白寶清，賈槐旺，張錦華，李蘭，范三紅

(山西大學生命科學學院1，太原 030006) (特色植物資源研究與利用山西重點實驗室；山西大學2，太原 030006)

高脂血癥是一種由于脂肪轉(zhuǎn)運或代謝異常導致血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)過高，高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)降低的全身性代謝慢性疾病[1]，是誘發(fā)肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等常見代謝疾病的重要因素[2]。心血管疾病是由高脂血癥引發(fā)的一種疾病，致死率高，預計到2030年全球因心血管疾病死亡的人數(shù)將由2008年的1 730萬人飆升至2 330萬人[3]。目前，因其引發(fā)的并發(fā)癥而死亡的人數(shù)占到全球死亡率的一半，且這一比例還在逐年增加[3]。臨床上主要使用他汀類、膽酸螫合劑、貝特類、煙酸類等藥物治療高脂血癥，它們雖然具有清晰的作用機制和靶點，但使用這些藥物治療的同時會產(chǎn)生諸多副作用，例如容易引起胃腸等臟器損傷、產(chǎn)生皮膚過敏、肝臟毒性、腎功能受損等[4]。植物蛋白中含有具有生理活性的多肽物質(zhì)，目前已從多種植物蛋白中發(fā)現(xiàn)抗氧化肽、抗菌肽、降膽固醇肽、降血壓肽、免疫活性肽以及神經(jīng)活性肽。近年來動植物蛋白多肽的降脂療效及其抗氧化活性取得了一定的進展。魏連會等[3]通過動物實驗對火麻籽進行降血脂功能性研究，結(jié)果顯示火麻籽多肽能夠抑制高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的體質(zhì)量增長、降低肝臟指數(shù)、血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平降低，升高HDL-C水平，降低動脈硬化指數(shù)(AI)值；改善大鼠血流變學指標，降低大鼠的全血粘度和血漿黏度，表明火麻籽多肽具有良好的降血脂功效。賀東亮[5]通過檢測經(jīng)紫蘇籽肽PSP3c灌胃后小鼠血液和肝臟組織中MDA含量、GSH-Px和SOD活力了解PSP3c對小鼠抗氧化能力的影響，結(jié)果顯示紫蘇籽多肽PSP3c能夠保護機體免受自由基的攻擊，提高小鼠抗氧化能力。

紫蘇(Perillafrutescens(L.)Britt. )，為唇形科塔花族紫蘇屬一年生直立草本植物，屬我國衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源的60種中藥之一[6,7]，紫蘇籽、根莖、葉富含的多種活性物質(zhì)具有抗過敏、抑菌、消炎、降血脂、抗氧化、預防細胞衰老癌變等作用[8]。紫蘇籽粕是紫蘇籽榨油后的殘留物，紫蘇籽粕蛋白質(zhì)量分數(shù)為28%～45%[9]。紫蘇籽粕蛋白富含有紫蘇籽特有的各種營養(yǎng)成分，氣味優(yōu)良，適口性好，不存在對人體有害的成分；紫蘇籽粕蛋氨基酸組成豐富，共含有18種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，是氨基酸種類齊全的完全蛋白質(zhì)[10]。紫蘇籽粕不僅含有紫蘇蛋白和紫蘇油所具有的營養(yǎng)物質(zhì)和保健功能，還含有大量的膳食纖維，對多種球菌、桿菌具有抑制作用，還可以預防多種腸道疾病發(fā)生[11,12]。目前已有學者對紫蘇籽蛋白的理化性質(zhì)、功能性質(zhì)及其純化肽的抗氧化、抗腫瘤進行了研究[5]，但關于紫蘇籽多肽在降血脂方面的研究很少有相關報道。

本研究采用前期已優(yōu)化蛋白提取工藝和蛋白酶酶解工藝制備紫蘇籽粕蛋白及紫蘇籽粕蛋白酶解物，通過超濾法、DEAE-32離子交換層析以及Sephadex G-25凝膠層析對酶解物進行分離純化，并研究分離純化后紫蘇籽粕活性肽的降血脂及抗氧化功效，為紫蘇籽粕蛋白的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽粕、堿性蛋白酶(2.0×104U/g)、鄰苯三酚、DPPH、ABTS、DEAE-32、Sephadex G-25、乙腈、胰酶、甲酸、碳酸氫銨、尿素、辛伐他汀等試劑均為分析純。

