吉 祥，宋志成，韋曉玲，楊 煜，隋炯明，郭寶太

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東省旱作農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，山東 濟(jì)南 250100)

馬鈴薯是重要的糧菜兼用的作物，病毒侵染可導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的明顯下降，病毒病危害的防治是馬鈴薯生產(chǎn)的基本要求。通過莖尖培養(yǎng)結(jié)合嚴(yán)格的病毒檢測可獲得高質(zhì)量脫毒種薯，而脫毒種薯的利用是防治馬鈴薯病毒危害的有效手段。莖尖培養(yǎng)脫毒的具體方法有多種，病毒檢測的主要方法是血清學(xué)方法與分子生物學(xué)方法[1]。

馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleafrollvirus，PLRV)與S病毒(PotatovirusS，PVS)是2種危害馬鈴薯的主要病毒。PLRV是馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的代表成員，病毒粒體為球狀等軸對稱結(jié)構(gòu)，其侵染可導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至達(dá)到80%，但通過莖尖培養(yǎng)脫除PLRV比較容易。PVS是香石竹潛隱病毒屬 (Calavirus)的成員，病毒粒體為線條狀，PVS單獨(dú)侵染造成的產(chǎn)量損失為10%～20%，但與馬鈴薯X病毒(PVX)混合侵染可造成更嚴(yán)重的危害[2]。PVS是世界馬鈴薯產(chǎn)區(qū)廣泛分布的病毒，脫除非常困難，脫毒種薯種植后容易再次感染病毒。脫毒種薯生產(chǎn)、利用中針對PLRV與PVS的檢測都非常必要。

酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immuosorbent assay，ELISA)是植物病毒檢測的基本方法，1977年Casper首先將該法用于馬鈴薯病毒檢測，雙抗體夾心(DAS)ELISA具有操作簡單、特異性強(qiáng)及靈敏度高的特點(diǎn)，可以有效地用于馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)與利用中的病毒檢測[3]。

利用馬鈴薯病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)基因原核表達(dá)的重組CP作抗原可以制備馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)，陸續(xù)有成功的報(bào)道。由于PLRV-CP基因原核表達(dá)困難，Plchova等[4]采用有利于精氨酸稀有密碼子表達(dá)的特殊受體菌才實(shí)現(xiàn)了該基因的有效表達(dá)并將重組CP抗血清(抗體)用于PLRV的間接ELISA檢測。王韜遠(yuǎn)等[5]通過改造PLRV-CP基因的密碼子，實(shí)現(xiàn)了該基因的原核表達(dá)并利用重組CP制備出了高效價(jià)PLRV特異性抗血清(抗體)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室采用刪除PLRV-CP基因中抑制表達(dá)序列的策略實(shí)現(xiàn)了該基因的高效原核表達(dá)[6]，并將制備的重組CP多克隆抗體與酶標(biāo)抗體用于PLRV的DAS-ELISA檢測[7]。2004年李廣存等[8]克隆了PVS-CP基因，利用重組CP制備出了PVS特異性抗血清(抗體)并應(yīng)用于ELISA檢測，但針對PVS只見到這一例研究結(jié)果。利用重組CP制備馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)將為我國包括PLRV與PVS在內(nèi)的馬鈴薯病毒抗血清(抗體的)大量制備及ELISA試劑盒的國產(chǎn)化提供有力的技術(shù)支撐。用一種重組CP制備的抗體只能檢測一種病毒，這是其局限性。

本研究的目的是通過原核表達(dá)PLRV-CP基因與PVS-CP基因序列形成的融合基因，獲得高純度PLRV與PVS重組雙CP，并將重組雙CP多克隆抗體用于PLRV與PVS這2種病毒的間接ELISA檢測與DAS-ELISA檢測，旨在為提高脫毒種薯病毒ELISA檢測效率、降低檢測成本奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

本研究于2016—2020年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室完成。

1.1 質(zhì)粒與菌種

馬鈴薯卷葉病毒CP基因原核表達(dá)載體pET22b-LRCP及PVS-CP基因克隆載體pMD18-SCP由本研究室構(gòu)建，大腸桿菌DH5α與BL21菌株由本研究室保存。

