鄒麗娟，鄭 莉，萬(wàn) 丹，甘 萍△

（1.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，四川 成都610083；2.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610041）

目前，大多數(shù)基于“單靶點(diǎn)單藥物”模型的藥物，在治療復(fù)雜、異質(zhì)、多基因的疾病如腫瘤方面正變得越來(lái)越無(wú)效。雖然藥物組合療法被用作實(shí)現(xiàn)療效的替代方法，但其優(yōu)勢(shì)往往被不利的藥物-藥物相互作用、不可預(yù)測(cè)的藥代動(dòng)力學(xué)和安全性及患者服藥依從性差所抵消。近年來(lái)，更傾向于研發(fā)“多靶點(diǎn)藥物”，以解決許多單靶點(diǎn)或聯(lián)合療法的有限療效和耐藥性或毒性。磷脂酰肌醇3-羥基激酶（PI3K）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是目前臨床應(yīng)用較廣泛的抑瘤靶點(diǎn)，但PI3K和HDAC抑制劑都受到療效不足和耐藥突變的限制。有證據(jù)表明，同時(shí)抑制PI3K和HDAC，可協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)，并通過(guò)提高療效、限制耐藥性和提供比單一抑制劑更好的治療窗口來(lái)克服這些限制［1］。特異性HDAC和PI3K異構(gòu)體的選擇性抑制劑可能具有更好的低毒性特征，治療窗更寬。治療彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的雙重抑制劑CUDC-907可通過(guò)協(xié)同效應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和生存補(bǔ)償途徑，表現(xiàn)出HDAC和PI3K雙向抑制作用，獲得更好的治療效益［2］。臨床迫切需要新的具有高效力和選擇性的雙重抑制劑［3-4］。為此，本研究中以半數(shù)抑制率（IC50）評(píng)價(jià)HL-5與陽(yáng)性藥物辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA，HDAC靶點(diǎn)抑制劑）和4-羥基-2，6-二甲基苯甲腈（GDC-0941，PI3K靶點(diǎn)抑制劑）對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀和蛋白免疫印跡（Western blotting）法，探討HL-5抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：Multiskan Spectrum-15型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，SORVALLST 16型常溫離心機(jī)，F(xiàn)ASC420型流式細(xì)胞儀，均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CCL-170B-8型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）。

試藥：HL-5由課題組自主設(shè)計(jì)、合成，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。SAHA（批號(hào)為J01764A），GDC-0941（Pictilisib，批號(hào)為J0315A），均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為EZ7890D354）；p-H3（批號(hào)為17AV0305），cdc25c（批號(hào)為E1616），P21（批號(hào)為F036118），p-cdc2（批號(hào)為K012443），均購(gòu)自Abcam公司。

圖1 HL-5的設(shè)計(jì)、合成與化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Design，synthesis and chemical structure of HL-5

1.2 方法

IC

50測(cè)定：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按（3～5）×104個(gè)/孔鋪于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。依次按濃度梯度加入HL-5（1 000，500，250，125，62.5，31.25 nmol/L），GDC-0941（20 000，10 000，5 000，2 500，1 250，625，312.5 nmol/L），SAHA（20 000，10 000，5 000，2 500，1 250，625，312.5 nmol/L），72 h后測(cè)定IC50［5］。

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種于6孔板（1×105個(gè)/孔），24 h后用不同終濃度的HL-5（0，25，50，100，200，400 nmol/L）干預(yù)48 h；更換新的6孔板，完成干預(yù)后的細(xì)胞重接種（500個(gè)/孔），行單克隆集落培養(yǎng)12 d；將細(xì)胞用甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，晾曬，次日拍照［6-7］。

細(xì)胞周期的流式檢測(cè)：選用6孔板接種人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞（1×105個(gè)/孔），24 h后用不同終濃度的HL-5（0，40，200，1 000 nmol/L），SAHA（1 000 nmol/L），GDC-0941（1 000 nmol/L）干預(yù)細(xì)胞24 h；收集細(xì)胞，依次行清洗、固定、碘化丙啶（PI）染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析［8-9］。

