張銘芳， 李 卉， 韓東洋， 杜運(yùn)鵬， 薛 靜， 高俊蓮， 張秀海

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097； 2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083)

百合(Liliumspp.)屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)，為多年生球根花卉，具有重要的觀賞、食用、藥用價(jià)值[1]。然而，在百合的栽培過程中均容易發(fā)生病害[2]。其中，灰霉病是百合的主要病害之一，百合感染灰霉病后主要危害葉片，也會(huì)危害花蕾、芽。初期在葉片形成橢圓形斑塊，后期布滿淺褐色灰霉?fàn)钗?，使葉片腐爛，花朵腐爛凋萎?；颐共?huì)造成百合年產(chǎn)量損失20%～30%，嚴(yán)重流行時(shí)可造成失收[3]。然而，目前針對(duì)百合不同種質(zhì)資源的灰霉病抗性評(píng)價(jià)系統(tǒng)在灰霉病抗性育種方面的利用還較少。

灰霉病主要是由半知菌葡萄孢屬菌侵染所引起的一類植物病害的總稱，其中灰葡萄孢(Botrytiscinerea)危害最大，寄主范圍最廣。對(duì)于不同百合品種灰霉病抗性的鑒定，一般采用離體葉片菌絲塊接種法和田間孢子噴霧法2種方法，統(tǒng)計(jì)相對(duì)病情指數(shù)，采用相對(duì)抗病性方法將百合對(duì)于灰霉病的抗性分為免疫、高抗、中抗、中感、高感5個(gè)等級(jí)[4-5]?；颐咕軌蛞鸺闹鞒绦蛐约?xì)胞死亡[6]，具有復(fù)雜的代謝系統(tǒng)，可產(chǎn)生毒素[7]、細(xì)胞壁降解酶、脫落酸[8]、多糖[9]、漆酶[10]等多種代謝產(chǎn)物?；钚匝?ROS)是植物體內(nèi)正常代謝的信號(hào)小分子，具有很強(qiáng)的氧化能力，參與植物和細(xì)胞內(nèi)的分子、生化、生理反應(yīng)，在植物的防衛(wèi)反應(yīng)和細(xì)胞程序性死亡過程中具有重要作用。植物葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)與植物抗病性有緊密的聯(lián)系，被認(rèn)為是植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵性酶。

因此，本研究擬對(duì)不同百合種質(zhì)資源的灰霉病抗性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、ROS及酶活性測(cè)定，探討其生理生化方面的抗病機(jī)制，以期為培育高抗病百合新優(yōu)種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的試驗(yàn)材料為11份百合種質(zhì)資源(表1)。品種的種球從荷蘭進(jìn)口，野生種采集于中國(guó)百合不同分布區(qū)，種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院溫室，給予適宜的日常養(yǎng)護(hù)管理。

表1 11份百合種質(zhì)資源

1.2 百合葉片表面結(jié)構(gòu)及病原菌生長(zhǎng)進(jìn)程電鏡觀察

選取健康的百合葉片，在掃描電鏡下觀察葉片正面、背面的細(xì)胞形態(tài)、氣孔密度以及氣孔大小。購(gòu)買灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌株(ACCC37263)，PDA(Potato dextrose agar)培養(yǎng)基28 ℃活化培養(yǎng)，并在掃描電鏡下觀察病原菌不同生長(zhǎng)時(shí)期的生長(zhǎng)情況、菌絲結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)以及孢子數(shù)量。

1.3 不同百合種質(zhì)資源的灰霉病抗病性鑒定

本研究采用葉片離體接種的方法來(lái)鑒定不同百合種質(zhì)資源對(duì)于灰霉病的抗病性。選取百合植株中部、上部健康葉片，將活化后菌板用5 mm的打孔器打成菌塊，分別接種在葉片背面，放置在相對(duì)濕度為90%以上的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)照組為不接種。統(tǒng)計(jì)不同百合種質(zhì)資源的發(fā)病情況，并對(duì)百合灰霉病進(jìn)行分級(jí)[11]，具體標(biāo)準(zhǔn)見表2及表3。

表2 百合灰霉病葉部病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表3 百合抗灰霉病抗性水平分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)含量的測(cè)定

