馬孟杰， 彭小忠, 2) *， 舒鵬程 *

(1)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心， 北京 100005；2)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所， 北京 100021)

神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells, NPCs)在哺乳動(dòng)物新皮質(zhì)發(fā)育過程中發(fā)揮核心的作用。在小鼠大腦皮質(zhì)中，神經(jīng)祖細(xì)胞主要分為兩類，一類是位于腦室周區(qū)(ventricular zone，VZ)的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(radial glial cells，RGCs)，另一類是位于腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)的中間神經(jīng)前體細(xì)胞(intermediate progenitor cells，IPs)，二者都具有增殖和分化成神經(jīng)元的潛能，但具有不一樣的特性[1]。RGCs是其中最主要的神經(jīng)祖細(xì)胞，既可通過對(duì)稱分裂生成2個(gè)相同的RGCs維持神經(jīng)祖細(xì)胞的數(shù)量，還可以通過不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生IPs以及神經(jīng)元[2]。而且，RGCs具有另外1個(gè)標(biāo)志性特征是其細(xì)胞核會(huì)沿著頂-底軸(apical-basal axis)動(dòng)態(tài)遷移，也稱為內(nèi)部動(dòng)態(tài)核遷移(interkinetic nuclear migration，INM)[3-5]。研究表明，INM與RGCs細(xì)胞周期進(jìn)程以及調(diào)控細(xì)胞接受信號(hào)有關(guān)。其中，M期細(xì)胞核沿著室周排布，而S期細(xì)胞核主要位于基底(basal)側(cè)[6-8]。但是，目前對(duì)于INM的調(diào)控機(jī)制仍了解較少。

發(fā)育過程中基因表達(dá)受到各層次的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后水平等。表觀遺傳調(diào)控在基因表達(dá)調(diào)控中的作用已被眾多研究證明。其中，組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分。組蛋白二價(jià)修飾，即特定基因組位點(diǎn)同時(shí)存在H3K4me3和H3K27me3修飾，在大腦皮層發(fā)育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9]。單獨(dú)的H3K4me3修飾與基因表達(dá)成正相關(guān)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，H3K4me3修飾主要由蛋白質(zhì)復(fù)合體介導(dǎo)，稱為COMPASS(complex of proteins associated with Set1, COMPASS)復(fù)合體[10]。

ASH2L(absent, small, or homeotic 2-like)是COMPASS復(fù)合體的核心成員之一，參與復(fù)合體對(duì)組蛋白H3K4甲基化修飾，從而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)[11,12]。Ash2l基因在物種間具有高度保守性[13]。本實(shí)驗(yàn)室于2001年首次克隆得到人源Ash2l序列，并對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASH2L在胎兒肝、睪丸等器官中高表達(dá)，并且對(duì)造血細(xì)胞過程和特定白血病的形成具有調(diào)節(jié)作用[14]。2019年，有研究證實(shí)，在造血干細(xì)胞中敲除Ash2l之后會(huì)影響造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖能力[15]。在神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，Ash2l被預(yù)測(cè)為尼古丁暴露所致的皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育不良的靶標(biāo)分子，它參與調(diào)控神經(jīng)元的樹突棘的形成[16]。最新的臨床研究表明，受母親孕期吸煙的行為影響的后代中，Ash2l表達(dá)水平與正常相比，呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異[17]。ASH2L主要的生物學(xué)功能是參與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的組裝，輔助組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝和腫瘤抑制等作用[18,19]。另外，ASH2L被認(rèn)為對(duì)維持細(xì)胞整體H3K4甲基化水平具有關(guān)鍵的作用[11]。

以往的研究結(jié)果表明，在小鼠大腦皮質(zhì)中特異性敲除Ash2l嚴(yán)重影響大腦皮質(zhì)的發(fā)育，尤其是淺層神經(jīng)元的生成[20]。我們進(jìn)一步探索了Ash2l對(duì)NPCs細(xì)胞周期的調(diào)控，明確了缺失Ash2l導(dǎo)致大腦皮質(zhì)發(fā)育異常的原因，包括NPCs空間分布的異常和細(xì)胞周期阻滯。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： Ash2lfl/fl小鼠委托北京百奧賽圖生物公司構(gòu)建，D6-Cre工具小鼠由美國耶魯大學(xué)鐘偉民教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑： 氯化鈉 (生工生物工程：A501218)，氯化鉀 (Dimond：A100395)，氯化鎂 (M2670)，磷酸二氫鉀 (BBI：A600445)，磷酸氫二鈉 (BBI：A610404)，TritonX-100 (Chemical)，組織包埋劑 (Tissue-Tek：O.C.T. Compoud)，DAPI染色封片一體劑 (Sigma：F6057)?？贵w：Anti-Cyclin A (Abcam：ab270940)、Anti-Pax6 (Covance：prb-278p)、Anti-Tbr2 (Thermo：14-4875-82)、Anti-pH3 (Covance：prb-278p)、Anti-BrdU (中杉金橋：ZM-0013)、Anti-Ki67 (Abcam：ab15580)，Alexa Fluor 488 山羊抗兔 (Molecular：CA-11008)、Alexa Fluor 594山羊抗小鼠 (Molecular：CA-11005)、Click-iT EdU Alexa Fluor 647 (Invitrogen：A32933)。

