楊建波，汪祺a，王瑩，程顯隆，魏鋒，陳子涵，孫華*，高慧宇，王雪婷，宋云飛，馬雙成*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，北京 100050

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，生何首烏具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便等功效[1]；制何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨等功效[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，何首烏中化學(xué)成分主要有蒽醌（單核和雙核蒽醌）、二苯乙烯、黃酮、多酚及多糖類(lèi)等[2-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，何首烏具有抗衰老、抗炎、調(diào)血脂、保肝、神經(jīng)保護(hù)和抗糖尿病等作用[11-14]。何首烏水提取物作用于犬急性心肌缺血再灌注模型，能夠使血清中超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化酶（CAT）活性升高，有效縮小心肌梗死面積，對(duì)犬急性心肌缺血再灌注損傷具有良好的預(yù)防作用[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，何首烏中主要活性成分二苯乙烯苷能夠顯著降低缺血再灌注模型心肌細(xì)胞中活性氧（ROS）含量，并進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗心肌缺血活性[16]。目前臨床心肌缺血的治療包括藥物治療、支架等的介入治療和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等的手術(shù)治療。其中藥物治療主要包括硝酸酯類(lèi)藥物、鎮(zhèn)痛劑、β受體阻斷劑、鈣通道阻斷劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)藥物、調(diào)脂藥，以及丹參片、速效救心丸、銀杏葉制劑等中成藥，但這些藥物僅能用于緩解癥狀，難以徹底治愈[17-18]。

本課題組首次從何首烏中分離得到一類(lèi)新的成分二蒽酮類(lèi)成分，除了發(fā)現(xiàn)其在體外細(xì)胞和斑馬魚(yú)模型中表現(xiàn)出一定的肝毒性外[19-21]，還發(fā)現(xiàn)二蒽酮類(lèi)成分具有較好的抗病毒和抗抑郁等活性[22-23]。因此，為了進(jìn)一步豐富該類(lèi)成分的藥理活性研究，本研究對(duì)分離得到的反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮（圖1）混合樣品進(jìn)行抗心肌缺血活性評(píng)價(jià)。

圖1 反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性昆明種小鼠，38只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于北京華阜康生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0008，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)為00003037。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所良好實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（GLP）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)溫度為（20±3）℃，相對(duì)濕度為（50.0±10.0）%，間隔12 h開(kāi)燈光照。

1.2 試藥

異丙腎上腺素（ISO，批號(hào)：I5627-5G，Sigma 公司）；地爾硫卓（批號(hào)：E017，天津田邊制藥有限公司）；心肌肌鈣蛋白-T（cTn-T，批號(hào)：202011025016）、肌酸激酶-同工酶（CK-MB，批號(hào)：20210501033）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒均購(gòu)于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；反式-大黃素-大黃素二蒽酮和順式-大黃素-大黃素二蒽酮對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室制備（純度≥98%）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)）；其他試劑均為分析純。

何首烏藥材樣品于2020年10月購(gòu)于廣東省茂名市高州市，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院楊建波副研究員檢定為何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，樣品標(biāo)本（GDGZ2020）保存于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 儀器

LC-6AD 型半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；e2695 型高效液相色譜儀，配2998 型光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、Empower 色譜工作站（Waters 公司）；ZORSAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)Agilent公司）；DM-8型大孔吸收樹(shù)脂（天津津達(dá)正源化工有限公司）；C18反相填料（日本YMC 公司）；XPE105型萬(wàn)分之一電子分析天平、ME303/02 型千分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；VIM3000 型小動(dòng)物專(zhuān)用吸入麻醉機(jī)（美國(guó)SurgiVet 公司）；MD3000-E 型心電圖檢測(cè)儀（安徽正華生物儀器設(shè)備公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 大黃素-大黃素二蒽酮樣品的制備

取何首烏干燥塊根10 kg，粉碎后用70%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并3 次提取液，減壓回收溶劑得70%乙醇浸出物（1.5 kg）。將上述浸出物混懸于水（1 L）中，再加水稀釋至5 L，過(guò)DM-8型大孔吸附樹(shù)脂，依次用水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，得到3 個(gè)不同組分，分別為水洗脫部分（組分A）、55%乙醇洗脫部分（組分B）和95%乙醇洗脫部分（組分C）。組分C 用甲醇溶解，拌樣十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS），干法上樣，經(jīng)ODS 中壓柱色譜分離，依次用50%甲醇、70%甲醇和甲醇洗脫，再經(jīng)過(guò)反相硅膠薄層色譜檢測(cè)、合并，共獲得5 個(gè)組分，分別為C1～C5。組分C3（4.5 g）經(jīng)過(guò)半制備液相色譜純化，流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速為5.0 mL·min-1，得到大黃素-大黃素二蒽酮樣品（1.5 g）。

2.2 大黃素-大黃素二蒽酮樣品分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORSAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（75∶25）；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液配制 分別取反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶液制成含反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮分別為0.31、0.32 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液配制 取大黃素-大黃素二蒽酮樣品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶液制成含大黃素-大黃素二蒽酮0.67 mg·mL-1的供試品溶液，即得。

2.2.4 含量測(cè)定 分別取對(duì)照品和供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示在對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間的位置上，供試品溶液顯相同保留時(shí)間的色譜峰，見(jiàn)圖2。并進(jìn)一步用外標(biāo)法對(duì)供試品中反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50.7%和35.8%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.5%。