選擇高抗(HR)、高感(HS)材料，在百合葉片表面噴灑濃度為1 ml 5×104個(gè)孢子的灰霉菌孢子液，對(duì)照組噴灑蒸餾水。掃描電鏡下觀察分生孢子在葉片上2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h時(shí)的生長(zhǎng)、侵染情況，并按照時(shí)間節(jié)點(diǎn)取材，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱貯藏，用于后續(xù)試驗(yàn)。

采用碘化鉀分光光度法測(cè)定過氧化氫含量。先制作過氧化氫的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在4 ℃條件下，稱取0.2 g百合葉片，放入3.0 ml 0.1%三氯乙醇溶液(TCA)中，12 000 r/min離心15 min，取0.5 ml上清液，與0.5 ml 10 mmol/L磷酸緩沖液(PBS，pH=7.0)和1.0 ml的1 mol/L碘化鉀(KI)溶液混合，暗反應(yīng)1 h后，在分光光度計(jì)390 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，根據(jù)回歸方程計(jì)算過氧化氫的含量[12]。

采用羥氨氧化法測(cè)定超氧陰離子含量。先制作超氧陰離子標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在4 ℃條件下，稱取0.2 g百合葉片，與3.0 ml 50 mmol/L PBS(pH=7.8)混合，12 000 r/min離心15 min，取1.0 ml的上清液，與0.9 ml PBS和0.1 ml 10 mmol/L鹽酸羥胺混合，25 ℃條件下反應(yīng)1 h，之后試管內(nèi)按順序分別加入1.0 ml 17 mmol/L對(duì)氨基苯磺酸以及1.0 ml 1 mmol/Lα-萘胺，在25 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)20 min，最后在波長(zhǎng)為530 nm分光光度計(jì)下檢測(cè)，根據(jù)回歸方程計(jì)算其含量[13]。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定

在4 ℃條件下稱取0.5 g百合葉片，加入10 ml pH為7.8的緩沖液(1 mmol/L乙二胺四乙酸，2 mmol/L鹽酸羥胺和1%可溶聚乙烯吡咯烷酮的50 mmol/L PBS)混合，12 000 r/min離心15 min，上清液就是抗氧化酶的提取物。采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶活性[14]，通過240 nm處由于過氧化氫分解而導(dǎo)致的吸光度降低來(lái)測(cè)定過氧化氫酶的活性[15]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2010和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片結(jié)構(gòu)

不同百合種質(zhì)資源的葉片氣孔(×250顯微鏡下觀察)及表面附屬物觀察結(jié)果(表4)顯示，氣孔密度最大的為卷丹百合，氣孔密度最小的則是2065-1。氣孔最大的為2065-1，氣孔最小的是岷江百合-1。

表4 不同百合種質(zhì)葉片氣孔密度、大小及表面附屬物對(duì)比

部分百合葉片有蠟質(zhì)層(圖1)，但是蠟質(zhì)顆粒的大小、數(shù)量、分布均不同。葉片存在蠟質(zhì)層的有：湖北百合、宜昌百合、卷丹百合、岷江百合-1、Craming Diamonds、Champion Diamonds。其中湖北百合葉片的蠟質(zhì)顆粒最多，葉正面以及葉背面均有分布。宜昌百合葉背面的蠟質(zhì)顆粒分布少，主要集中在氣孔周圍，而岷江百合-1、Craming Diamonds、Champion Diamonds的蠟質(zhì)顆粒只分布在葉正面，葉背面并未發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)顆粒(圖2)。

a：湖北百合葉面；b：卷丹百合葉面。圖1 不同百合種質(zhì)葉片表面結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.1 Comparison of leaf surface structure of different lily germplasms

a：宜昌百合葉背面；b：岷江百合-1葉背面。圖2 不同百合種質(zhì)葉背面氣孔周圍蠟質(zhì)顆粒分布對(duì)比Fig.2 Comparison of wax particles distribution around stoma between different lily germplasms