SPF級昆明小鼠54只，體重(24±2) g，由北京市昌揚西養(yǎng)殖場提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010；基礎飼料由中國輻射防護研究院提供；高脂飼料、血脂四項試劑盒(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒。

1.2 儀器與設備

SK-1030超聲波清洗儀，868 pH測試儀，SP-2000UV紫外可見分光光度計，SCIENTZ-12N冷凍干燥機，BS-100A自動部分收集器，HD-21-1核酸蛋白檢測儀，TH-100梯度混合器，BT-100數(shù)顯蠕動泵，Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-Q Exactive 液質(zhì)聯(lián)用儀，MR23i低溫冷凍離心機，JXFSTPRP-CL高通量多樣品組織研磨機，Spectra MaxM5酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫蘇籽粕蛋白的制備

紫蘇籽粕→去雜、粉碎、脫脂、過篩→蒸餾水配制成一定料液比(1∶20)→調(diào)節(jié)pH(10)→超聲提取20 min→離心機去渣→取上清液調(diào)節(jié)pH為等電點(4.2)→離心→蛋白質(zhì)沉淀→真空冷凍干燥→密封低溫保存。

1.3.2 紫蘇籽粕蛋白酶解產(chǎn)物的制備

以超聲提取制備的紫蘇籽粕分離蛋白為原料，參考賀東亮[5]的方法并做適當調(diào)整。選用堿性蛋白酶進行酶解，酶解工藝條件為：底物質(zhì)量分數(shù)3%、pH9.5、酶解溫度60 ℃、酶質(zhì)量分數(shù)7%、酶解時間4 h。酶解結(jié)束后經(jīng)沸水浴10 min滅活，4 500 r/min離心10 min，取上清液即為紫蘇籽粕分離蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.3 超濾法分離抗氧化活性肽

使用裝有截留分子質(zhì)量為3、5、10 ku的聚醚砜超濾膜，在二氧化碳壓力為2.5×104Pa下依次對紫蘇籽粕分離蛋白酶解液進行超濾，得到分子質(zhì)量分別為<3 ku、3～5 ku、5～10 ku以及>10 ku的4種不同分子質(zhì)量段的超濾組分，真空冷凍干燥以測定抗氧化活性，獲得抗氧化活性最強的紫蘇籽粕多肽超濾組分[12]。

1.3.4 DEAE纖維素DE-32離子交換層析分離抗氧化活性肽

將抗氧化活性最強的多肽超濾組分，利用DEAE纖維素DE-32離子交換層析繼續(xù)分離純化，選用20 mm×400 mm規(guī)格層析柱，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8)的緩沖液平衡柱床，上樣量3 mL，用0～1 mol/L NaCl平衡緩沖液進行梯度洗脫，流速為1.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。將所得分離組分冷凍干燥以測定抗氧化活性，篩選出抗氧化活性最好的組分用于后續(xù)凝膠色譜的分離純化。

1.3.5 凝膠色譜Sephadex G-25分離抗氧化活性肽

使用凝膠色譜Sephadex G-25繼續(xù)分離純化經(jīng)離子交換層析分離獲得的抗氧化活性最好的多肽組分，選用16 mm×300 mm規(guī)格層析柱，洗脫條件為：用100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)的平衡緩沖溶液，上樣量3 mL，洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測波長220 nm。分離純化后的組分冷凍干燥以測定其抗氧化活性，將抗氧化能力最強的組分進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.6 紫蘇籽粕抗氧化肽氨基酸序列質(zhì)譜分析1.3.6.1 蛋白酶切

蛋白液加4 μL 0.05 mol/L TCEP 溶液，60 ℃反應1 h；還原后，加入2 μL 55 mmol/L MMTS溶液，室溫避光45 min；將蛋白液加入10 ku 超濾管，12 000 g離心20 min；加入100 μL UA(8 mol/L尿素pH 8.5)溶液，12 000 g離心20 min,離心2次；加入100 μL 0.25 mol/L TEAB,12 000 g離心20 min，重復3次；加入50 μL 0.5 mol/L TEAB，加入2%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50)，37 ℃孵育過夜(12 h)；次日補加1%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100)，37 ℃孵育4 h；更換新的收集管，離心收集濾液，低溫真空抽干[13]。