1.2 主要試劑與試劑盒

限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、T4DNA連接酶及DNA Marker購自大連寶生物公司。質(zhì)粒DNA小量提取及DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素、IPTG、細(xì)菌總蛋白提取試劑、SDS-PAGE試劑、蛋白Marker、羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗、ELISA酶標(biāo)板、透析膜等購自上海生工公司。金屬離子親和層析柱(HiTrap Chelating HP)、抗體純化柱(HiTrap Protein G HP)購自GE Healthcare公司。馬鈴薯Y病毒(PVY)、A病毒(PVA)、M病毒(PVM)及PLRV、PVS、PVX等6種主要病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物與陰性標(biāo)準(zhǔn)物購自美國Agdia公司。

1.3 PLRV與PVS融合雙CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用Hind Ⅲ與XhoⅠ酶切質(zhì)粒pMD18-SCP，回收含有PVS-CP基因序列的DNA片段，并將該片段定向插入到pET22b-LRCP中PLRV-CP基因下游，構(gòu)建出了PLRV與PVS融合雙CP基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定與DNA測序確認(rèn)表達(dá)載體的正確性，該表達(dá)載體命名為pET22b-LRCP/SCP。

1.4 融合雙CP基因原核表達(dá)的誘導(dǎo)

將重組菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，取200 μL活化的菌液接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600值達(dá)到0.5～0.8。固體與液體LB培養(yǎng)基中氨芐青霉素含量均為100 μg/mL。取出1 mL菌液加入EP管中繼續(xù)培養(yǎng)作為未經(jīng)誘導(dǎo)的對照，向剩余的菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h后，SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。

1.5 菌體蛋白的提取與重組雙CP的純化

菌體蛋白的提取采用了2種方法：溶菌酶法與超聲破碎法。溶菌酶法中，用裂解液(150 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl)懸浮菌體，用溶菌酶裂解菌體，加PMSF至終濃度為1 mmol/L抑制蛋白酶活性，加DNase Ⅰ降解細(xì)菌DNA，最后獲得包涵體，具體方法見隋炯明等[6]的描述。超聲破碎法中，每50 mL菌液離心獲得的菌體用4 mL預(yù)冷的0.1 mmol/L的PBS緩沖液懸浮，冰上用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(新芝JY92-ⅡN)超聲破碎18個循環(huán)后，放置3 min，再繼續(xù)超聲破碎。超聲破碎參數(shù)：100%振幅，3 s運(yùn)行，6 s停止，35個循環(huán)。4 ℃ 10 000 r/min 離心45 min獲得包涵體蛋白。

2種方法獲得的包涵體都用含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，30 mmol/L咪唑，pH值7.5)溶解。溶解液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用1 mL的鎳離子親和層析柱純化，上樣與洗滌后利用洗脫液(20 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L咪唑，pH值7.5)洗脫并收集目的蛋白。

重組雙CP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、提取與純化的結(jié)果通過SDS-PAGE檢測確認(rèn)。蛋白樣品的制備方法是：取未經(jīng)誘導(dǎo)與誘導(dǎo)過的菌液各1 mL，12 000 r/min離心2 min，棄上清，菌體沉淀用40 μL 1×上樣緩沖液懸??；分別取包涵體懸浮液、目的蛋白純化溶液20 μL，加入5 μL 5×上樣緩沖液并混勻。上述混合液均煮沸處理10 min，冷卻后4 ℃靜置5 min，取10 μL上清點(diǎn)樣。經(jīng)洗脫獲得的高純度重組雙CP溶液先用不同濃度尿素的PBS透析，再用PEG 6000粉末處理濃縮，最后采用Bradford法進(jìn)行定量。

