朱思哲，葉成林

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院臨床免疫研究室，湖北 武漢 430030；2.武漢大學人民醫(yī)院病理科，湖北 武漢 430060）

膿毒癥（sepsis）是宿主對感染的免疫反應失調而導致危及生命的器官功能性障礙[1]。據(jù)保守估計，膿毒癥是全世界死亡和危重病的主要原因[2]。盡管在過去的幾十年中，膿毒癥的預后有所改善，但膿毒癥休克的死亡率仍高于25%～30%，甚至40%～50%[3]。此外，幸存的膿毒癥患者通常要承受長期的身體、心理和認知障礙[4]。膿毒癥與其他主要流行病不同，其治療是非特異性的，沒有批準的藥物，只能給予維持器官功能、抗生素和保障血液動力學穩(wěn)定治療。因此，迫切需要探索更多潛在的膿毒癥診斷生物標志物并構建預后模型，從而提高治療決策的有效性。免疫反應失調在膿毒癥中扮演著重要的角色。單核細胞和巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在膿毒癥期間協(xié)調宿主免疫反應方面發(fā)揮著關鍵作用。在膿毒癥的早期階段，兩種不同的淋巴細胞分泌的促炎因子和趨化因子水平升高，這會加劇炎癥反應，增加死亡率[5]。中性粒細胞是體循環(huán)中最豐富的白細胞。研究表明，膿毒癥患者中循環(huán)中性粒細胞增加可導致免疫失調，通過釋放細胞因子和活性氧導致多器官衰竭，CD4+T 細胞可以直接介導宿主對膿毒癥的反應，膿毒癥導致的細胞凋亡會誘導CD4+T細胞的耗竭[6]。而膿毒癥導致記憶CD8+T 細胞表型、保護功能和定位的長期改變，可能會改變宿主對再感染的反應能力[7]。因此，免疫相關基因在膿毒癥的診斷與預后預測方面具有巨大潛力。目前，關于免疫相關基因在膿毒癥的診斷與預后方面的研究報道罕見?；诖耍狙芯客ㄟ^生物信息學分析獲得具有表達差異的免疫相關基因，并探索其生物學功能。進一步通過LASSO 回歸和多因素COX 回歸分析篩選膿毒癥獨立預后基因，并構建預后風險模型，以及探索所篩選的基因在膿毒癥中的診斷價值，為膿毒癥的診斷、治療和預后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載膿毒癥基因芯片表達數(shù)據(jù)集GSE134347、GSE13904 和GSE65682，每個數(shù)據(jù)集樣本信息見表1。通過CIBERSORTx 數(shù)據(jù)庫（https://cibersortx.stanford.edu/）分析GSE134347 數(shù)據(jù)集中每個樣本中22 種常見免疫細胞的浸潤程度。

表1 GSE134347、GSE13904 和GSE65682 數(shù)據(jù)集信息

1.2 差異基因分析 利用R 包limma 對GSE134347數(shù)據(jù)集進行差異分析，adjustP-value ＜0.05，|Log2FC|＞1 的基因被定義為差異表達基因（DEGs）。通過ImmPort 數(shù)據(jù)庫下載免疫相關基因，并與差異表達基因取交集。

1.3 生物學功能富集分析 利用R 包clusterProfile進行生物學功能GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，利用R 包GOplot 計算z-score。

1.4 構建風險預后模型 通過R 包glmnet 對GSE65682 數(shù)據(jù)集中含有預后信息的標本進行LASSO 回歸分析，設置10 折交叉驗證，以獲得最優(yōu)模型。利用R 包survival 進行多因素COX 回歸篩選獨立預后基因（P＜0.01），風險比（Hazard ratio，HR）＞1為危險因素，HR＜1 為保護因素。進一步通過多因素回歸分析確定每個獨立預后基因的回歸系數(shù)，建立預后風險模型，預測患者生存率。公式為：風險分數(shù)=Σβi×xi，βi為基因對應的多元COX 回歸beta 值，xi為基因表達值。

1.5 繪制診斷ROC 曲線及驗證 利用R 包pROC 對GSE134347 訓練集和GSE13904 驗證集中的獨立預后基因繪制診斷ROC 曲線和計算AUC 值，并通過R 包ggplot2 繪制這兩個數(shù)據(jù)集中獨立預后基因表達值小提琴圖。