Western blotting實(shí)驗(yàn)：采用9 cm培養(yǎng)皿接種人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞，24 h后用不同終濃度的HL-5（0，40，200，1 000 nmol/L），SAHA（1 000 nmol/L），GDC-0941（1 000 nmol/L）干預(yù)細(xì)胞24 h；分別提取總蛋白，行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影和拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗腫瘤細(xì)胞增殖活性

選取部分實(shí)體瘤細(xì)胞株進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HL-5，SAHA，GDC-0941抗腫瘤細(xì)胞增殖活性比較（±s，μmol/L）Tab.1 Comparison of anti-proliferation effect of HL-5，SAHA and GDC-0941 on the tumor cells（±s，μmol/L）

表1 HL-5，SAHA，GDC-0941抗腫瘤細(xì)胞增殖活性比較（±s，μmol/L）Tab.1 Comparison of anti-proliferation effect of HL-5，SAHA and GDC-0941 on the tumor cells（±s，μmol/L）

注：與HL-5比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with those of HL-5，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

細(xì)胞株Hcc827 H1975 A549 MDA-MB-231 MCF-7 HCT116 COCO205 SW620 HT29 A2780s HepG2 HL-5 0.282±0.096 0.133±0.007 0.443±0.025 0.227±0.011 0.114±0.020 0.077±0.003 0.079±0.016 0.094±0.009 0.032±0.003 0.208±0.017 0.347±0.042 SAHA 0.843±0.044*0.305±0.015*1.808±0.026*0.823±0.033*0.474±0.018*2.316±0.102**3.585±0.089***5.631±0.157***1.133±0.068*4.348±0.135*3.505±0.096**GDC-0941 8.363±0.127**0.323±0.015*0.511±0.047*3.408±0.129***0.577±0.044*0.804±0.036*0.381±0.038*5.664±0.115***1.764±0.092*1.142±0.086*7.528±0.150**

2.2 對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成的影響

細(xì)胞克隆集落形成情況見(jiàn)圖2 A，HCT 116細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖2 B，可見(jiàn)，HL-5從25 nmol/L濃度開(kāi)始，與二甲基亞砜比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，HL-5對(duì)腫瘤細(xì)胞具有持久殺傷能力。

2.3 對(duì)細(xì)胞周期的影響

HDAC抑制劑SAHA與PI3K抑 制劑GDC0941對(duì)細(xì)胞周期的作用效果不同，SAHA將細(xì)胞阻滯在G2/M期，而GDC-0941將細(xì)胞阻滯在G1期［8］。通過(guò)PI染色考察HL-5對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，HL-5處理HCT116細(xì)胞24 h后，G2/M期細(xì)胞比值隨濃度增加而增加，且到達(dá)一定比值后不再增加，其阻滯細(xì)胞周期的結(jié)果與SAHA類似而不同于GDC-0941。

2.4 對(duì)細(xì)胞周期阻滯標(biāo)志分子的影響

由圖4可知，蛋白水平的結(jié)果與細(xì)胞流式儀分析結(jié)果相似，HL-5對(duì)各標(biāo)志蛋白的影響類似于SAHA而不同于GDC-0941。經(jīng)HL-5處理后，p-H3和P21水平升高；同時(shí)，細(xì)胞從G2期至M期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵催化因子p-cdc2（161）和cdc25c水平降低。

圖4 HL-5對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of HL-5 on the expression level of cell cycleassociated proteins