1.3.6.2 質(zhì)譜鑒定

肽段用樣品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解，13 200 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，進行質(zhì)譜鑒定；液相參數(shù)：捕集柱：Acclaim PepMap RSLC C18(300 μm×5 mm, 5 μm, 10 nm)；分析柱：Acclaim PepMap C18(75 μm×150 mm, 3 μm，10 nm)；流動相A：0.1%甲酸、流動相B：0.1%甲酸，80%CAN、流速：300 nL/min；梯度分離：B相從5%上升至90%(0 min～5%、5 min～5%、45 min～50%、50 min～90%、55 min～90%、65 min～5%)。分離后的肽段直接進入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive進行在線檢測，具體參數(shù)如下：一級質(zhì)譜參數(shù)，分辨率：70 000、AGC：目標3e6、最大噴射時間：40 ms、掃描范圍：350～1 800m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)，分辨率：17 500、AGC 目標：1e5、最大噴射時間：60 ms、TopN ：20、NCE/stepped NCE：27。

1.3.7 動物分組及給藥處理

SPF級昆明種雄性小鼠54只，隨機分配6個鼠盒，基礎飼料飼養(yǎng)，自由飲食，環(huán)境溫度 22～25 ℃，相對濕度40%～60%，適應性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為6組，每組9只，具體分組及給藥方法見表1，連續(xù)飼養(yǎng)4周，每2天換1次墊料，小鼠的給藥劑量由實驗室前期藥效學動物實驗得出的灌胃劑量確定。

表1 動物分組及飼料、灌胃條件

1.3.8 血清和組織樣品制備

實驗最后1次給藥后斷食不斷水12 h，用巴比妥鈉將小鼠麻醉，眼底取血，低溫冷凍離心機離心分離血清(15 min，4 500 r/min)，取上清液，于-20 ℃下儲存在EP試管中備用。取血后頸椎脫臼處死，解剖摘取肝臟組織，用生理鹽水沖洗掉肝臟表面殘留的血跡，用濾紙吸干多余生理鹽水后稱重、記錄。精確稱取1 g肝臟組織，加入9 mL生理鹽水進行勻漿，低溫冷凍離心機離心取上清液(15 min，4 500r/min)，-20 ℃保存用于測定生理生化指標。

1.3.9 小鼠體重及肝臟指數(shù)測定

實驗期間，每周定時記錄小鼠體重。解剖前，稱量并記錄各小鼠體重，處死后取臟器并準確稱重，并根據(jù)式(1)計算肝臟指數(shù)。

(1)

1.3.10 小鼠體內(nèi)抗氧化及降血脂水平測定

取制備好的小鼠血清及肝臟組織勻漿上清，使用酶標儀和科研試劑盒測定肝組織勻漿中GSH-Px、SOD、CAT 活力和 MDA含量；測定小鼠血清中TG、TC、HDL-C 和 LDL-C 含量。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾分離組分的抗氧化性分析

注：以0.2 mg/mL的質(zhì)量濃度測DPPH自由基清除活性，以1 mg/mL的質(zhì)量濃度測自由基清除能力和還原力，余同。圖1 紫蘇籽粕蛋白酶解液和超濾分離級分的抗氧化活性