1.2 方法

1.2.1 在體EdU、BrdU雙標(biāo)記法 參考以往核酸類似物雙標(biāo)記法[21]，用EdU替換碘苷(iododeoxyuridine, IddU)。按照50 ～ 100 mg/kg比例，向懷孕的母鼠腹腔注射相應(yīng)量的EdU，1.5 h之后注射等量的BrdU，0.5 h后處死孕鼠，取胚胎腦組織。

1.2.2 組織處理和免疫熒光 將收集的小鼠腦組織浸泡在足量的4% PFA中，4 ℃固定24 h，第2 d換成25%的蔗糖溶液，4 ℃脫水24 h，用O.C.T.包埋組織，存放于-80 ℃。用組織冰凍切機(jī)，對(duì)腦組織進(jìn)行冠狀切片，每張厚度為16 μm，貼于載玻片上。

第1 d：將切片從-80 ℃冰箱中取出，恢復(fù)至室溫，50 ℃烘箱，烤片30 min。此步驟可防止發(fā)生脫片。用0.5% Triton X-100緩沖液稀釋綿羊血清至5% 濃度，室溫孵育1 h，封閉切片上非特異性抗原位點(diǎn)。再孵育一抗 (稀釋比例1∶100 ～ 1∶1 000)，4 ℃過夜。BrdU染色前,需要用2N HCl處理組織30 min，1 ×PBS洗3次,之后再用封閉液封閉非特異抗原位點(diǎn)。

第2 d：將切片用1×PBS洗3次，根據(jù)一抗的來源選擇相應(yīng)的二抗 (稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h，1 × PBS洗3次，用DAPI封片。EdU染色應(yīng)在蛋白質(zhì)抗體孵育完二抗之后，室溫1 ～ 3 h均可。

第3 d：使用Zeiss LSM780激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3 大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)提取及Western印跡檢測(cè) 將所獲得胚胎小鼠的大腦皮質(zhì)暴露在視野中，用眼科鑷夾取兩側(cè)大腦半球的腦皮層，放置于1.5 mL離心管中，立即將離心管放入液氮，防止蛋白質(zhì)發(fā)生降解。用槍頭將組織吹打混勻至勻漿狀，冰上裂解30 min，低溫高速離心提取腦組織蛋白質(zhì)，-80 ℃保存用于Western 印跡檢測(cè)。

配制10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，將收集的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)通過半干轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。再用TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，直接4 ℃過夜孵育一抗。孵育結(jié)束，取NC膜，在TBST中洗3次，每次5 min。隨后，孵育對(duì)應(yīng)源二抗，室溫孵育1.5 h。二抗孵育結(jié)束，TBST洗膜3次，每次5 min，隨后進(jìn)行曝光。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，確定蛋白質(zhì)的相對(duì)含量用于分析。

1.2.4 神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì) 利用Adobe Photoshop (PS)軟件的計(jì)數(shù)功能，對(duì)腦組織切片染色結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖中目的抗體染色陽性且與DAPI重合的點(diǎn)為1個(gè)陽性細(xì)胞，每組統(tǒng)計(jì)結(jié)果均分別計(jì)數(shù)了3對(duì)染色結(jié)果。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有實(shí)驗(yàn)均收集3對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，用Graphpad Prism分析各組Mean ±SD，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05標(biāo)記為“*”；P<0.01標(biāo)記為“**”；P<0.001標(biāo)記為“***”。

2 結(jié)果

2.1 敲除Ash2l的神經(jīng)祖細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力降低、分布紊亂

在E16.5對(duì)照小鼠大腦皮質(zhì)中，神經(jīng)祖細(xì)胞包括分布于VZ區(qū)的RGCs(PAX6陽性)和分布于SVZ區(qū)的IPs(TBR2陽性)。Ash2l-cKO小鼠大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量減少，RGCs和IPs的P值分別0.0075和0.0016，并且RGCs和IPs分布出現(xiàn)紊亂(Fig. 1A)。30 min EdU插入實(shí)驗(yàn)顯示，在對(duì)照組中，30 min內(nèi)有大量的NPCs發(fā)生DNA復(fù)制，而Ash2l-cKO的神經(jīng)祖細(xì)胞在30 min內(nèi)幾乎未見細(xì)胞發(fā)生DNA復(fù)制(P=0.0005)，說明NPCs的增殖能力嚴(yán)重受損(Fig. 1B)。另外，未發(fā)生DNA復(fù)制的神經(jīng)祖細(xì)胞仍有許多是Ki67陽性，說明這些NPCs并未退出細(xì)胞周期，提示細(xì)胞周期可能發(fā)生了阻滯。

