羅玉秀，雷帆，滕守連，崔小青

（1 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016；2 青海省海東市民和縣總堡鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，青海海東 810800）

油菜是我國種植最為廣泛的油料作物[1]，青藏高原海拔高、氣候冷涼，植物生長季節(jié)短，適宜油菜種植[2]，既能保證農(nóng)業(yè)收入，又能增加旅游收入。因而在休閑農(nóng)業(yè)中得到了廣泛運(yùn)用，種植面積有所增加[3]。原本大面積種植青稞的地區(qū)，現(xiàn)以油菜和青稞相間呈帶狀或條塊狀種植，展現(xiàn)出別樣的魅力[4]。

油菜作為觀賞植物大面積種植時(shí)，花色單一，易引起視覺疲勞[5-6]。近年來，育種學(xué)家以同屬十字花科的蘿卜和諸葛菜為彩色基因供體，通過遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，創(chuàng)制出彩色油菜資源，各大實(shí)驗(yàn)室利用這些資源，開展了彩色油菜品種（系）選育工作[7]。本研究在青藏高原植物資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室開展了相關(guān)研究工作，并選育出多個(gè)彩色甘藍(lán)型油菜品種（系）。在以油菜為主題的休閑農(nóng)業(yè)區(qū)，搭配種植不同花色的彩色油菜，營造大面積、多元化的觀賞景觀，對游客具有更大的吸引力和震撼力，可促進(jìn)休閑農(nóng)業(yè)發(fā)展。目前，彩色油菜種子市場需求量較大，其質(zhì)量優(yōu)劣直接影響觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。因此，快速、有效地鑒定彩色油菜種子的純度和真實(shí)性十分有必要。

形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定是鑒定作物品種的常用方法。形態(tài)學(xué)鑒定雖然操作簡單，但耗時(shí)長，易受環(huán)境和人為因素的影響[9]。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)是快速、準(zhǔn)確、高效的分子鑒定技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展為育種學(xué)家研究作物性狀的遺傳特性奠定了良好的理論基礎(chǔ)，也為品種純度和真實(shí)性鑒定提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障[10]。該技術(shù)不受取材部位、取材時(shí)間和環(huán)境的影響，大大提高了鑒定的準(zhǔn)確性，縮短了鑒定時(shí)間，是最為科學(xué)有效的鑒定品種（系）純度和真實(shí)性的方法。

近年來，分子標(biāo)記指紋圖譜在作物品種鑒定、注冊、質(zhì)量監(jiān)測及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面起到不可替代的作用[8]，可用于構(gòu)建指紋圖譜的DNA 分子標(biāo)記方法有多種，如RFLP[10]、RAPD[11]、SRAP[12]、AFLP[13]、ISSR[14]、SSR[7，8，15]、特異性標(biāo)記[16]等。其中，SSR 標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組，對DNA質(zhì)量和數(shù)量要求不高，操作簡單，具有位點(diǎn)多態(tài)性高、條帶重復(fù)性佳、試驗(yàn)穩(wěn)定性強(qiáng)、共顯性遺傳等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因此，在DNA 分子標(biāo)記技術(shù)中脫穎而出，成為構(gòu)建指紋圖譜最常用的手段[7，8，16]。SSR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于玉米[17]、水稻[18]、油菜[19-20]、大豆[21]等作物指紋圖譜構(gòu)建和品種純度鑒定研究中。在青藏高原植物資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室，已用該項(xiàng)技術(shù)構(gòu)建青海省主栽春油菜品種指紋圖譜[9]。

1 試驗(yàn)?zāi)康?/h2>

從509 對SSR 引物中，篩選出7 對材料間具有多態(tài)性的SSR 引物，從30 對特異性引物，篩選出6 對材料間具有多態(tài)性的引物，并用13 對引物構(gòu)建10 份彩色油菜品種（系）的指紋圖譜。旨在為開發(fā)春性彩色油菜分子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，快速有效鑒定市場流通彩色油菜的真實(shí)性和質(zhì)量提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

本研究材料共10 份，包括8 個(gè)彩色甘藍(lán)型油菜品種（系）、1 個(gè)甘藍(lán)型油菜常規(guī)品種（青油14 號）、1 個(gè)春性甘藍(lán)型油菜雜交品種（青雜5 號）。青雜5 號和青油14來源于種子實(shí)體店，R4、P1 和P2 來源于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，其他材料于實(shí)驗(yàn)室選育（見表1）。選出飽滿的種子分別種植于花盆，并在光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，每個(gè)材料隨機(jī)選取10 個(gè)單株做好標(biāo)記，用于分子鑒定。

表1 試驗(yàn)材料

2.2 引物

試驗(yàn)所用SSR 引物由生工生物公司合成（見表2）。30 對特異性引物是自行設(shè)計(jì)并委托生工生物公司合成。

2.3 DNA 提取方法

取油菜幼苗2 葉1 心期的第1 片真葉，采用CTAB法，提取基因組DNA；采用微量核酸蛋白分析儀，測定DNA 濃度和純度；采用瓊脂糖凝膠，檢測DNA 質(zhì)量。各樣品DNA 按檢測結(jié)果配制為50ng/μL 工作液。每個(gè)材料10 個(gè)單株的DNA 等量混合，建立基因池，用于多態(tài)性引物篩選。

2.4 PCR 的擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件

PCR 反應(yīng)用10μL 體系，各成分（見表2）。PCR 反應(yīng)條件：94℃（2min）；94℃（45s）、59℃（30s）、72℃（45s），共10 個(gè)循環(huán)，每循環(huán)退火溫度降低0.5℃；94℃（45s）、54℃（30s）、72℃（45s），共30個(gè)循環(huán)；72℃（1min）。然后在4℃條件下保存。

