽堿脅迫下紫花苜蓿促生效果越好。

為篩選促生細(xì)菌對(duì)紫花苜蓿耐鹽堿性的主要對(duì)比指標(biāo)，對(duì)鹽堿脅迫下紫花苜蓿各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)ω分別進(jìn)行主成分分析，其計(jì)算公式如下：ω=不同鹽堿脅迫處理濃度下的單項(xiàng)指標(biāo)平均測(cè)定值/對(duì)照組測(cè)定值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿生長(zhǎng)和生物量的影響

2.1.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿株高的影響 如圖1所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí) ，經(jīng)JT4處 理 后 苜 蓿 株 高 顯 著 高 于CK（P＜0.05），提高26.83%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿株高均升高，但與CK均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；150 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1和JT4處理后苜蓿株高顯著高于CK（P＜0.05），分別提高122.64%和69.81%；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿株高顯著高于CK（P＜0.05），分別提高130.30%、196.97%和139.39%。

圖1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿株高的影響Fig.1 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on plant height of alfalfa under salt-alkaline stress

2.1.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿分枝數(shù)的影響 如圖2所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)均高于CK，其中經(jīng)JT4處理后分枝數(shù)顯著高于CK（P＜0.05），提高50.00%；100和150 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)均高于CK，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)顯著高于CK（P＜0.05），分別提高100.00%、50.00%和100.00%。

圖2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿分枝數(shù)的影響Fig.2 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on branches number of alfalfa under salt-alkaline stress

2.1.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿鮮重的影響 不同鹽堿濃度脅迫下，隨鹽堿濃度的升高苜蓿地上鮮重呈下降趨勢(shì)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的地上鮮重均提高（表2）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JT4處理后苜蓿地上鮮重顯著高 于CK（P＜0.05），提 高317.64%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JJ5處理后苜蓿地上鮮重顯著高于CK（P＜0.05），提高149.93%；150 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后，苜蓿地上鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高156.38%、86.11%和57.25%；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿地上鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高315.04%、136.58%和248.81%。

表2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿地上鮮重的影響Table 2 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on the aboveground fresh weight of alfalfa under salt-alkaline stress（g·5 plant-1）

隨鹽堿濃度的升高苜蓿根鮮重呈先上升后下降趨勢(shì)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿根鮮重均提高（表3）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JT4處理后根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），提高486.09%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1和JJ5處理后，根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），分別提高109.84%和263.66%；150 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿根鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高182.97%、251.29%和1070.63%；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1和JJ5處理后根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），分別提高914.80%和778.75%。

表3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿根鮮重的影響Table 3 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on root fresh weight of alfalfa under salt-alkaline stress（g·5 plant-1）

2.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿根系生理指標(biāo)的影響

2.2.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響 隨鹽堿濃度的升高苜蓿POD活性呈先上升后下降趨勢(shì)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的POD活性均提高（圖3）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高58.91%、93.46%和58.57%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿POD活性均高于CK，但無(wú) 顯 著 差 異（P＞0.05）；150 mmol·L-1時(shí) ，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后，苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高51.21%、65.38%和71.15%；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后，苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高213.57%、162.51%和250.21%。

圖3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿POD活性的影響Fig.3 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on POD activity of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 如圖4所示，鹽堿 濃 度 為0 mmol·L-1時(shí) ，經(jīng)JT4和JJ5處 理 后 苜 蓿SOD活 性 顯 著 高 于CK（P＜0.05），分 別 提 高57.34%和70.36%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JT4處理后苜蓿SOD活性顯著高于CK（P＜0.05），提高70.33%；150 mmol·L-1時(shí)，JG1、JT4和JJ5均能顯著提高苜蓿SOD活性（P＜0.05），分別提高40.90%、132.75%和0.14%；200 mmol·L-1時(shí) ，JG1和JT4處 理 后 苜 蓿SOD活 性 顯 著高于CK（P＜0.05），分別提高54.40%和110.69%。

