王海波 馮心怡 羅園園 歐詩雅 劉延慶

（1.揚州大學醫(yī)學院，江蘇揚州 225001；2.揚州大學醫(yī)藥研究所，江蘇揚州 225001）

痛風性關節(jié)炎是由于體內(nèi)嘌呤代謝異常引起的一種常見且復雜的關節(jié)炎類型，一般男性發(fā)病率高于女性[1-2]。該病多由于血液中尿酸含量增高，形成尿酸鹽結(jié)晶，沉積在關節(jié)腔而引發(fā)。關節(jié)腔中沉積的尿酸鹽結(jié)晶會刺激周圍神經(jīng)和免疫系統(tǒng)，導致關節(jié)出現(xiàn)劇烈疼痛和局部炎癥反應[3]。急性痛風性關節(jié)炎患者常見關節(jié)突然出現(xiàn)活動受限并伴有嚴重的紅、腫、熱、痛，且血尿酸水平較高[4]。近年來，痛風性關節(jié)炎在我國的發(fā)病呈現(xiàn)低齡化，發(fā)病率呈上升趨勢[5-6]。目前，臨床治療痛風性關節(jié)炎仍以緩解癥狀為主，常用藥物包括甾體類抗炎藥、苯溴馬隆和秋水仙堿等[7-8]。這類藥物可以在短期內(nèi)抑制痛風性關節(jié)炎的炎癥反應和緩解臨床癥狀，達不到徹底治愈的效果，且多具有明顯的副作用，如惡心、嘔吐和肝功能障礙等，不宜長期服用[9-10]。越來越多的基礎研究和臨床研究證實，中醫(yī)藥治療痛風性關節(jié)炎有明確的療效[11-13]。痛風康復方由劉延慶教授治療痛風的經(jīng)驗方化裁精簡而來，已在臨床運用多年，取得了很好的臨床療效，其治療痛風及相關疾病已獲得國家發(fā)明專利（201610960451.9）。本研究擬制作急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠，觀察痛風康復方治療急性痛風性關節(jié)炎的作用及安全性，并探索其治療機制，為痛風康復方的臨床應用和后期開發(fā)提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200 g左右，購于揚州大學比較醫(yī)學中心，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0029。本研究方案經(jīng)揚州大學醫(yī)學院倫理委員會審查并批準。

1.2 藥物與試劑 痛風康復方由土茯苓、徐長卿、生薏苡仁、鬼箭羽四味中藥組成。中藥飲片鬼箭羽、土茯苓、徐長卿購自安徽惠隆中藥飲片有限責任公司，批號：20140326、20150321、20 141224；生薏苡仁購自蘇州市天靈中藥飲片有限責任公司，批號：150319010。取等比例各味藥物由揚州市中醫(yī)院中藥制劑室煎煮，藥液濃縮后終濃度為以生藥量計1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

尿酸納晶體（MSU，Sigma公司，貨號：U2875），秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司，批號：150208），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0105S），腺嘌呤（Adenine，Sigma公司，貨號：A8626），高酵母飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司），熱熒光蛋白芯片（廣州瑞博奧生物科技股份有限公司，貨號：QAR-INF-1）。

1.3 主要儀器 離心機（美國Thermo公司，型號：Sorvall ST 8），激光掃描儀（法國Innopsys公司，型號：InnoScan 300 Microarray Scanner），芯片洗板機（美國Thermo公司，型號：Wellwash Versa），恒溫搖床（美國精騏，型號：IS-RDD3），全自動血液細胞分析儀（日本Horiba公司，型號：LC-170CRP）。

2 實驗方法

2.1 造模 取Wistar雄性大鼠，用定制高酵母飼料和腺嘌呤溶液適應性喂養(yǎng)1周后麻醉，于大鼠右后踝關節(jié)腔注射0.1 mL尿酸鈉晶體懸濁液（100 g/L）。注射后2 h進行模型評估，關節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹、皮膚焮紅、疼痛拒按等炎癥反應時表示造模成功。

2.2 分組與給藥 取造模成功的大鼠隨機分為模型組、痛風康復方低劑量組、痛風康復方高劑量組和秋水仙堿組，每組10只，另取10只正常大鼠為正常組。模型組、正常組大鼠每日灌服等體積蒸餾水，痛風康復方低、高劑量組分別每日灌胃5 g/kg、10 g/kg痛風康復方濃縮液，秋水仙堿組以每日0.3 mg/kg劑量的秋水仙堿溶液灌胃，各組大鼠均連續(xù)灌胃3 d。痛風康復方低劑量組給藥劑量相當于人常用劑量。