1.6 抗血清的制備及抗體的分離與純化

用高純度重組雙CP作抗原免疫新西蘭大白兔制備抗血清，效價(jià)測定采用間接ELISA法，抗血清制備由上海生工公司完成。采用飽和硫酸銨沉淀法從抗血清中分離多克隆抗體(IgG)，抗體粗分離物用1 mL Protein G親和層析柱純化。用10 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L Na3PO4，pH值7.0)洗滌，最后用1.5 mL洗脫液(0.1 mol/L Glycine-HCl，pH值2.7)洗脫收集抗體，并用緩沖液(1 mol/L Tris-HCl，pH值8.8)中和，中和后的抗體可直接用于間接ELISA測定，經(jīng)過透析后才可以進(jìn)行酶標(biāo)記。

1.7 重組雙CP抗體活性與特異性的測定

重組雙CP多克隆抗體與PLRV、PVS反應(yīng)活性的測定采用間接ELISA法。具體步驟是：用抗原提取緩沖液(0.01 mmol/L Na2SO3，2% PVP-4000，0.2% BSA，2% Tween-20的PBS，pH值7.4)溶解病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)物制成抗原包被工作液，以病毒陰性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔作為陰性對照，以抗原提取緩沖液為空白對照，每反應(yīng)孔加100 μL包被酶標(biāo)板，37 ℃培育2 h。甩去抗原包被工作液，用PBST洗板，每孔加200 μL，靜置3 min后甩去，洗板3次。在濾紙上甩干反應(yīng)孔，用3% BSA封閉，每孔加200 μL，37 ℃孵育1.5 h。甩去封閉液，洗板方法同上。用抗體包被緩沖液稀釋純化的多克隆抗體，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h，甩去抗體稀釋液后洗板。用酶標(biāo)抗體緩沖液按照1∶2 000稀釋酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-AP)制成酶標(biāo)抗體工作液，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，甩去酶標(biāo)抗體工作液后洗板。配制TMB顯色工作液，每孔加100 μL，靜置3～5 min，最后加入100 μL硫酸終止反應(yīng)。目測顯色結(jié)果，并用BioTek公司Elx800型酶標(biāo)儀測定OD450吸收值，用樣品孔OD450≥2.5倍陰性孔OD450作為陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

同樣用上述間接ELISA方法測定重組雙CP多克隆抗體與6種馬鈴薯主要病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)物的反應(yīng)特異性，為了增強(qiáng)反應(yīng)信號，重組CP多克隆抗體按照1∶500比例稀釋，酶標(biāo)二抗(羊抗兔IgG-AP)按照1∶1 000的比列稀釋。

1.8 抗體的酶標(biāo)記

重組雙CP多克隆抗體(IgG)的堿性磷酸酶標(biāo)記采用戊二醛一步反應(yīng)法，酶標(biāo)抗體活性的測定采用直接ELISA法?？寡逯苽?、抗體的分離與酶標(biāo)記以及酶標(biāo)抗體活性測定的具體方法見參考文獻(xiàn)[7，9]。

1.9 PLRV與PVS的DAS-ELISA檢測

以免疫前抗血清為陰性對照(陰性對照1)，以抗原提取緩沖液為空白對照，重組CP(1 μg/mL)作為陽性對照，病毒陰性物作為抗原的陰性對照(陰性對照2)。多克隆抗體按照1∶100、1∶200與1∶300的比例用抗體包液稀釋，每反應(yīng)孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。洗板后用BSA進(jìn)行封閉處理，37 ℃培育2 h。PLRV、PVS陽性標(biāo)準(zhǔn)物用抗原提取液稀釋后，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。最后用酶標(biāo)抗體緩沖溶液按1∶100的比例稀釋酶標(biāo)抗體(IgG-AP)，每個樣品孔內(nèi)加100 μL，37 ℃孵育2 h?？贵w包被、封閉、抗原結(jié)合以及酶標(biāo)抗體結(jié)合后都進(jìn)行甩去液體、洗滌與甩干反應(yīng)孔的處理，方法同1.6。配制pNPP底物顯色工作液，每孔加100 μL，室溫避光靜置10～20 min，然后每孔加入100 μL 的1 mmol/L的NaOH終止反應(yīng)，觀察顯色結(jié)果，并測定OD405吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLRV與PVS重組雙CP的原核表達(dá)及提取與純化