表2 PCR 擴(kuò)增體系

2.5 等位基因檢測

用6%聚丙烯酰胺凝膠分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染顯影后讀帶。僅記錄多態(tài)性位點(diǎn)，清晰可辨的多態(tài)性位點(diǎn)，有條帶記為“1”，無帶記為“0”，不清晰記為“3”。利用NTSYS 2.10e 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

3 結(jié)果分析

3.1 多態(tài)性引物篩選

用509 對SSR 引物對10 份材料的DNA 池進(jìn)行引物篩選，初步選出12 對多態(tài)性較強(qiáng)的引物。進(jìn)一步篩選結(jié)果證明，其中7 對引物的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、差異明顯。7 對引物共擴(kuò)增出22 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物擴(kuò)增2～5 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對引物擴(kuò)增出3.1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)最多的引物為P21，擴(kuò)增出5 個(gè)；擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)最少的引物為P27 和P180，只擴(kuò)增出2 個(gè)。多態(tài)性比例達(dá)40%～100%，擴(kuò)增條帶大小在90～820bp，可用于構(gòu)建指紋圖譜。

由圖1 可知擴(kuò)增結(jié)果，由表3 可知當(dāng)選引物。30 對A2 染色體上的特異引物對10 份材料的DNA 池進(jìn)行引物篩選，最終篩選出6 對特異性引物，其擴(kuò)增位點(diǎn)具有多態(tài)性，且條帶清晰、穩(wěn)定、差異明顯，擴(kuò)增位點(diǎn)1～3 個(gè)，平均2 個(gè)。6 對引物共擴(kuò)增出12 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，擴(kuò)增條帶大小在90～550bp，可用于構(gòu)建指紋圖譜。

圖1 引物SSR52 的擴(kuò)增結(jié)果

表3 篩選出的SSR 和特異性引物

3.2 指紋圖譜構(gòu)建

當(dāng)選的7 對SSR 引物和6 份特異性引物，構(gòu)建10份彩色油菜的基因分型和指紋圖譜。PCR 擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)凝膠電泳顯影后記錄，多態(tài)性位點(diǎn)用引物和條帶大小表示，品種的指紋圖譜用“1”和“0”表示，即為該品種的數(shù)碼圖譜。將每對引物的每個(gè)品種數(shù)碼圖譜組合到一起，構(gòu)成每個(gè)品種的數(shù)碼指紋圖譜（見表4）。引物P13 構(gòu)建的指紋，能將參試材料中的普通黃花油菜與彩色油菜分開，引物P21 構(gòu)建的指紋，能將10 份材料彼此分開。13對引物共獲得10 份材料，32 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的340 個(gè)信息，其指紋圖譜相同概率僅為（1/2）340，說明材料間通過指紋圖譜甄別區(qū)分的幾率極大。

表4 10 份材料的DNA 指紋圖譜

3.3 聚類分析

利用NTSYS 2.10e 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建10 份材料的聚類分析圖（見圖2）。在遺傳距離0.63處，可將10 份材料分成3 類，其中，彩色油菜及其親本聚到第Ⅰ類；Y1（淺黃花）和青雜5 號（黃花）分別聚到第II 類和第III 類；彩色油菜中雜交種PY1 和PH1 與其雙親聚在一個(gè)亞類，雜交種RH1 與其雙親聚到另一亞類。說明彩色油菜與黃色油菜遺傳距離遠(yuǎn)，青雜5 號與彩色油菜間差異最大，其次是PY1，粉色不育系與紫色不育系遺傳距離最近。聚類結(jié)果區(qū)分出10 份參試材料分子水平的遺傳關(guān)系，為育種工作進(jìn)行親本選配提供了背景參考。

圖2 聚類分析結(jié)果

4 結(jié)論

表型鑒定操作簡單，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易受主觀因素和環(huán)境的影響[22]。甘藍(lán)型油菜遺傳基礎(chǔ)狹窄，可用于品種鑒定的表型標(biāo)記，僅有籽粒顏色、花色、葉色、生長習(xí)性等少數(shù)幾個(gè)，且多數(shù)為數(shù)量性狀，表型差異小，難以區(qū)分[23]?；ㄉ誀钍且粋€(gè)明顯的標(biāo)記性狀，但等到花期才能辨別，鑒定周期長。分子標(biāo)記直接從DNA 水平上反應(yīng)品種間的遺傳多樣性，多態(tài)性十分豐富[24]。分子標(biāo)記技術(shù)是品種（系）真?zhèn)渭凹兌辱b定的首選方法，具有準(zhǔn)確、高效、方便等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有彩色甘藍(lán)型油菜品種（系）指紋圖譜的構(gòu)建，對于育種、品種登記、知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)及生產(chǎn)等環(huán)節(jié)均有重要意義。

本試驗(yàn)從539 對引物中，篩選出13 對具有多態(tài)性的引物，并構(gòu)建10 種材料的指紋圖譜，該圖譜能將10份研究材料準(zhǔn)確區(qū)分開來。圖譜中多態(tài)性位點(diǎn)用引物及條帶大小表示，位點(diǎn)用“1”和“0”表示，清晰明了、分辨率和實(shí)用性強(qiáng)，可作為甄別不同材料的工具。聚類分析結(jié)果顯示，10 種材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.4～0.86，聚類結(jié)果與遺傳背景相吻合，聚類結(jié)果可信。說明SSR 分子標(biāo)記結(jié)合特異性標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜，能充分反映油菜不同品種之間的遺傳差異，在新品種登記、保護(hù)、鑒定等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。