2.3 樣品采集及處理 各組大鼠于灌胃3 d后，異氟烷麻醉，剖殺。取血，保存部分全血以檢測腎功能，部分血液分離血清并立刻放入-80 ℃冰箱保存以備檢測炎癥因子；抽取大鼠右后肢踝關節(jié)關節(jié)液以備檢測中性粒細胞；分離大鼠完整的肝臟與腎臟，另取痛風康復方高劑量組大鼠心臟與睪丸做組織形態(tài)學觀察。

2.4 指標檢測

2.4.1 關節(jié)腫脹程度 于造模前和給藥開始后每隔12 h用電子游標卡尺測量各組大鼠右后踝關節(jié)下1 mm處的直徑，計算相對腫脹度。相對腫脹度=（干預后各檢測時間點大鼠右后踝關節(jié)直徑－造模前大鼠右后踝關節(jié)直徑）/造模前大鼠右后踝關節(jié)直徑×100%。

2.4.2 炎癥因子 使用熱熒光檢測技術檢測各組大鼠血清白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）相對值。

2.4.3 中性粒細胞富集程度 取各組大鼠關節(jié)液涂片，晾干后先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋，2 min后滴加吉姆薩染液2～3滴，用洗耳球吹均勻，再加入磷酸鹽緩沖液，使膜表面形成表面張力，持續(xù)染色約30 min，流水沖洗，晾干鏡檢。顯微鏡下隨機選取5個視野進行中性粒細胞計數(shù)，取平均值。以模型組中性粒細胞數(shù)量為標準，計算各組大鼠關節(jié)液中中性粒細胞富集程度。中性粒細胞富集程度=該組中性粒細胞鏡下平均數(shù)量/模型組中性粒細胞鏡下平均數(shù)量×100%。

2.4.4 腎功能 取各組大鼠全血于全自動血液細胞分析儀上檢測肌酐和尿素氮水平。

2.4.5 肝腎臟器系數(shù) 取各組大鼠完整的肝臟和腎臟，及時稱重，計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)又稱臟體比，是實驗動物某臟器的重量與其體重之比值。臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100。

2.4.6 主要臟器組織形態(tài)學 取痛風康復方高劑量組大鼠肝、腎、心和睪丸，福爾馬林浸泡固定，1周后取出，脫水透明，石蠟包埋并切片，HE染色，晾干切片，于正置高倍光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料以（x-±s）表示（本研究所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布），多組間比較采用ANVOA單因素方差分析，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠關節(jié)腫脹度比較 造模后大鼠腫脹的關節(jié)會自行消腫，但如圖1A所示，與模型組比較，治療期間各給藥組大鼠關節(jié)的消腫速度明顯加快。灌胃3 d后，各給藥組大鼠的關節(jié)相對腫脹度明顯低于模型組（P＜0.001），而各給藥組組間關節(jié)相對腫脹度比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1B。

圖1 各組大鼠關節(jié)腫脹度比較（n=10）

3.2 各組大鼠痛風相關炎癥因子比較 模型組大鼠血清IL-1β、IL-2、TNF-α、MCP-1 水 平 均明顯高于正常組（P＜0.001，P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均明顯降低（P＜0.001，P＜0.05），其中痛風康復方各劑量組IL-1β、IL-2和TNF-α水平顯著低于秋水仙堿組（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），而上述指標痛風康復方高、低劑量組組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠痛風相關炎癥因子相對值比較（x-±s）

3.3 各組大鼠關節(jié)液中中性粒細胞富集程度比較 正常組大鼠關節(jié)液中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)中性粒細胞，而模型組關節(jié)液中發(fā)現(xiàn)大量中性粒細胞。與模型組比較，各給藥組大鼠關節(jié)液中中性粒細胞富集程度均顯著降低（P＜0.001），其中痛風康復方各劑量組中性粒細胞富集程度均顯著低于秋水仙堿組（P＜0.001），痛風康復方高劑量組中性粒細胞富集程度顯著低于低劑量組（P＜0.001）。詳見表2。

表2 各組大鼠關節(jié)液中中性粒細胞富集程度比較（x-±s）

3.4 各組大鼠腎功能指標及肝腎臟器系數(shù)比較 各組大鼠血肌酐和尿素氮水平、肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表3、表4。