2 結果

2.1 免疫浸潤分析 免疫浸潤分析顯示，膿毒癥組和正常組的免疫細胞浸潤具有差異。在膿毒癥組中，漿細胞（plasma cells）、活化CD4+記憶T 細胞（T cells CD4 memory activated）、調節(jié)性T 細胞（T cells regulatory）、單核細胞（monocyte）、M0 型巨噬細胞（macrophage M0）和中性粒細胞（neutrophils）的浸潤程度上升，而初始B 細胞（B cells naive）、CD8+T 細胞（T cells CD8）、初始CD4+T 細胞（T cells CD4 naive）、靜息CD4+記憶T 細胞（T cells CD4 memory resting）和靜息自然殺傷細胞（NK cells resting）的浸潤程度下降，見圖1。

圖1 免疫浸潤分析

2.2 差異分析 共獲得911 個上調基因和1248 個下調基因，見圖2A。通過與免疫相關基因取交集，共獲得差異表達的免疫相關基因245 個，見圖2B。

圖2 差異基因分析

2.3 生物學功能富集分析 對篩選的245 個免疫相關基因進行生物學富集分析：GO 富集顯示上述基因主要富集于免疫反應激活細胞表面受體信號通路、細胞因子產生的正調控、抗原受體介導的信號通路、細胞活化的正調控、白細胞活化的正調控、淋巴細胞活化的正調控、淋巴細胞活化的調節(jié)、T 細胞受體信號通路、T 細胞活化、白細胞-細胞粘附，見圖3A；KEGG 信號通路富集分析顯示，上述基因主要富集于Th17 細胞分化、Th1 和Th2 細胞分化、抗原處理和呈遞、造血細胞系、T 細胞受體信號通路、肺結核、弓形蟲病、利什曼病、自然殺傷細胞介導的細胞毒性和甲型流感信號通路，見圖3B。

圖3 生物學功能富集分析

2.4 構建風險預后模型 對245 個免疫相關基因進行LASSO 回歸分析篩選預后基因，見圖4A；共獲得DEFA4、IL4R、TFRC、CCL5、CAMP、CX3CR1、PRKCA、CD28 和LTB 9 個免疫相關預后基因，LASSO 回歸軌跡見圖4B。進一步通過多因素COX 歸回篩選獨立預后基因，DEFA4 為危險因素（HR＞1），而CAMP、CX3CR1 和PRKCA 為保護因素（HR＜1），見圖4C?；谝陨? 個基因的表達值與COX 回歸系數(shù)構建風險預后模型，計算GSE65682 中每個膿毒癥患者的風險分數(shù)：風險分數(shù)=0.2300×DEFA4-0.2894×CAMP-0.2958×CX3CR1-0.2388×PRKCA。進一步按照風險分數(shù)中位數(shù)將GSE65682 中的膿毒癥患者分為高風險組和低風險組，比較兩組28 d 生存差異，結果顯示高風險組28 d 生存率低于低風險組（P=2.7e-7），見圖5。

圖4 LASSO 回歸和多因素COX 回歸分析

圖5 生存分析

2.5 診斷ROC 曲線及驗證 ROC 曲線顯示，DEFA4（AUC=0.795）和PRKCA（AUC=0.893）展示出一定的診斷準確性，而CAMP（AUC=0.923）和CX3CR1（AUC=0.950）則具有較高的診斷準確性，見圖6A。為了進一步驗證上述結果，利用GSE13904 驗證集繪制DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 的ROC 曲線，結果顯示DEFA4、CAMP 和CX3CR1 展示出一定的診斷準確性，而PRKCA 則具有較低的準確性，見圖6B。進一步根據(jù)DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 在GSE134347 訓練集與GSE13904 驗證集中的表達值，分別繪制表達值小提琴，結果顯示DEFA4 和CAMP 的表達在膿毒癥組上調（P＜0.05），CX3CR1 和PRKCA 的表達則在正常組中上調（P＜0.05），見圖7。

