顏 綱，鄒 寧，高樂天

魯東大學(xué)，山東煙臺(tái) 264000

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris），紅螺菌科，紅假單胞菌屬，屬于光合細(xì)菌中紫色非硫細(xì)菌屬的代表菌種之一，也是目前應(yīng)用較廣泛的光合細(xì)菌之一。

王蘭等[1]利用沼澤紅假單胞菌和纖細(xì)紅螺菌、球形紅假單胞菌的混合菌液處理蝦池養(yǎng)殖廢水，4 d后發(fā)現(xiàn)混合菌體對(duì)養(yǎng)殖廢水中的COD、氨氮的去除率分別達(dá)到了72.59%、89.2%。崔藝久等[2]對(duì)沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化以獲得類胡蘿卜素，在培養(yǎng)7d后，類胡蘿卜素最大產(chǎn)量達(dá)2.863 mg/g。楊素萍等[3]探究了沼澤紅假單胞茜Z菌株光合產(chǎn)氫的主要影響因素，研究結(jié)果表明：在標(biāo)準(zhǔn)狀況下，菌株的最大產(chǎn)氨速率可達(dá)19.4 mL/（L·h）。

易力等[4]從洛河水域分離篩選得到2株光合細(xì)菌，分別為沼澤紅假單胞菌、萬(wàn)尼氏紅微菌，這2種菌對(duì)模式菌株金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有較好的抑制作用，且沼澤紅假單胞菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果優(yōu)于萬(wàn)尼氏紅微菌，后者對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于前者。吳希陽(yáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris，PSB06）對(duì)稻瘟病具有良好的防治效果。進(jìn)一步分離抑菌活性物質(zhì)，利用蛋白層析分離技術(shù)分離得到一個(gè)Atp2蛋白。后期試驗(yàn)證明：Atp2蛋白能干擾稻瘟病病原菌附著胞的形成，從而降低其在水稻寄主上的致病力和侵染力[6-10]。

為了進(jìn)行大規(guī)模、低成本、高產(chǎn)量的生產(chǎn)，對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件等進(jìn)行探究?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)。而在培養(yǎng)過程中實(shí)際應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌對(duì)冬棗病害具有一定的治療效果，因此，設(shè)計(jì)其對(duì)不同果樹、不同病害的防治實(shí)驗(yàn)，以期獲得對(duì)某些植物病害防治效果佳，對(duì)環(huán)境、人都安全且無(wú)毒害的生物防治手段。

1 沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)用到的沼澤紅假單胞菌菌種和原始培養(yǎng)配方由實(shí)驗(yàn)室提供?？紤]光合細(xì)菌生長(zhǎng)需要光，反應(yīng)容器采用透光性較好的塑料桶（10 L）。實(shí)驗(yàn)用到的藥品原料為市場(chǎng)上容易購(gòu)買的藥品，這也是為了盡可能貼近實(shí)際生產(chǎn)，為大規(guī)模培養(yǎng)提供研究基礎(chǔ)。由于是室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌，環(huán)境中的溫度、光照強(qiáng)度等因素只能作為實(shí)驗(yàn)過程中的參數(shù)進(jìn)行記錄，不能作為培養(yǎng)條件的優(yōu)化因素。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 沼澤紅假單胞菌，由魯東大學(xué)藻類工程中心提供。

1.1.2 試劑及儀器 試劑：結(jié)晶乙酸鈉、無(wú)水氯化鈣、硫酸鎂、葡萄糖、硫代硫酸鈉、次氯酸， 酵母膏、尿素、復(fù)合肥1（N-P2O5-K2O)、復(fù)合肥2、磷酸二氫銨、硝酸銨。儀器：紫外分光光度計(jì)、照度計(jì)、燒杯、攪拌棒、10 L塑料桶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）C源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)基中的C源(結(jié)晶乙酸鈉)進(jìn)行濃度優(yōu)化，設(shè)置其濃度梯度為3、5、10、20、50、100 g/L的實(shí)驗(yàn)組；（2）N源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)基中的N源進(jìn)行種類優(yōu)化，可供選擇的N源有：尿素、復(fù)合肥（N-P2O5-K2O）、硝酸銨、硝酸鈉和磷酸二氫銨；（3）P源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：對(duì)培養(yǎng)基中的P源進(jìn)行種類優(yōu)化，可供選擇的P源有；磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨和復(fù)合肥。將10 L塑料桶中裝入9 L用次氯酸鈉消毒法進(jìn)行消毒自來(lái)水，加入按照上述培養(yǎng)基方法分別配置的培養(yǎng)基后，以10%的接種量接種沼澤紅假單胞菌菌種，接種后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行振蕩混勻，立即測(cè)量相關(guān)參數(shù)，主要包括OD560、溫度（水溫）、光照強(qiáng)度、pH值等。以此作為初始數(shù)據(jù)，之后每天定時(shí)進(jìn)行振蕩搖勻操作和測(cè)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

