朱巧艷，李叢叢，肖亞朋，賈然潔，高彬文，趙坤坤，張盼濤*

（1. 洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南 洛陽 471000；2. 北京中科基因技術股份有限公司，北京 102600）

我國是世界上養(yǎng)禽大國，疫病的發(fā)生與流行是制約我國家禽養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵因素之一，同時對食品安全、生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害。科學有效地防控畜禽疫病是我國養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大需求。2022年上半年洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司對我國主要家禽養(yǎng)殖地區(qū)送檢樣品進行疫病的檢測診斷或感染狀態(tài)監(jiān)測，對檢測結果進行總結分析。該檢測結果對我國家禽疫病流行趨勢分析、疫病防控策略的制定提供臨床數(shù)據(jù)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料與試驗動物

2022年1～6月，洛陽中科基因檢測的雞、鴨、鵝組織病料樣品主要來自于遼寧、山東、河南、河北、江蘇、湖北、山西、江西、廣東和廣西等主要家禽養(yǎng)殖地區(qū)。

SPF雞種蛋購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，由洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司孵化至適宜日齡用于H9亞型AIV、IBV和IBDV的分離。

1.2 主要試劑和引物

磁珠法核酸提取試劑盒，購自濟凡生物科技（北京）有限公司；PCR和RT-PCR相關試劑購自北京全式金生物技術股份有限公司；引物合成和基因測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究中使用的PCR和RT-PCR鑒定引物，以及病原目的基因擴增引物，由洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司參考世界動物衛(wèi)生組織、中華人民共和國國家標準、中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準進行合成、保存。

1.3 病料處理與分子鑒定

針對病毒性疫病，根據(jù)檢測項目選取對應的組織，按文獻報道的方法將組織剪碎后研磨成勻漿，按照1:5的比例加入含雙抗（青霉素 10 000 U/mL、鏈霉素2 000 U/mL）的滅菌PBS，-20 ℃反復凍融3次后置于4 ℃作用4 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，-20 ℃保存[1]。取200μL上清液，按照磁珠法核酸提取試劑盒說明書，利用全自動核酸提取儀進行核酸提取。對提取后的核酸按照洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司建立的方法，對病料樣品進行病原分子鑒定。

1.4 病毒分離與遺傳進化分析

對1.3中分子鑒定為陽性的H9亞型AIV、IBV、IBDV病料研磨離心獲得的上清液接種SPF雞胚進行病毒分離。H9亞型AIV和IBV病毒分離時，按文獻報道的方法將上清液按照0.2 mL/枚的劑量，尿囊腔途徑接種9～11日齡的SPF雞胚，置于37 ℃孵化箱孵育觀察至120 h，收獲接種后24～120 h死亡雞胚及120 h存活雞胚的尿囊液[1-2]。IBDV病毒分離時，接種途徑為雞胚絨毛尿囊膜，接種后棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收獲接種后24～120h死亡雞胚及120 h存活雞胚的尿囊液、絨毛尿囊膜，-20 ℃反復凍融3次后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液[3]。

對分離的H9亞型AIV、IBV和IBDV病毒按前述方法提取核酸，分別擴增HA基因全長、S1基因、VP2基因，RT-PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，使用Lasergene軟件對測序結果進行處理和編輯。根據(jù)GenBank上發(fā)表的相關毒株序列，使用Mega 6.0軟件分別對HA基因、S1基因、VP2基因進行遺傳進化分析。

1.5 細菌分離與鑒定

針對分離的不同致病菌采集對應的樣品，按常規(guī)無菌操作劃線接種于TSA和麥康凱平板，5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察結果。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察形態(tài)[4]。形態(tài)學無法確定細菌種、屬時，進一步通過生化鑒定或16s基因測序進行確定。

1.6 腫瘤性疾病的病理組織學觀察

針對腫瘤性疾病，結合臨床癥狀選擇對應的組織臟器，按照常規(guī)方法進行取材固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片烤片、脫蠟染色等步驟進行HE染色、觀察，確定腫瘤性疾病的種類[5]。

2 結果與分析

2.1 雞病毒病檢測結果

2022年1～6月共檢測送檢的雞病料6 087份，開展H9亞型AIV、IBV等17種病原的檢測。送檢樣品中，檢測樣品數(shù)量最多的病原分別為雞白血?。ˋLV）、H9亞型AIV、IBV、雞新城疫病毒（NDV）、I群禽腺病毒（FAdV-I）和雞傳染性貧血病毒（CIAV），而檢出率最高的病原分別為IBV、雞馬立克氏病病毒（MDV）、IBDV、H9亞型AIV、CIAV、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV），陽性率分別為41.03%、39.08%、25.00%、20.36%、20.31%、18.29%。FAdV-I、禽呼腸孤病毒（ARV）、REV雖有一定的送檢量，但檢測陽性率均小于10%。而禽腦脊髓炎病毒（AEV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）、雞痘病毒（FPV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）2022年上半年送檢量較少，并且檢測均為陰性。上述檢測結果表明，由IBV、H9亞型AIV、ILTV引起的呼吸道疫病和由CIAV和IBDV引起的免疫抑制病依然是目前雞群疫病防控的重點和難點。MDV檢測的陽性率高達39.08%，結合樣品背景和陽性樣品Meq基因測序結果，這些陽性樣品中26/34（76.47%）為疫苗株，說明目前臨床中使用的MDV相關活疫苗整體防控效果較為理想。