2.2 DEAE纖維素DE-32離子交換層析分離純化紫蘇籽粕抗氧化肽

圖2 離子層析分離純化分子質(zhì)量<3 ku紫蘇籽抗氧化肽

圖3 離子層析分離純化分子質(zhì)量<3 ku紫蘇籽抗氧化肽各組分的抗氧化活性

2.3 凝膠色譜Sephadex G-25分離純化紫蘇籽粕抗氧化肽

圖4 凝膠層析分離純化紫蘇籽粕抗氧化肽D3

圖5 凝膠層析分離純化紫蘇籽粕抗氧化肽D3后各組分抗氧化活性

表2 紫蘇籽粕蛋白水解物中獲得的抗氧化活性肽的純化匯總

2.4 紫蘇籽粕抗氧化肽分子質(zhì)量及氨基酸序列測定

如圖6所示，根據(jù)LC-MS-MS鑒定，分析并獲得G2的準確MS數(shù)據(jù)，該肽段由7個氨基酸組成，分子質(zhì)量為790.375 5 u，其氨基酸序列為AADCRAK，即丙氨酸(Ala)-丙氨酸(Ala)-天冬酰胺(Asp)-半胱氨酸(Cys)-精氨酸(Arg)-丙氨酸(Ala)-賴氨酸(Lys)。較短的肽(5～16個氨基酸)比較大的多肽表現(xiàn)出更強的抗氧化活性，這是因為它具有更好的穿過腸道屏障的能力，并且與自由基的相互作用更容易[19]。一些氨基酸對于肽的抗氧化活性至關重要，含有疏水性氨基酸的肽有助于其脂質(zhì)溶解度的增加，從而有助于增加其抗氧化活性[20]。此外，疏水性氨基酸能夠通過疏水性締合促進肽進入靶器官，便于其發(fā)揮抗氧化特性。因此，本研究中經(jīng)純化獲得的抗氧化活性肽G2組分中存在的疏水性氨基酸殘基Ala，在抗氧化活性肽能夠有效清除自由基的過程中起到重要的作用。

圖6 抗氧化肽G2組分的質(zhì)譜分析圖

2.5 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠平均攝食量的影響

紫蘇籽粕活性肽G2對受試小鼠攝食量的影響如表3所示。在實驗過程中，各實驗組小鼠攝食量整體相當，無顯著性變化(P>0.05)，小鼠平均攝食量穩(wěn)定在3～4 g。由此判定，實驗過程中小鼠攝食量的變化并未對其體質(zhì)量、血脂水平及抗氧化活性產(chǎn)生顯著的影響。

表3 不同階段小鼠平均攝食量

2.6 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

由表4可以看出，實驗前各實驗組小鼠體重比較均衡，各組小鼠體重無顯著性差異(P>0.05)。實驗結(jié)束后，高脂模型組小鼠體重極顯著高于空白對照組(P<0.01)；灌胃低劑量組及中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著低于高脂模型組(P<0.05)；灌胃高劑量組和陽性對照組小鼠體質(zhì)量極顯著低于高脂模型組(P<0.01)。結(jié)果表明，灌胃一定量的紫蘇籽粕活性肽G2對高血脂癥小鼠的體重增加具有顯著的抑制作用；且一定范圍內(nèi)，活性肽的抑制作用與活性肽的劑量呈正相關。

肝臟是機體的重要功能器官，膽固醇的代謝是肝臟的主要功能之一，一般情況下肝臟系數(shù)(肝臟重與體重的比值)是相對恒定的一個數(shù)值，當膽固醇攝入過多或者代謝異常時，肝臟系數(shù)就會偏離恒定值[21]。由表4可知，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠的肝臟指數(shù)增加極顯著(P<0.01)；與高脂模型組相比，中劑量組肝臟指數(shù)顯著減小(P<0.05)；陽性對照、高劑量組肝臟系數(shù)減小極顯著(P<0.01)。說明高脂飲食可導致小鼠肝臟組織重量增加，肝臟膽固醇代謝異常，損害肝臟健康；灌胃紫蘇籽粕活性肽G2可保護高脂血癥小鼠的肝臟健康，維護肝臟系數(shù)的恒定，具有預防脂肪肝的潛在功效。

2.7 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠抗氧化水平的影響

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是動物體內(nèi)存在的一種重要的能夠分解體內(nèi)過氧化物的酶，它能催化體內(nèi)有毒的過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的羥基化合物，從而使機體細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化物的干擾和損害，然而在疾病和衰老的動物體內(nèi) GSH-Px活性明顯降低[22]。高血脂癥動物往往組織中的脂質(zhì)過氧化物含量較高，GSH-Px是一種重要的還原脂質(zhì)過氧化物的主要酶類，能催化過氧化氫分解，可防止細胞膜與其他生物組織免受過氧化損傷[23]。由圖7a可知，模型組的GSH-Px活力顯著低于空白組(P<0.05)，表明模型組小鼠機體抗氧化能力降低。中、高劑量組紫蘇籽粕活性肽G2灌胃4周后的小鼠，其GSH-Px活力相對于模型組顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)這表明，紫蘇籽粕活性肽G2對具有氧化損傷小鼠GSH-Px活力的恢復有幫助，可以提高小鼠機體的抗氧化能力。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)存在的一種重要的抗氧化酶，能夠使體內(nèi)的超氧化物通過歧化反應轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化物和氧氣，過氧化物再由相應的過氧化物分解酶清除[24]。如圖7b所示，高脂模型組小鼠SOD活力下降，與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，表明長期飼喂高脂飼料能夠使小鼠肝組織的抗氧化能力降低。紫蘇籽粕抗氧化活性肽中劑量組SOD活力相較模型組顯著升高(P<0.05)、高劑量組升高極顯著(P<0.01)，表明一定劑量的紫蘇籽粕活性肽G2可以提高小鼠體內(nèi)SOD活力，提高機體抗氧化的能力。