2.2 百合種質(zhì)資源的抗病性

離體接種后，劃分不同百合種質(zhì)資源的抗病性等級(jí)(圖3)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5顯示。野生種卷丹百合屬于高感(HS)種質(zhì)；野生種岷江百合-1、岷江百合-2、雜交種2065-1屬于中抗(R)種質(zhì)；野生種宜昌百合、湖北百合、雜交種2065-22以及品種Champion Diamonds、雷林石、Craming Diamonds、紅唇屬于高抗(HR)種質(zhì)(圖4)。其中，湖北百合抗性最強(qiáng)，卷丹百合抗性最弱，接種后第9 d時(shí)，葉片病情指數(shù)達(dá)到100%。

0～9為病級(jí)數(shù)，具體見表2。圖3 百合灰霉病葉部病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.3 Grade standard for leaf patches of lily infected with Botrytis cinerea

A：Craming Diamonds；B：紅唇；C：湖北百合；D：岷江百合-2；E：Champion Diamonds；F：宜昌百合；G：岷江百合-1；H：2065-22；I：2065-1；J：卷丹百合；K：雷林石。圖4 百合不同種質(zhì)接種灰霉菌后的葉斑情況Fig.4 Leaf patches of lily after inoculation with Botrytis cinerea

表5 不同百合種質(zhì)的抗病性

2.3 灰霉菌孢子侵染百合葉片進(jìn)程觀察

在掃描電鏡下觀察可見，孢子溶液噴灑后2 h，分生孢子已經(jīng)開始萌發(fā)，最大能長(zhǎng)至500 μm，整體呈棒狀。12 h時(shí)，部分分生孢子已經(jīng)從側(cè)面分生出第二條菌絲，但也有部分孢子停止生長(zhǎng)。24 h后，高抗百合葉片上留存的分生孢子數(shù)量較少，而高感百合葉片上留存的分生孢子數(shù)量較多。72 h時(shí)，高抗、高感百合葉片上均產(chǎn)生新的分生孢子。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，湖北百合葉片上的孢子數(shù)量逐漸變少，且菌絲的生長(zhǎng)速度明顯慢于卷丹百合葉片上的菌絲(圖5)。

a：高抗種質(zhì)湖北百合葉面；b：高感種質(zhì)卷丹百合葉面。圖5 高抗、高感百合葉片上分生孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況對(duì)比Fig.5 Comparison of conidia germination and mycelial growth in the leaves of lily with high resistance and high susceptibility to Botrytis cinerea

2.4 高抗、高感百合葉片中過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)含量的變化

測(cè)定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中過氧化氫含量，結(jié)果(圖6)顯示，與不接種灰霉菌對(duì)照組相比，接種灰霉菌試驗(yàn)組的反應(yīng)更為迅速，接種2 h時(shí)，試驗(yàn)組的過氧化氫含量就已經(jīng)下降，而對(duì)照組則是在4 h時(shí)才開始下降。對(duì)比卷丹百合和湖北百合葉片內(nèi)過氧化氫含量的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)湖北百合的波動(dòng)較卷丹百合更為劇烈，而卷丹百合中會(huì)積累更多的過氧化氫。

a：高抗種質(zhì)湖北百合；b：高感種質(zhì)卷丹百合。試驗(yàn)組：接種灰霉菌；對(duì)照組：不接種灰霉菌。圖6 接種灰霉菌后高抗、高感百合葉片中過氧化氫含量對(duì)比Fig.6 Comparison of hydrogen peroxide content between high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

測(cè)定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中超氧陰離子含量，結(jié)果(圖7)顯示，接種灰霉菌后，卷丹百合葉片中超氧陰離子的含量總體趨向減少，且波動(dòng)劇烈，而湖北百合葉片中超氧陰離子的含量則總體趨向增多。從整體上看，與不接種灰霉菌對(duì)照組相比，接種灰霉菌試驗(yàn)組百合體內(nèi)超氧陰離子含量變化與百合灰霉病的抗病性可能存在一定的相關(guān)性。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的高抗種質(zhì)湖北百合葉片中超氧陰離子含量在接種灰霉菌24 h內(nèi)，出現(xiàn)了2次峰值(接種后2 h、12 h)，而高感種質(zhì)卷丹百合葉片中超氧陰離子含量只出現(xiàn)1次峰值(接種后8 h)。接種24 h后，隨著時(shí)間的推移，超氧陰離子含量變化逐漸平緩。本研究結(jié)果與前人報(bào)道的研究結(jié)果[20]類似，即抗病性強(qiáng)的植物體內(nèi)活性氧含量會(huì)出現(xiàn)2次突增期。

a：高抗種質(zhì)湖北百合；b：高感種質(zhì)卷丹百合。試驗(yàn)組：接種灰霉菌；對(duì)照組：不接種灰霉菌。圖7 接種灰霉菌后高抗、高感百合葉片中超氧陰離子含量對(duì)比Fig.7 Comparison of O2·- content between high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