圖4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿SOD活性的影響Fig.4 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on SOD activity of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿丙二醛（MDA）含量的影響 如圖5所示，在鹽堿 濃 度 為0和100 mmol·L-1時(shí) ，除 鹽 堿 濃 度 為0 mmol·L-1時(shí)接種JG1后苜蓿MDA含量顯著低于CK（17.35%）（P＜0.05）外，其余處理的MDA含量均顯著高于CK（P＜0.05）。150 mmol·L-1時(shí)，JT4處理后苜蓿MDA含量顯著低于CK（11.28%）（P＜0.05）。200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿MDA含量與CK均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿MDA含量的影響Fig.5 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on MDA content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿脯氨酸含量的影響 如圖6所示，在鹽堿脅迫下隨著濃度的升高苜蓿脯氨酸含量呈先升高后下降趨勢(shì)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的脯氨酸含量均提高。鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），分別提高了516.12%、686.86%和443.67%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1處理后脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了253.14%；150 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JJ5處理后苜蓿脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了525.61%；200 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JT4處理后苜蓿脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了528.38%。

圖6 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on proline content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響 如圖7所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時(shí)，JG1和JT4處理后苜蓿葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），其含量分別提高45.24%和51.59%；100 mmol·L-1時(shí)，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿葉片葉綠素含量均顯著高于CK（P＜0.05）；150 mmol·L-1時(shí)，JT4和JJ5處理后苜蓿 葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），其含量分別提高51.64%和48.14%；200 mmol·L-1時(shí) ，經(jīng)JJ5處 理 后苜蓿葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），含量提高67.68%。

圖7 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響Fig.7 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on leaf chlorophyll content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿生長(zhǎng)影響的隸屬函數(shù)分析

如表4所示，通過(guò)隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)，0 mmol·L-1鹽堿脅迫下隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性從大到小依次為：JT4＞JG1＞CK＞JJ5，在不同鹽堿脅迫下，隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性從大到小均為：JT4＞JG1＞JJ5＞CK。表明經(jīng)堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌處理后均能提高苜蓿的耐鹽堿能力。

表4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿指標(biāo)隸屬函數(shù)分析Table 4 Comprehensive analysis of membership function values of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on alfalfa salt-alkaline tolerance indexes under salt-alkaline stress

2.4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿生長(zhǎng)影響的主成分分析

由表5可知，堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)0 mmol·L-1濃度下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析共獲得3個(gè)主成分，第Ⅰ主成分中指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中株高、分枝數(shù)、地上鮮重、地下鮮重?cái)?shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下促生細(xì)菌對(duì)苜蓿的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。第Ⅱ主成分指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中MDA數(shù)值較大，為0.82，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際和內(nèi)生細(xì)菌可減弱鹽堿脅迫下苜蓿細(xì)胞的損傷。第Ⅲ主成分中指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中葉綠素?cái)?shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際和內(nèi)生細(xì)菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

表5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析Table 5 Principal component analysis of salt-alkaline tolerance index of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on alfalfa under salt-alkaline stress

堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析中，第Ⅰ主成分中株高、分枝數(shù)、地上鮮重、地下鮮重?cái)?shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)苜蓿的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。第Ⅱ主成分中，當(dāng)鹽堿濃度為100 mmol·L-1時(shí)，POD數(shù)值較大，鹽堿濃度為150 mmol·L-1時(shí)，SOD數(shù)值較大，200 mmol·L-1時(shí)，MDA數(shù)值較大。主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可提高滲透調(diào)節(jié)能力，減弱鹽堿脅迫下苜蓿細(xì)胞的損傷。第Ⅲ主成分中指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中脯氨酸數(shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可提高苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力，提高其耐鹽堿脅迫能力。