圖2 反式（順式）-大黃素-大黃素二蒽酮混合對(duì)照品和樣品的高效液相色譜圖

2.3 模型制備、分組與給藥

雄性昆明種小鼠適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照組、ISO 模型組、地爾硫卓（20 mg·kg-1）陽(yáng)性對(duì)照組和大黃素-大黃素二蒽酮（10 mg·kg-1，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定劑量）組，每組9～10 只。大黃素-大黃素二蒽酮組小鼠每天灌胃給藥相應(yīng)劑量的大黃素-大黃素二蒽酮1 次，地爾硫卓組每天腹腔注射給藥1 次，對(duì)照組及模型組給予相同量的CMC-Na溶液，給藥量均為10 mg·kg-1，連續(xù)給藥10 d。給藥第4 天，除對(duì)照組外，各組小鼠皮下注射ISO（40 mg·kg-1）1次，給藥第5～10天ISO皮下注射劑量調(diào)整為20 mg·kg-1，均為給藥后2 h 造模，第10天給予ISO造模2 h，眼眶取血后處理動(dòng)物。

2.4 心電圖監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)第10 天，每組小鼠隨機(jī)選取4 只，于造模0.5 h 后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并分析ST 段抬高的情況[24]。

2.5 心肌損傷生物標(biāo)記物及心肌酶檢測(cè)

末次造模后2 h，小鼠眼眶靜脈叢取血，室溫靜置2 h后，3500 r·min-1離心20 min（離心半徑8.6 cm）分離血清，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清CK-MB和cTn-T水平[25]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0 軟件處理分析，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素-大黃素二蒽酮對(duì)ISO致心肌缺血小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖的影響

心電圖檢查是診斷心肌缺血最常用的無(wú)創(chuàng)性方法。ISO給藥引起小鼠心電圖出現(xiàn)ST段持續(xù)弓背抬高，表現(xiàn)出典型的心肌缺血性改變。計(jì)算ST 段抬高程度（ΔST），模型組與對(duì)照組比較顯著升高（圖3）。大黃素-大黃素二蒽酮10 mg·kg-1能顯著降低ISO引起的心電圖ST段抬高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且活性?xún)?yōu)于地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖3 各組小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段變化（±s, n=4）

3.2 大黃素-大黃素二蒽酮對(duì)ISO致心肌缺血小鼠血清心肌損傷生物標(biāo)記物cTn-T的影響

心肌壞死時(shí)，心肌內(nèi)含有的一些蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)會(huì)從心肌組織內(nèi)釋放出來(lái)，并出現(xiàn)在外周循環(huán)血中，可作為心肌損傷的判斷性指標(biāo)。肌鈣蛋白（Tn）是心肌組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，心肌肌鈣蛋白（cTn）與骨骼肌中的Tn 在分子結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)上是不同的，因此是心肌所獨(dú)有的，是判斷心肌壞死最特異和敏感的首選標(biāo)志物。cTn 有3 個(gè)亞型，分別為cTn-T、cTn-I 和cTn-C。cTn-T 對(duì)早期和晚期心肌壞死均具有很高的診斷價(jià)值。

各組小鼠血清中cTn-T 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。ISO 引起小鼠血清心肌損傷生物標(biāo)記物cTn-T 水平顯著升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，大黃素-大黃素二蒽酮10 mg·kg-1能顯著降低小鼠血清cTn-T 水平（P＜0.05），且活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖4 各組小鼠血清中cTn-T水平（±s, n=4）

3.3 大黃素-大黃素二蒽酮對(duì)ISO致心肌缺血小鼠血清心肌酶CK-MB含量的影響

CK-MB 是判斷心肌壞死的另一個(gè)臨床特異性和敏感性指標(biāo)。各組小鼠血清中CK-MB水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。ISO 能引起小鼠血清CK-MB 水平顯著升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，大黃素-大黃素二蒽酮（10 mg·kg-1）能顯著降低ISO引起的血清CK-MB水平升高（P＜0.05），且活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1）。

圖5 各組小鼠血清中CK-MB水平（±s, n=4）

4 討論

本課題組首次建立從何首烏中快速制備大黃素-大黃素二蒽酮的分離方法，并對(duì)其進(jìn)行了抗心肌缺血活性篩選，初步確定其在10 mg·kg-1的劑量顯示較好的活性，且活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥地爾硫卓（20 mg·kg-1），為進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究該類(lèi)成分的藥理活性提供參考。在后續(xù)的研究中，一方面要分別考察反式、順式-大黃素-大黃素二蒽酮的抗心肌缺血活性，另一方面還需要考察其不同劑量的抗心肌缺血活性，進(jìn)而獲得半數(shù)有效量，有助于系統(tǒng)評(píng)價(jià)其治療指數(shù)，從而評(píng)價(jià)該類(lèi)成分的安全性。

與此同時(shí)，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，何首烏中二蒽酮類(lèi)成分為微量成分[26]，除了大黃素-大黃素二蒽酮，還存在40 余個(gè)潛在二蒽酮類(lèi)成分[27]。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該類(lèi)成分的抗心肌缺血活性及其作用機(jī)制，有必要對(duì)該類(lèi)成分進(jìn)行靶向分離與純化，從而闡明何首烏抗心肌缺血活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。