圖6 該模型診斷膿毒癥的ROC 曲線

圖7 DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 基因表達水平

3 討論

在過去的30 年里，膿毒癥的定義和管理有很大的發(fā)展[8]。這得益于對臨床綜合征的理解、血流動力學監(jiān)測工具的進步和搶救措施改進，但膿毒癥仍是危重患者發(fā)病和死亡的主要原因之一[9]。多數(shù)患者在膿毒癥的初始高炎癥階段可存活下來，但會進展到后期的免疫抑制階段，其中30%的患者死于繼發(fā)感染，免疫反應則可能在膿毒癥患者死亡率中起主要作用[10]。因此，探索免疫相關基因在膿毒癥中的作用，篩選免疫相關基因的膿毒癥診斷生物標志物和構建預后風險模型對膿毒癥的早期診斷和預后評估具有重要意義。

本研究對GEO 數(shù)據(jù)集的膿毒癥組和正常組進行免疫浸潤分析，結果顯示膿毒癥組與正常組外周血中免疫細胞浸潤程度具有差異，這說明免疫調節(jié)在膿毒癥中起重要作用。為了進一步探索免疫調節(jié)在膿毒癥中的作用，本研究對膿毒癥組和正常組進行差異分析，并從ImmPort 數(shù)據(jù)庫下載免疫相關基因與差異基因取交集，共獲得245 個免疫相關差異表達基因。生物功能富集分析顯示245 個基因主要富集于Th17 細胞分化、Th1 和Th2 細胞分化、肺結核以及弓形蟲病等免疫和感染相關信號通路。多項研究表明，這些信號通路與膿毒癥密切相關。如Mishra R 等[11]報道肺結核性膿毒癥休克是一種罕見的疾病，但其具有非常高的死亡率，這與敗血癥流行病學的普遍預期相反。Souza MC 等[12]報道，慢性弓形蟲感染可加劇繼發(fā)性多微生物膿毒癥。Th 細胞作為適應性免疫的一部分，參與了膿毒癥的免疫調節(jié)。膿毒癥患者中Th17 和Th1 細胞的活化失調，以及Th17/Treg 比例失衡與膿毒癥預后相關[13，14]。Xue M等[15]報道，社區(qū)獲得性嚴重膿毒癥患發(fā)作時，Th2/Th1 比例顯著上升，Th2 占主導地位，其持續(xù)動態(tài)增加與ICU 獲得性感染和28 d 死亡率有關。

為了進一步篩選免疫相關膿毒癥預后基因，本研究對上述245 個基因進行LASSO 回歸和多因素COX 回歸，結果顯示DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 可以作為膿毒癥的獨立預后基因。DEFA4又名HNP4（人中性粒細胞α 防御素4），編碼一種先天免疫陽離子抗菌肽，對革蘭氏陰性菌具有較強的抗菌效果，也能保護人外周血單核細胞免受HIV-1 感染[16]。CAMP 編碼一種Cathelicidin 抗菌肽LL-17，是呼吸道內宿主防御細菌感染中的重要元素[17]，并且可以抑制2 型登革熱病毒的感染[18]。CX3CR1 是趨化因子fractalkine 的受體，CX3CR1+細胞可以阻止沙門氏菌的侵襲[19]，并在控制可能導致組織損傷的異常腸道炎癥方面具有重要作用[20]。PRKCA 編碼蛋白激酶C 屬于絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，蛋白激酶C 參與調節(jié)先天免疫和適應性免疫，參與2 型先天淋巴細胞的活化和Th2細胞的活化與增殖[21]。基于上述4 個基因構建膿毒癥的預后風險模型，結果顯示高風險組28 d 生存率低于低風險組。由此推測DEFA4、CAMP、CX3CR1和PRKCA 在膿毒癥的免疫調節(jié)中起到關鍵作用，且與預后緊密相關。ROC 曲線顯示，DEFA4、CAMP和CX3CR1 在訓練集和驗證集中均表現(xiàn)出一定的診斷能力（AUC＞0.75），而PRKCA 在驗證集中AUC為0.673，說明DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA可以成為膿毒癥免疫相關生物標志物。本研究結果提示，DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 可能在膿毒癥的免疫調節(jié)中起到重要的作用，并且與預后緊密相關。探索膿毒癥的早期診斷生物標志物以及構建預后模型有助于給予膿毒癥患者及時有效的治療，同時提高患者生存率。

綜上所述，本研究基于4 個免疫相關的獨立預后基因DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA，構建了膿毒癥預后風險模型，其在膿毒癥預后預測中具有一定的應用價值，并且上述4 個基因都具有一定的膿毒癥診斷能力。