將含有PVS-CP基因序列的雙酶切片段定向插入pET22b-LRCP，構(gòu)建出了PLRV與PVS雙CP融合基因的原核表達(dá)載體，命名為pET22b-LRCP/SCP。Hind Ⅲ單酶切該表達(dá)載體的產(chǎn)物是一條DNA帶(圖1，泳道2)，Hind Ⅲ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物是2條DNA帶，其中小片段為PVS-CP基因(圖1，泳道3—4)，單、雙酶切片段數(shù)與大小都符合預(yù)期。測序結(jié)果表明，PLRV與PVS雙CP融合基因序列正確，大小為1 401 bp，其中PLRV-CP基因的序列(498 bp)在5′端、PVS-CP基因的序列(882 bp)在中間、3′端為載體的部分序列，載體構(gòu)建符合要求，上述498 bp的序列是缺失突變的PLRV-CP基因[6]。

M.DNA Marker 15000；1.表達(dá)載體pET22b-LRCP/SCP；2.質(zhì)粒pET22b-LRCP/SCP+HindⅢ(+)；3—4.質(zhì)粒pET22b-LRCP/SCP+Hind Ⅲ+Xho Ⅰ。

用溶菌酶裂解重組菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)，菌體蛋白及提取的包涵體蛋白中都有一條分子質(zhì)量約為51.2 ku的特異性蛋白條帶(圖2，泳道2—3)。采用試劑盒推薦的結(jié)合緩沖液與洗脫緩沖液，用鎳離子親和層析法純化包涵體蛋白溶解液，洗脫產(chǎn)物中有明顯的目的蛋白條帶(重組雙CP)，但也有明顯的雜蛋白條帶(圖2，泳道4)。

改用超聲波破碎菌體，提取的包涵體蛋白經(jīng)過溶解后，溶解液中目的蛋白條帶明顯，菌體蛋白相對含量很低(圖3，泳道3)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化產(chǎn)物只有清晰的目的條帶(圖3，泳道4—5)，也就是獲得了高純度的PLRV與PVS的重組雙CP。超聲波破碎菌體的同時(shí)也作用于包涵體，增加了它的可溶性，在結(jié)合緩沖液與洗脫液成分及洗滌、洗脫條件不變的情況下，提高了包涵體蛋白的得率與目的蛋白的相對含量，從而降低了目的蛋白純化難度、獲得了高純度重組雙CP。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的菌體；2.誘導(dǎo)后的菌體； 3.包涵體蛋白溶解液；4—5.純化的重組雙CP。 M.Protein Marker；1.Uninduced bacterial cell；2.Bacterial cell induced with IPTG；3.Dissolved inclusion body protein； 4—5.Purified recombinant double CP.

2.2 重組雙CP抗體的分離、純化及其活性與特異性的測定

間接ELISA測定表明，獲得了PLRV與PVS重組雙CP的高效價(jià)(1∶128 k)抗血清，抗血清中含有大量雜蛋白(圖4，泳道1)，飽和硫酸銨沉淀獲得的抗體粗分離物中雜蛋白去除非常明顯(圖4，泳道2)，經(jīng)Protein G純化獲得的抗體的重鏈與輕鏈帶型清晰，雜蛋白已很少(圖4，泳道3)，表明已獲得了高純度的重組雙CP多克隆抗體(IgG)。

用PLRV陽性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔、病毒陰性物作為陰性對照，間接ELISA測定顯示，陰性及空白對照不顯色，抗原包被孔顯色，且隨著抗體稀釋度的增加顏色變淺，結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體與PLRV呈特異性反應(yīng)。根據(jù)陽性標(biāo)準(zhǔn)判斷，純化抗體的稀釋度為1∶3 200時(shí)，純化抗體與PLRV仍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表1)。用PVS陽性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔，間接ELISA測定顯示，重組雙CP多克隆抗體與PVS也呈現(xiàn)特異性反應(yīng)，純化抗體稀釋度為1∶3 200時(shí)，純化的抗體與PVS也呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表2)。結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體與PLRV、PVS結(jié)合的特異性強(qiáng)、反應(yīng)活性高。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組雙CP抗血清； 2.分離的抗體；3. 純化的抗體。 M.Protein Marker；1.Antiserum against recombinant double CP； 2.Isolated IgG；3.Purified IgG.