上述實(shí)驗(yàn)完成后發(fā)現(xiàn)能使細(xì)菌生長(zhǎng)較好的N、P源有：磷酸二氫鉀、復(fù) 合 肥1（N:P:K=28:6:6）和 復(fù) 合 肥2（N:P:K=15:15:15）。對(duì)上述N、P源進(jìn)行濃度優(yōu)化，以不添加任何N、P的配方為對(duì)照組，設(shè)置復(fù)合肥1組、磷酸二氫鉀組、復(fù)合肥2組，分別設(shè)置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。重復(fù)以上培養(yǎng)過程。

1.3 結(jié)果與分析

（1）C源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，在自然條件下，乙酸鈉的添加量對(duì)沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)有影響，其中5、10、20 g/L的濃度較好，添加量為10 g/L時(shí)，有最大增長(zhǎng)量。單因素分析發(fā)現(xiàn)，P=0.000＜0.01，具有極顯著性。因此，可確定C源（乙酸鈉）最佳添加濃度為10 g/L。

圖1 濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線

（2）N、P源種類優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖2可知：復(fù)合肥組、NH4H2PO4組和KH2PO4組等N、P源都可以促進(jìn)沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)?？傮w來(lái)看，復(fù)合肥組的促進(jìn)效果最 佳，NH4H2PO4次之，NH4H2PO4效果較弱。最終確定P源為復(fù)合肥和磷酸二氫鉀。

圖2 氮、磷源種類優(yōu)化實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

（3）N、P濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，在自然培養(yǎng)條件下，添加復(fù)合肥2（N:P:K=15:15:15）可以明顯促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，最終OD560值可以達(dá)到1.322。但復(fù)合肥濃度達(dá)到一定程度后時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)能力下降。經(jīng)單因素分析，P=0.000＜0.01，即具有極顯著性，結(jié)合生長(zhǎng)曲線，最終確定復(fù)合肥2的添加濃度為0.5 g/L。

圖3 復(fù)合肥2組濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

1.4 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)得知，N、P、C等基礎(chǔ)元素對(duì)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)有較大影響，C源乙酸鈉添加濃度在5、10、20 g/L都可較好地促進(jìn)沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)?；谏a(chǎn)成本的考慮，確定最佳添加濃度為10 g/L。N源種類優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沼澤紅假單胞菌可以代謝硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、復(fù)合型氮等多種氮源，其中，復(fù)合型的N源促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的能力更強(qiáng)。在P源種類探究實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合肥和磷酸二氫銨的添加都可以顯著促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，其中復(fù)合肥在實(shí)驗(yàn)后期促進(jìn)效果更好，但前期NH4H2PO4組的促進(jìn)更明顯、快速。經(jīng)過濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定最佳N、P源為復(fù)合肥（N：P：K=15：15：15），其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)都具有較好的促進(jìn)效果，最佳添加濃度為0.5 g/L。

2 沼澤紅假單胞菌在植物病害防治方面的應(yīng)用

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 菌種 沼澤紅假單胞菌，由魯東大學(xué)藻類研究中心提供。由從溫室大棚獲取棗銹病、棗炭疽病、白粉病、根腐病、葉霉病、晚疫病等病害植物部位后分別分離篩選得到病原菌。

2.1.2 試劑及儀器 試劑：結(jié)晶乙酸鈉、無(wú)水氯化鈣、硫酸鎂、酵母膏、抑菌試紙片（φ=1 mm）。儀器：超凈工作臺(tái)、細(xì)菌培養(yǎng)箱、移液槍、試管、培養(yǎng)皿、鑷子、接種針、涂布棒、酒精燈。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