表4 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠體重、肝臟指數(shù)的影響

圖7 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響

過氧化氫酶(CAT)在動物肝臟組織以高濃度存在，其酶活性為機體提供了抗氧化防御機制[25]。從圖7c可以看出，模型組小鼠相對空白對照組CAT活力明顯下降(P<0.05)。相對高脂模型組，紫蘇籽粕抗氧化活性肽低、中、高劑量組CAT活力升高顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)，其CAT活力分別增長了7.37%、24.64%、37.93%，表明紫蘇籽粕活性肽G2各劑量組能顯著提高小鼠肝臟組織CAT活力，而且CAT含量隨著灌胃濃度的升高而升高，呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。

丙二醛(MDA)是一種脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，機體中自由基濃度升高會導致脂質(zhì)過氧化程度升高，過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也會升高。因此，體內(nèi) MDA的含量能夠間接地反映機體受自由基氧化損傷的程度[26]。從圖7d可以得出，與空白組相比較，模型組小鼠肝臟組織中MDA 的含量升高具有極顯著差異(P<0.01)。與模型組相比，紫蘇籽粕活性肽G2低、中劑量組MDA含量分別降低了6.7%、23.21%(P<0.05)；高劑量組降低極顯著(P<0.01)，說明紫蘇籽粕活性肽G2各劑量組不同程度降低了小鼠體內(nèi)的MDA含量，降低機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，提高了小鼠機體抗氧化的水平。

2.8 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠血脂水平的影響

高血脂癥是血脂代謝異常所致，其主要表現(xiàn)為血清中TC、TG和LDL-C水平過高或HDL-C水平過低而引起的脂質(zhì)水平異常[27]。紫蘇籽粕活性肽G2對實驗組小鼠血脂水平的影響如圖8所示，與空白對照組相比，高脂模型組血清TC和LDL-C水平升高極顯著(P<0.01)、HDL-C水平顯著降低(P<0.05)、TG顯著升高(P<0.05)。對照組在整個造模期間，TC和LDL-C水平基本維持在4.48、1.21 mmol/mL，而高脂模型組則上升至9.15、1.95mmol/mL； HDL-C水平基本維持在2.84 mmol/mL，而模型組HDL-C水平則下降至1.10 mmol/mL，表明高脂模型組小鼠出現(xiàn)明顯的血脂代謝紊亂，高血脂小鼠模型造模成功。

圖8 紫蘇籽粕活性肽G2對小鼠血脂水平的影響

由圖8a可知，與高脂模型組相比，G2高劑量組小鼠血清中TC含量降低了11.93%(P<0.05)。從圖8b可以看出，與模型組相比，G2各劑量組小鼠血清中TG含量降低顯著(P<0.05)，與空白組對比差異不顯著(P>0.05)，且小鼠血清中TG含量與活性肽G2的劑量呈負相關，即隨著灌胃活性肽G2的劑量減少，小鼠血清中TG含量上升。由圖8c所示，G2中劑量組小鼠與高脂模型組小鼠HDL-C含量相比有所升高(P<0.05)，高劑量組小鼠HDL-C含量較模型組升高了29.28%，差異極顯著(P<0.01)。從圖8d可以得出G2各劑量組小鼠血清中LDL-C含量與高脂模型組相比均降低，紫蘇籽粕活性肽G2中劑量組與模型組相比差異顯著(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01) 。實驗結(jié)果表明，灌胃紫蘇籽粕活性肽G2能夠降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，促進HDL-C升高，表明紫蘇籽粕活性肽G2在調(diào)節(jié)脂代謝紊亂方面具有良好功效，具有調(diào)節(jié)高血脂小鼠膽固醇代謝的潛在作用。

3 結(jié)論