3 討論

3.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿生產(chǎn)特性的影響

逆境對(duì)植物個(gè)體形態(tài)發(fā)育具有顯著影響，主要表現(xiàn)在植物組織和器官生長(zhǎng)方面。生長(zhǎng)抑制是植物對(duì)逆境脅迫最直接的表現(xiàn)，也是評(píng)價(jià)植物耐性最直觀(guān)的指標(biāo)。本研究表明，接種3株促生細(xì)菌菌株后均促進(jìn)苜蓿的生長(zhǎng)，當(dāng)鹽堿濃度增加時(shí)，促生細(xì)菌表現(xiàn)出的促生效果更好。與向君亮等［13］的研究結(jié)果類(lèi)似，非鹽堿脅迫條件下接種耐鹽堿菌株S11后，苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、株高、根長(zhǎng)和葉綠素含量與對(duì)照相比并沒(méi)有顯著差異，但鹽堿脅迫條件下，接種S11處理后促進(jìn)了種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn)在無(wú)鹽堿脅迫時(shí)，僅JT4對(duì)苜蓿株高、分枝數(shù)、鮮重有顯著促進(jìn)作用，說(shuō)明菌株在正常生長(zhǎng)環(huán)境下對(duì)苜蓿的促生長(zhǎng)作用不明顯，可能是因?yàn)?株菌株分離自鹽堿環(huán)境，而正常處理時(shí)的環(huán)境不適宜菌株的生長(zhǎng)，沒(méi)有在幼苗根部定殖，從而未發(fā)揮促生長(zhǎng)作用。當(dāng)鹽堿濃度逐漸升高至200 mmol·L-1時(shí)，3株促生細(xì)菌對(duì)苜蓿的株高、分枝數(shù)和地上鮮重均有顯著促進(jìn)作用，消除了鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)的抑制作用，擴(kuò)寬了苜蓿在鹽堿脅迫下生長(zhǎng)的生態(tài)幅，增加了鹽堿地種植苜蓿的可行性。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期從大慶鹽堿土上生長(zhǎng)的堿蓬根內(nèi)（JG1）、莖內(nèi)（JJ5）和根際土壤內(nèi)（JT4）篩選出來(lái)的3株促生細(xì)菌處理鹽堿脅迫的紫花苜蓿，說(shuō)明菌株對(duì)混合鹽堿具有良好的適應(yīng)能力，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿生理特性的影響

鹽堿脅迫下紫花苜蓿的SOD、POD活性和脯氨酸含量下降，MDA含量升高，對(duì)植株造成了嚴(yán)重傷害致使產(chǎn)量下降。植物的抗氧化酶系統(tǒng)可以有效清除植物體內(nèi)代謝活動(dòng)產(chǎn)生的活性氧以減少不同程度的氧化損傷。SOD是植物細(xì)胞清除氧自由基傷害的第一道防線(xiàn)，是生物體內(nèi)一種很重要的抗氧化酶類(lèi)，對(duì)于保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷有十分重要的作用，SOD活性可以不同程度地反映出植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗逆情況［22-23］。POD是植物在逆境條件下酶促防御的關(guān)鍵酶之一，與SOD和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）相互協(xié)調(diào)配合，以提高植物的抗逆性［24］。接種JG1、JT4、JJ5后苜蓿根系的SOD和POD活性均升高，減輕了鹽堿對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的不利影響。說(shuō)明3株促生細(xì)菌菌株誘導(dǎo)抗氧化酶（SOD和POD）活性，高活性的抗氧化酶與氧化應(yīng)激耐受性有關(guān)，植物的耐受性與抗氧化劑的產(chǎn)生有關(guān)。MDA一般作為植物逆境指標(biāo)，MDA含量的多少反映了膜損傷程度的大小，是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)之一［25］。高于150 mmol·L-1鹽堿脅迫下，接種堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌后可減弱根系MDA含量增加的趨勢(shì)，苜蓿損傷程度減小。脯氨酸含量被認(rèn)為是研究植物抗逆性的重要指標(biāo)，脯氨酸積累在逆境中對(duì)植物有保護(hù)作用［26］，經(jīng)堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌處理后苜蓿脯氨酸的含量升高，可見(jiàn)堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可以提高苜蓿的耐鹽堿脅迫能力。鹽堿土種植的紫花苜蓿接種促生細(xì)菌后，紫花苜蓿的脯氨酸含量顯著增加，MDA含量降低，抗氧化酶SOD、POD活性顯著增強(qiáng)，與紫花苜蓿株高和生物量的增加相對(duì)應(yīng)，表明促生細(xì)菌菌株可以通過(guò)增加保護(hù)物質(zhì)的積累和提高抗氧化酶的活性來(lái)緩解鹽堿脅迫對(duì)紫花苜蓿造成的影響［14］。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要物質(zhì)，苜蓿葉片光合特性、生理代謝和光合產(chǎn)物代謝的變化可共同影響植株生長(zhǎng)發(fā)育。接種促生細(xì)菌可增加促進(jìn)苜蓿幼苗光合色素和葉片葉綠素含量，導(dǎo)致光合能力增強(qiáng)，從而積累更多的有機(jī)物，同時(shí)運(yùn)輸?shù)降叵虏浚?7］，故本研究中添加3株菌株后苜蓿幼苗地上部和地下部生物量顯著增加，進(jìn)而提高紫花苜蓿的生產(chǎn)性能。說(shuō)明選用的3株堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌在促進(jìn)植物適應(yīng)逆境脅迫方面具有良好的應(yīng)用潛力，但對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿整個(gè)生長(zhǎng)周期的生長(zhǎng)和產(chǎn)量等的影響及其機(jī)理等方面還有待更進(jìn)一步的研究。目前高通量測(cè)序技術(shù)比較普及，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)通過(guò)借助高通量測(cè)序技術(shù)探索3株菌株促進(jìn)植物生長(zhǎng)及增強(qiáng)植物抗鹽堿性的作用機(jī)理。