另外，樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，禽偏肺病毒（aMPV）和禽戊型肝炎病毒（aHEV）雖有一定的送檢量，但均未檢出。該檢測結果與相關文獻報道的高抗體陽性率不一致[6，7]。分析原因，可能是aMPV和aHEV單獨感染引起的癥狀較輕微，需要與其它病原混合感染才能表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，此時采樣檢不出或檢出率極低[8-10]。針對這兩種疫病，目前沒有商品化的疫苗可以使用，應做好生物安全防控。 2022年上半年雞病毒檢測結果統(tǒng)計見表1。

表1 2022年上半年雞病毒檢測結果統(tǒng)計

2.2 H9亞型AIV、IBV和IBDV遺傳進化分析

對2022年上半年分離的H9亞型AIV、IBV、IBDV進行測序，測序的靶基因分別為HA基因、S1基因、VP2基因，根據(jù)測序結果構建進化樹進行遺傳進化分析。

對55株H9亞型AIV的HA基因進行測序，HA基因核苷酸遺傳進化分析結果表明，55/55均屬于歐亞譜系的h9.4.2.5分支，其中54/55屬于9.4.2.5a分支毒株，1/55屬于9.4.2.5b分支毒株，表明9.4.2.5分支毒株為目前臨床優(yōu)勢流行毒株，與文獻報道一致[11-12]。分離株遺傳進化分析見圖1。55株分離株之間的同源性為91.5%～100%，而與國內(nèi)常用的疫苗株SS株和F株之間的同源性均較低，僅為86.7%～89%，核苷酸的突變會導致氨基酸的變化，表明現(xiàn)有疫苗對雞群的免疫保護效果有限，在持續(xù)的免疫壓力下，促使H9亞型AIV病毒不斷的發(fā)生變異。

圖1 2022年上半年H9亞型AIV分離株HA基因遺傳進化分析（三角標記為本研究分離毒株）

對41株IBV的S1基因進行測序，遺傳進化分析結果表明，29/41屬于QX-Like分支毒株，6/41屬 于4/91-Like分 支 毒 株，4/41屬 于Mass-Like分支毒株，1/41屬于TW Ⅰ型分支毒株，1/41屬于基因Ⅵ型分支毒株，QX型IBV依然是優(yōu)勢流行分支，其次為4/91-Like和Mass-Like型分支毒株，與現(xiàn)有文獻報道基本一致[13]。分離株遺傳進化分析見圖2。臨床中多種IBV基因型共同流行，商品化的活疫苗也有多種，但IBV基因型之間交叉保護效果有限，個別基因型活疫苗存在安全性隱患，使用時應慎重。針對IBV的防控，臨床生產(chǎn)數(shù)據(jù)表明，采用安全性好的IBV活疫苗進行基礎免疫，利用滅活疫苗進行加強免疫的策略可取得良好的免疫效果。

圖2 2022年上半年IBV分離株S1基因遺傳進化分析（三角標記為本研究分離毒株）

對分離的14株IBDV VP2基因進行測序，遺傳進化分析結果表明，12/14屬于變異株，2/14屬于超強毒株[14]，分離株遺傳進化分析見圖3。針對IBDV的防控，目前有商品化的全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、重組病毒活載體疫苗、致弱活疫苗和抗原抗體復合物，從臨床應用效果來看，這些疫苗對超強毒株和經(jīng)典株的防控效果較為理想，但是針對變異株并未能提供有效保護，建議養(yǎng)殖企業(yè)選用針對變異株保護效果更佳的疫苗。

圖3 2022年上半年IBDV分離株VP2基因遺傳進化分析（三角標記為本研究分離毒株）

2.3 水禽病毒病檢測結果

2022年1～6月本實驗室共檢測送檢的水禽病料262份，開展鴨圓環(huán)病毒（DuCV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）等8種病原的檢測。送檢樣品中，檢測樣品數(shù)量最多的病原分別為H9亞型AIV、NDRV、DHAV、ASTV，而檢出率最高的病原分別為DuCV、DTMUV、鴨病毒性肝炎病毒（DHAV）、鵝/番鴨細小病毒（GPV/MDPV）、鵝星狀病毒（GoAstV），陽性率分別為57.14%、40.00%、30.30%、26.32%、17.65%，這幾種病毒病依然是長期困擾水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病，見表2。