表3 各組大鼠血肌酐和尿素氮水平比較（x-±s） 單位：mmol/L

表4 各組大鼠肝腎臟器系數(shù)比較（x-±s）

3.5 各組大鼠主要臟器組織形態(tài)學比較 結(jié)果顯示，經(jīng)過連續(xù)3 d的給藥，痛風康復方高劑量組大鼠的肝臟、心臟、腎臟和睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，均未見明顯的組織損傷，見圖2。

圖2 痛風康復方高劑量組大鼠肝臟、心臟、腎臟和睪丸組織病理圖片（HE染色，×400）

4 討論

隨著我國痛風發(fā)病率的不斷增加，痛風患者群體亟需效果好、副作用少的治療方案以緩解癥狀，提高生活質(zhì)量。痛風康復方已在臨床運用多年，可顯著改善高尿酸血癥和痛風性關節(jié)炎患者的臨床癥狀。本研究結(jié)果亦表明，痛風康復方可以明顯加快急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠患側(cè)關節(jié)腫脹的消退，且高、低劑量作用相當，說明常規(guī)劑量即可獲得很好的消腫療效。

IL-1β、IL-2、TNF-α和MCP-1均為痛風性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中重要的調(diào)節(jié)和參與因子。IL-1β是經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)因子IL-1的一種，調(diào)節(jié)著炎癥反應發(fā)生和進展的各個過程。中性粒細胞可被IL-1因子召集，在組織局部誘導多種間質(zhì)細胞釋放不同的蛋白分解酶，促進局部炎癥介質(zhì)的釋放，使組織產(chǎn)生炎癥級聯(lián)效應，使局部組織間質(zhì)細胞分泌大量的前列腺素和膠原酶，加速軟骨及滑膜的退化，對關節(jié)損傷很大[14]。IL-2屬于趨化因子家族，其與IL-1β一起可以通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，加速軟骨的溶解退化，IL-2對B細胞的生長及分化均有一定的促進作用[15]。因此，抑制IL-1β和IL-2對于保護痛風引起的關節(jié)損傷十分重要。本研究結(jié)果表明，痛風康復方能抑制急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠血清IL-1β和IL-2因子水平，推測其可能通過此作用減少炎癥局部基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，減緩軟骨的溶解退化，從而緩解關節(jié)腫脹。TNF-α對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在炎癥反應的起始階段，是炎癥發(fā)生的啟動因子[16]。MCP-1是趨化性細胞因子β亞家族的典型因子，可以趨化各種炎癥相關因子向炎癥部位聚集，同時其既可以激活單核細胞也可以同時趨化誘導單核細胞，與炎性疾病的關系非常密切[17]。痛風康復方對TNF-α和MCP-1均具有明顯的抑制作用，推測其可能通過抑制TNF-α在早期抑制炎癥反應的啟動，通過抑制MCP-1減少單核細胞的活化和趨化，抑制炎癥反應的發(fā)生。痛風康復方對上述炎癥因子的抑制作用可能是該方緩解尿酸鹽沉積引起的病理性炎癥反應，改善痛風性關節(jié)炎臨床癥狀的潛在機制。痛風康復方低劑量組和高劑量組對炎癥因子的抑制水平相當，提示常規(guī)劑量即可較好地抑制炎癥因子，且后續(xù)的研究可以選用低劑量。

中性粒細胞是痛風性關節(jié)炎早期炎癥最重要的細胞，本研究結(jié)果表明，痛風康復方可以顯著減少炎癥環(huán)境中中性粒細胞的數(shù)量，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，推測其可能通過抑制中性粒細胞的富集，抑制炎癥的進程。

為了進一步驗證痛風康復方的安全性，我們還檢測了短期服用該復方后，大鼠的腎功能及臟器情況，結(jié)果表明連續(xù)服用中藥3 d后，大鼠腎功能、肝腎臟器系數(shù)均正常，肝、腎、心臟和睪丸等臟器組織結(jié)構(gòu)完好，均未見明顯的損傷，說明痛風康復方有較高的安全性。

綜上，痛風康復方可以明顯加速急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠患肢腫脹的消退，降低炎癥因子，且在短期內(nèi)服用無明顯毒副反應。痛風康復方抑制痛風相關炎癥因子的具體作用機制還有待進一步研究。