3 討論

HDAC抑制劑作為抗腫瘤藥物的效用在腫瘤學(xué)中越來(lái)越受到重視，臨床不斷涌現(xiàn)不同HDAC靶點(diǎn)的藥物，治療效果明顯。但其適應(yīng)證大多局限于血液學(xué)腫瘤，對(duì)實(shí)體瘤疾病的治療作用不佳。同時(shí)，單靶點(diǎn)藥物更易出現(xiàn)耐藥性。多靶點(diǎn)藥物有效劑量更低，療效更好，相比單靶點(diǎn)藥物不易產(chǎn)生耐藥性，能對(duì)多種不同腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，給藥物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)及臨床患者帶來(lái)諸多益處［10-12］。由表1可知，作為HDAC/PI3K雙靶點(diǎn)抑制劑，HL-5在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌等細(xì)胞株中均顯示出良好的腫瘤抑制效果，且均優(yōu)于對(duì)應(yīng)的單靶點(diǎn)藥物SAHA和GDC-0941，表明雙靶點(diǎn)藥物起效劑量更低，同時(shí)單一HDAC或PI3K靶點(diǎn)抑制劑的適用范圍更大。與以往的單靶點(diǎn)藥物聯(lián)用增敏劑的研究［13］相仿，如在頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）模型中，HDAC的泛抑制劑LBH589與PI3K泛抑制劑BKM120聯(lián)合使用，在體外和體內(nèi)均有協(xié)同抗腫瘤作用。作為首個(gè)報(bào)道的HDAC和PI3K的雙靶點(diǎn)抑制劑［14］，CUDC-907已有5個(gè)項(xiàng)目處于臨床評(píng)價(jià)階段。在后期研究中，將選擇CUDC-907作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)比HL-5與其體內(nèi)外抗腫瘤療效的差異。

A.克隆染色B.HCT116細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)注：與二甲基亞砜比較，**P＜0.01，***P＜0.001。圖2 HL-5對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成的影響A.Clone staining B.Statistics of HCT116 cell countNote：Compared with that of dimethyl sulfoxide，**P＜0.01，***P＜0.001.Fig.2 Effect of HL-5 on the clone formation of HCT116 cells

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)可考察化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的持久、不可逆的影響，檢測(cè)經(jīng)過(guò)化合物處理后的細(xì)胞在移除藥物后能否繼續(xù)保持增殖活性的能力。由圖2可知，HL-5對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成有很好的抑制效果，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。由圖3可知，上述結(jié)果可能與HL-5能將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期有關(guān)。PI3K信號(hào)通路激活導(dǎo)致c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)增加，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白質(zhì)P21和P27的活性降低，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和存活［15］；HDAC是細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，能促使腫瘤抑制基因P21和P27的表達(dá)增加。因此，同時(shí)抑制PI3K和HDAC可協(xié)同降低細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄，并增加c-Myc的降解。針對(duì)CUDC-907的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)c-Myc有很強(qiáng)的抑制作用，用于Myc依賴的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和BRD-NUT融合陽(yáng)性NUT中線癌均有很好的效果［16］。周期分析結(jié)果提示，雙靶點(diǎn)抑制劑HL-5對(duì)細(xì)胞周期阻滯標(biāo)志分子p-H3，cdc25c，P21，p-cdc2（161）的表達(dá)均有影響，其對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用更傾向于HDAC抑制劑SAHA，且有一定的量效關(guān)系，而非同時(shí)具備2個(gè)靶點(diǎn)對(duì)周期阻滯的特點(diǎn)，與已有單靶點(diǎn)抑制劑作用機(jī)制類似［17］。后期研究將進(jìn)一步考察HL-5對(duì)p27，c-Myc，caspase等相關(guān)信號(hào)通路靶標(biāo)的影響。

綜上所述，與HDAC或PI3K抑制劑相比，雙靶點(diǎn)抑制劑HL-5可較好地?cái)U(kuò)展藥物的適用范圍，起效劑量更低，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。后期研究將選擇HCT116，H1975，COCO205，MCF-7細(xì)胞株建立荷瘤小鼠模型，以考察HL-5在體內(nèi)的抗腫瘤作用和作用機(jī)制，以及可能的毒性靶器官［18-20］。