表2 2022年上半年水禽病毒病檢測結果統(tǒng)計

2.4 家禽細菌病檢測結果

2022年上半年，本實驗室對送檢禽病樣品1 085份進行了大腸桿菌、副雞禽桿菌、沙門氏菌、滑液囊支原體、雞毒支原體、鴨疫里默氏桿菌等病原的檢測（表3），其中大腸桿菌、沙門氏菌、副雞禽桿菌、滑液囊支原體、雞毒支原體、鴨疫里默氏桿菌的檢測量較大，且大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、滑液囊支原體檢出率較高，需重點關注；雖然鏈球菌與葡萄球菌的送檢量不太大，但是檢出率均為100%需特別關注，詳見表3。細菌性疫病有其地方流行性，因此要結合本地的流行情況提前做好防控。

表3 常見細菌病檢測結果統(tǒng)計

2.5 腫瘤病診斷結果

家禽的腫瘤病主要為網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病、禽白血病和馬立克氏病，對于這些腫瘤病來講，常規(guī)的病毒學和血清學方法在臨床診斷中缺少價值，主要采用病理學的方法進行診斷。MDV感染可導致組織發(fā)生多種淋巴細胞浸潤，增生細胞為多形性的成熟或不成熟的淋巴細胞，H.E染色時淋巴細胞細胞核藍染。ALV感染主要引起大淋巴細胞、成紅細胞、成髓細胞、髓細胞不同形態(tài)聚積或浸潤，腫瘤細胞由聚集的大淋巴細胞組成，細胞多處于相同的發(fā)育階段，肝脾結節(jié)周圍有一層成纖維細胞樣細胞，髓細胞在H. E染色時表現(xiàn)為胞質紅染。而REV的典型病變?yōu)閷嵸|細胞壞死和網(wǎng)狀細胞增生?；贛DV、ALV、REV感染后引起的組織學差別可進行病理學鑒別診斷。

2022年上半年病理學腫瘤病診斷樣品301份，其中雞馬立克氏病48份，均未檢出；禽白血病檢測164份，陽性占比26.8%（44/164）；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥檢測89份，陽性占比25.8%（23/89）。禽腫瘤病的檢出率一直處于較高水平，對于腫瘤病的控制要從種源抓起，關于白血病及網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的凈化時刻不能放松[15]。

3 討論

2022年上半年實驗室檢測數(shù)據(jù)顯示，禽病毒性疾病檢出率較多的病原為H9亞型AIV、IBV、IBDV、CIAV、MDV和水禽的DHAV、DuCV、GPV/MDPV、NDRV。疫苗免疫是防控疫病的有效措施之一，病毒性疫病的防控應堅持“預防為主、防治結合”的策略。根據(jù)養(yǎng)殖場具體情況制定合理的免疫程序，同時應結合當?shù)貎?yōu)勢流行分支毒株選用抗原性匹配好的疫苗，避免盲目使用疫苗。某些種類的活疫苗免疫后副反應大，疫苗毒株安全性較差，免疫后帶毒時間長，存在毒力返強的風險，因此應慎重選擇活疫苗。同類型的活疫苗不易混合使用，避免毒株之間基因重組，形成新的流行毒株。

為了保證食品安全，避免抗生素濫用導致的日益嚴峻的細菌耐藥性問題，我國近年來出臺了一系列減抗、限抗、禁抗相關政策。這就要求針對細菌性疾病的診斷檢測必須準確，結合藥敏試驗的結果聯(lián)合用藥進行防控。飼養(yǎng)過程中應加強設施建設、優(yōu)化飼養(yǎng)環(huán)境，避免或降低應激反應，做好環(huán)境的消毒、強化衛(wèi)生條件，做好飲水和飼料檢測，避免病從口入。同時，做好病毒性疫病的防控，降低繼發(fā)細菌病的風險。

由ALV、REV、MDV引起的腫瘤性疫病嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，這三種腫瘤性疾病世界各地均有流行。疫苗免疫是迄今為止預防MD的有效措施之一，免疫效果好，成本低。AL和RE目前尚無有效的疫苗和治療方法，須從種雞群凈化入手。另外，對活疫苗應加強檢測，避免因為疫苗污染外源病毒導致這三種腫瘤性疾病的流行。

臨床流行的諸多疫病，目前仍然無商品化疫苗可應用于臨床，應加強禽群飼養(yǎng)管理和清潔、消毒、墊料管理等生物安全管理，及時淘汰感染動物，防止疫病擴散、流行。