3.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿的隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性綜合評(píng)價(jià)

植物耐鹽堿性是由多種因素間的交互影響及協(xié)同作用而決定的，選取單一指標(biāo)進(jìn)行耐鹽堿性評(píng)定具有一定的局限性。因此本研究采用模糊隸屬函數(shù)及主成分分析法綜合評(píng)價(jià)促生細(xì)菌對(duì)苜蓿的耐鹽堿性影響。通過(guò)生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)共9個(gè)成分進(jìn)行主成分分析并結(jié)合隸屬函數(shù)值排序，表明不同促生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿促生效果為JT4＞JG1＞JJ5。從堿蓬根內(nèi)篩選的促生細(xì)菌JG1和從堿蓬根際土壤篩選的JT4對(duì)緩解苜蓿耐鹽堿性效果優(yōu)于從莖內(nèi)篩選的JJ5。由于土壤和植物根內(nèi)微環(huán)境比莖內(nèi)復(fù)雜，微生物通過(guò)復(fù)雜的環(huán)境選擇壓力而存活，因此根際細(xì)菌比植物內(nèi)生細(xì)菌效果好。而高潔云［28］發(fā)現(xiàn)根際中的細(xì)菌其ACC脫氨酶活性高于植物體內(nèi)的細(xì)菌，能提高植物的抗鹽性，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。JG1和JJ5屬于沙雷氏桿菌，謝金宏［29］研究了水稻（Oryza sativa）根際微生物對(duì)改良鹽堿地的作用，發(fā)現(xiàn)在沙雷氏桿菌的作用下，鹽堿土地的pH有所降低，土壤有機(jī)質(zhì)含量增加，是因?yàn)槠浞置谖飵锥≠|(zhì)酶可以分解土壤中昆蟲(chóng)骨骼的幾丁質(zhì)，從而增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量和降低了土壤pH。促生細(xì)菌JT4屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景，一些寡養(yǎng)單胞菌屬菌株可以分泌合成抵抗致病性的酶，降低植物患病的概率［30］，單胞菌屬菌含有重金屬抗性基因，對(duì)重金屬有強(qiáng)耐受性和強(qiáng)還原力，以及對(duì)氯化農(nóng)藥有強(qiáng)降解能力［31］，因此可以提高植物的抗性。

4 結(jié)論

3株促生細(xì)菌均能緩解鹽堿脅迫對(duì)紫花苜蓿的抑制作用，促進(jìn)紫花苜蓿生長(zhǎng)，不同促生細(xì)菌對(duì)鹽堿脅迫下苜蓿促生效果為JT4＞JG1＞JJ5。