在降低抗體稀釋度(1∶500)與酶標(biāo)二抗稀釋度(1∶1 000)的情況下，用6種馬鈴薯主要病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)物為抗原，間接ELISA反應(yīng)顯示，包被PVS或PLRV的反應(yīng)孔呈顏色反應(yīng)，包被其他4種病毒的反應(yīng)孔無顏色反應(yīng)(圖5)，并且OD值測定結(jié)果與目測結(jié)果一致。結(jié)果表明，本研究制備的重組雙CP多克隆抗體只與PLRV、PVS有特異性反應(yīng)，與其他4種病毒無交叉反應(yīng)，能夠滿足ELISA檢測的基本要求。

表1 PLRV與PVS重組雙CP多克隆抗體(IgG)活性的間接ELISA測定(PLRV陽性物，Tab.1 Activity determination of IgG against double CP of PLRV and PVS by indirect

表2 PLRV與PVS重組雙CP多克隆抗體(IgG)活性的間接ELISA測定(PVS陽性物，

綜合重組雙CP多克隆抗體特異性與活性測定結(jié)果，該抗體可用于PLRV的間接ELISA測定，也可用于PVS的間接ELISA測定，即同一種抗體可以用于PLRV與PVS兩種病毒的間接ELISA檢測。

2.3 PLRV與PVS的DAS-ELISA檢測

為了進(jìn)行DAS-ELISA反應(yīng)，先用堿性磷酸酶標(biāo)記純化后的重組雙CP多克隆抗體，直接ELISA測定表明，當(dāng)用PLRV陽性標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔且酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶800，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表3)；當(dāng)PVS病毒標(biāo)準(zhǔn)物包被反應(yīng)孔，酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶800，二者也呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表4)。結(jié)果表明，酶標(biāo)抗體與PLRV或PVS的結(jié)合特異性強(qiáng)、反應(yīng)活性高。

表3 PLRV與PVS重組雙CP抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物活性的直接ELISA測定(PLRV陽性物，

表4 PLRV與PVS重組雙CP抗體堿性磷酸酶標(biāo)記物活性的直接ELISA測定(PVS陽性物，

將制備的重組雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體用于DAS-ELISA檢測，其中重組CP多克隆抗體采用1∶100、1∶200與1∶300 3個稀釋度，酶標(biāo)抗體稀釋度按照1∶100。結(jié)果表明，陰性對照及空白對照孔無顏色反應(yīng)，加入PLRV或PVS的反應(yīng)孔及陽性對照孔有顏色反應(yīng)。OD測定結(jié)果表明，重組雙CP多克隆抗體在3個稀釋度下，以重組雙CP為抗原的陽性對照反應(yīng)孔中都呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表5)；當(dāng)雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體稀釋度都為1∶100，PLRV反應(yīng)孔呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，PVS反應(yīng)孔也呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(表5)。結(jié)果表明，來自本研究制備的同一種抗血清的重組雙CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體可用于PLRV的DAS-ELISA法的檢測，也可用于PVS的DAS-ELISA檢驗(yàn)，即一種抗體可檢測2種病毒，這為提高馬鈴薯脫毒試管苗及種薯中病毒ELISA檢測的效率及降低檢測成本奠定了基礎(chǔ)。

表5 PLRV與PVS陽性標(biāo)準(zhǔn)物的DAS-ELISA檢測Tab.5 DAS-ELISA detection of PLRV and PVS positive