2.5 高感、高抗百合葉片中抗氧化酶活性的變化

測(cè)定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中超氧化物歧化酶(SOD)活性，結(jié)果(圖8)表明，從葉片中超氧化物歧化酶活性的變化趨勢(shì)上看，卷丹百合接種灰霉菌試驗(yàn)組與不接種灰霉菌對(duì)照組大致相同，湖北百合的對(duì)照組與試驗(yàn)組則有明顯的差別，對(duì)照組整體變化趨勢(shì)平緩，而試驗(yàn)組則出現(xiàn)了明顯變化，在接種后2 h時(shí)超氧化物歧化酶活性明顯降低，在24 h后超氧化物歧化酶活性持續(xù)變強(qiáng)，而卷丹百合中并未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。測(cè)定湖北百合及卷丹百合接種灰霉菌后葉片中過氧化氫酶(CAT)活性，結(jié)果(圖9)表明，湖北百合不接種灰霉菌對(duì)照組無(wú)明顯變化，接種灰霉菌試驗(yàn)組略有波動(dòng)，但與對(duì)照組未產(chǎn)生顯著差異；卷丹百合葉片中CAT活性變化趨勢(shì)與湖北百合類似。

a：高抗種質(zhì)湖北百合；b：高感種質(zhì)卷丹百合。試驗(yàn)組：接種灰霉菌；對(duì)照組：不接種灰霉菌。圖8 接種灰霉菌后高抗、高感百合種質(zhì)葉片中超氧化物歧化酶(SOD)活性對(duì)比Fig.8 Comparison of superoxide dismutase (SOD) activity in leaves of high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

a：高抗種質(zhì)湖北百合；b：高感種質(zhì)卷丹百合。試驗(yàn)組：接種灰霉菌；對(duì)照組：不接種灰霉菌。圖9 接種灰霉菌后高抗、高感百合種質(zhì)葉片中過氧化氫酶(CAT)活性對(duì)比Fig.9 Comparison of catalase (CAT) activity in leaves of high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

3 討 論

抗灰霉病一直是百合抗病育種的主要目標(biāo)之一，但灰霉病菌傳播媒介多，寄主范圍廣，因此鑒定、應(yīng)用新的抗病種質(zhì)資源，培育高抗灰霉病品種是最有效的方法。中國(guó)是百合野生資源的重要分布中心，但目前依然缺乏對(duì)其抗灰霉病特性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

11份不同百合種質(zhì)資源的葉片形態(tài)觀察及抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，百合的抗病性可能與葉片表面蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性?？盗⒐Φ萚16]在研究番茄時(shí)也發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)的抗性作用主要是從物理性上阻止病原菌的穿透。此外，氣孔是病原菌侵入植物體內(nèi)的重要途徑之一，氣孔密度、氣孔大小與植物的抗病性有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，百合灰霉病的抗病性與氣孔大小、密度沒有顯著的相關(guān)性。

植物受到傷害，最先引發(fā)體內(nèi)活性氧的增加，在植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶能夠消除超氧陰離子，而過氧化氫酶則能分解過氧化氫，通過協(xié)同作用清除活性氧[17-21]。高抗種質(zhì)湖北百合在接種病原菌后，其葉片中超氧陰離子含量出現(xiàn)2次峰值(接種后2 h、12 h)，而高感種質(zhì)卷丹百合只出現(xiàn)1次峰值(接種后8 h)，此結(jié)果與稻瘟菌侵染水稻幼苗前后活性氧變化情況的試驗(yàn)結(jié)果[22]相似。本研究發(fā)現(xiàn)，高抗種質(zhì)的SOD活性在接種24 h后持續(xù)增高，與抗病性具有相關(guān)性。前人在觀察葡萄品種資源葉片與灰霉病的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，葡萄品種的抗病性與過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化酶的活性呈正相關(guān)[23]。