從植物患病部位取得帶有病害的組織，從中分離、篩選得到相關(guān)病害的病原菌株，將病原菌純化后，與培養(yǎng)一段時(shí)間的沼澤紅假單胞菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，利用浸泡過不同處理方式菌液的抑菌試紙片在培養(yǎng)皿上進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，通過其抑菌圈大小得到沼澤紅假單胞菌對(duì)相關(guān)病害病原菌的抑菌效果。

2.2.1 病原菌的分離、篩選、純化 患病的植物組織、器官進(jìn)行研磨或用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗、浸泡得到菌懸原液，過濾得到菌懸液。將菌懸液稀釋后涂布到PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí)間后鏡檢。得到菌落后進(jìn)行純化培養(yǎng)，采用劃線法將分離得到的菌落接種到平板上，確定其生長(zhǎng)周期情況，確定合適的觀察時(shí)間。

2.2.2 制備光合細(xì)菌處理液 將沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間后，再分別將其進(jìn)行相應(yīng)處理，制成為經(jīng)高溫滅菌后的菌液、離心后上清液、離心后的菌體經(jīng)無(wú)菌水重懸的菌體、菌原液、無(wú)菌水等5種處理的菌液。將抑菌試紙片浸泡在上述5種處理液中半小時(shí)待用。

2.2.3 抑菌試驗(yàn) 將純化后的病原菌接種到定點(diǎn)位置，將浸泡后的抑菌試紙片放置在接種了病害菌株培養(yǎng)基的特定標(biāo)記區(qū)域中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，鏡檢觀察是否具有抑菌圈并對(duì)抑菌圈大小進(jìn)行測(cè)量、分析。

2.3 結(jié)果與分析

由表1可知，在植物病害防治實(shí)驗(yàn)中，沼澤紅假單胞菌對(duì)棗銹病白粉病、葉霉病、褐腐病等病害的病原菌都具有極顯著的抑菌效果，對(duì)棗炭疽病具有顯著的抑制效果、對(duì)根腐病具有一定的抑菌效果。其中，發(fā)酵原液對(duì)棗炭疽病病原菌的抑制效果更好，上清液對(duì)棗銹病病原菌的抑制效果優(yōu)于發(fā)酵原液經(jīng)離心后，重懸菌體的菌液對(duì)棗炭疽病、棗銹病、白粉病的病原菌都具有較好的抑制效果，滅火后的菌液對(duì)棗銹病病原菌仍具有較好抑制效果，多種處理菌液對(duì)根腐病病原菌有一定的抑制效果。

表1 PSB對(duì)7種植物病害的抑菌率 %

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)得知，N、P、C等基礎(chǔ)元素對(duì)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)有較大影響。最佳C源乙酸鈉添加濃度為5、10、20 g/L；N源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合肥2（N:P:K=15:15:15）促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的效果最好，最佳添加濃度為0.5 g/L；P源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，NH4H2PO4組的促進(jìn)速率最快，復(fù)合肥2（N:P:K=15:15:15）的最終濃度最高，最佳添加濃度為0.5 g/L。綜合考慮促進(jìn)效果及生產(chǎn)成本，確定最終培養(yǎng)基配方是將乙酸鈉濃度改為10 g/L，額外添加復(fù) 合 肥2（N:P:K=15:15:15）0.5 g/L。培養(yǎng)條件中，溫度在25℃以上、pH值為7.5～8.0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)更快。

在植物病害防治實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液對(duì)棗銹病、白粉病、葉霉病、褐腐病、晚疫病、棗炭疽病等病害的病原菌都具有較好的抑制效果，對(duì)根腐病不具有抑制效果。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)不同處理方式的發(fā)酵液對(duì)不同病害病原菌的抑制效果不同。其中發(fā)酵液、離心后的上清液、離心后的菌體重懸液、滅活的發(fā)酵液都對(duì)棗銹病病原菌、褐腐病病原菌、葉霉病病原菌具有顯著的抑制效果。發(fā)酵液、離心后的上清液、離心后的菌體重懸液對(duì)棗炭疽病病原菌、白粉病病原菌以及晚疫病病原菌具有較好的抑制效果。