3 討論

馬鈴薯病毒粒體分離純化困難導(dǎo)致了馬鈴薯病毒特異性抗血清制備的困難，這限制了我國馬鈴薯病毒抗血清的大量制備及其在ELISA檢測中的應(yīng)用。利用重組CP作抗原便成為馬鈴薯病毒特異性抗血清(抗體)制備的一條重要的技術(shù)途徑。除了上述PLRV與PVS外，國內(nèi)外陸續(xù)針對PVX、PVY重組CP多克隆抗體的制備研究很多，可有效地用于間接ELISA測定，只有Balogun 等[10]發(fā)表了PVX重組CP多克隆抗體順利地用于DAS-ELISA測定的結(jié)果及Jeevalatha等[11]發(fā)表了PVY重組CP多克隆抗體可用于PVY的DAS-ELISA檢測的結(jié)果。目前，針對PVA及PVM的研究在逐漸增多[11-14]，但PVA與PVM重組CP多克隆抗體制備的研究也局限于間接ELISA檢測[15-17]。達(dá)到DAS-ELISA檢測的要求，對于重組CP多克隆抗體在馬鈴薯病毒的ELISA檢測中的應(yīng)用至關(guān)重要。

本研究室進(jìn)行馬鈴薯重組CP多克隆抗體制備研究與應(yīng)用已經(jīng)多年，針對6種馬鈴薯主要病毒，利用單CP制備的抗體都能達(dá)到DAS-ELISA檢測的要求，目前只發(fā)表了PLRV與PVA[9]多抗的制備與應(yīng)用結(jié)果。本研究涉及重組雙CP抗體的制備及其應(yīng)用，是在PLRV與PVS單CP多抗及其酶標(biāo)抗體都達(dá)到DAS-ELISA測定要求的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。前期研究中用溶菌酶裂解菌體，利用試劑盒推薦的蛋白純化條件，都可以順利地獲得高純度重組CP，本研究采用了融合基因，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物分子量變大，純化難度明顯增大，主要表現(xiàn)為包涵體蛋白溶解困難，純化產(chǎn)物含有雜蛋白，重組雙CP溶解性降低很可能是肽鏈折疊方式不正確導(dǎo)致的。改用超聲破碎法裂解菌體，得到的包涵體可溶性明顯增加，溶解包涵體獲得的蛋白溶解液中目的蛋白濃度及其相對含量都有明顯提高，用同樣的純化條件就可獲得高純度重組雙CP；此法中提取影響到純化，實(shí)際上建立了獲得高純度重組雙CP的提取與純化一體化技術(shù)。同時(shí)制備的重組CP多克隆抗體可用PLRV及PVS為2種病毒的間接ELISA檢測，也可用于DAS-ELISA檢測，為進(jìn)一步提高脫毒種薯病毒ELISA檢測效率及降低檢測成本奠定了基礎(chǔ)。目前，用重組雙CP制備植物病毒多抗的報(bào)道還很少，2014年，Kapoor等[18]制備出了黃瓜花葉病毒(CMV)與番木瓜環(huán)斑病毒(PRV)重組雙CP多克隆抗體，可用于上述2種病毒的間接ELISA測定。同年，Kapoor等[18]還把截短的PVX與PVY融合雙CP基因進(jìn)行原核表達(dá)獲得了重組雙CP，制備的抗血清(抗體)可用于大田采集材料的間接ELISA檢測[19]。

將單克隆抗體用于植物病毒ELISA檢測是該檢測技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體已經(jīng)成功地用于PVS與PVM的ELISA檢測[20-21]，這是一個重要的發(fā)展方向。同時(shí)針對ELISA測定，特別是DAS-ELISA測定方法的改進(jìn)一直不斷，Rettcher等[22]用磁珠標(biāo)記抗體，將DAS-ELISA原理用于PVX快速的磁側(cè)向免疫層析檢測，Panferova等[23]利用酪胺擴(kuò)增酶反應(yīng)信號，提高了ELISA反應(yīng)的靈敏度，PVX的檢出量從100 ng/mL降低到3 ng/mL。梁雨欣等[24]將酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合后再加入包被抗體的反應(yīng)孔中，建立了檢測PVY的快速DAS-ELISA方法。作為植物病毒檢測方法，ELISA檢測仍呈現(xiàn)著巨大的應(yīng)用活力。