Fig.1 Ash2l knockout affected the number distribution and proliferation of NPCs (A) Co-labelling with RGC marker PAX6 and IP marker TBR2 to identify the number and distribution of NPCs and analysis of the number of RGCs and IPs per mm2. (B) Co-labelling with 30 minutes of EdU and the proliferating cell marker Ki67 and analysis of the number of EdU-positive cells per mm2. Scale bar=200 μm. n=3

2.2 Ash2l缺失使神經(jīng)祖細(xì)胞 G2細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)下調(diào)，M期的細(xì)胞核分布紊亂

增殖的RGCs存在內(nèi)部動(dòng)態(tài)核遷移現(xiàn)象(Fig. 2A)。RGCs形態(tài)修長(zhǎng)并沿著頂-底軸分布。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，細(xì)胞核會(huì)沿此軸運(yùn)動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞核在貼近腦室的區(qū)域完成分裂(M期)之后，細(xì)胞核在G1期逐漸遠(yuǎn)離頂部區(qū)域向底部遷移，并在底部區(qū)完成DNA復(fù)制(S期)，接著細(xì)胞核于G2期時(shí)逐步遷移回到頂部區(qū)，最后在腦室區(qū)繼續(xù)完成一次分裂(M期)。通過免疫熒光對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，利用M期的標(biāo)注物 pH3觀察神經(jīng)祖細(xì)胞分裂的情況。結(jié)果顯示，正常大腦皮質(zhì)中，M期的NPCs細(xì)胞核會(huì)沿著VZ區(qū)排布，而Ash2l敲除后的細(xì)胞核分布位置散落在頂-底軸，并且沿著腦室排布的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，P=0.0003(Fig. 2B)，這說明Ash2l影響NPCs的M期的正常進(jìn)程。進(jìn)一步檢測(cè)E16.5 d時(shí),小鼠大腦皮質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)情況(Fig. 2C)，發(fā)現(xiàn)Ash2l-cKO小鼠大腦皮質(zhì)中G2期細(xì)胞周期蛋白A(cyclin A)表達(dá)下調(diào)。

Fig.2 Ash2l knockout affects cyclin expression and cell division in NPCs (A) The graphic diagram of RGC interkinetic nuclear migration. (B) Co-labelling with 30 minutes of EdU and pH3 and analysis the number of pH3-positive cells along the ventricle. (C) Detection the expression level of cyclin A in the Ash2l-cKO cerebral cortex. Scale bar=200 μm. n=3

2.3 Ash2l缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞S期長(zhǎng)度縮短

Fig.3 The length of S phase is shortened in Ash2l-cKO NPCs (A) The strategy of EdU and BrdU double-labelling. (B) Left: Co-staining of EdU and BrdU in the cerebral cortex. Right: the S-phase length of NPCs. Scale bar=200 μm. n=3

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)發(fā)育過程中，一直以來人們致力于解決神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期與細(xì)胞命運(yùn)決定之間的關(guān)系。在對(duì)發(fā)育中的脊髓的研究發(fā)現(xiàn)，前神經(jīng)因子(proneural)對(duì)脊髓動(dòng)物神經(jīng)發(fā)生發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，Proneural家族編碼具有helix-loop-helix (bHLH)基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，包括Neuro G1/2/3[22]。在雞胚神經(jīng)管過表達(dá)Neuro G2，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞提早退出細(xì)胞周期，伴隨著BrdU無法插入的表型[23]。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，Neuro G2激活可導(dǎo)致周期調(diào)控蛋白亞型Cyclin D1/E1/E2/A2 表達(dá)量迅速減少。表型分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞主要是阻滯在G1期，無法進(jìn)入S期。并且，他們還揭示了細(xì)胞周期退出和細(xì)胞命運(yùn)決定是兩個(gè)獨(dú)立的過程。在正常的發(fā)育過程中，Neuro G2負(fù)責(zé)緊密地協(xié)調(diào)這兩個(gè)過程[24]。隨著哺乳動(dòng)物端腦皮層發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生，端腦VZ區(qū)的NPCs細(xì)胞周期長(zhǎng)度會(huì)增加，尤其是G1期的長(zhǎng)度[25]。通過不同的分子標(biāo)志物區(qū)分神經(jīng)前體細(xì)胞的亞群，人們發(fā)現(xiàn)G1長(zhǎng)度增長(zhǎng)與NPCs向IP轉(zhuǎn)變有關(guān)。另外，主要功能是擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量的神經(jīng)祖細(xì)胞，比命運(yùn)為神經(jīng)元的祖細(xì)胞擁有更長(zhǎng)的S期[26]。

在背側(cè)大腦皮層發(fā)育過程中，NPCs發(fā)揮決定性的作用。NPCs具有分裂、增殖和分化的能力，最終產(chǎn)生不同類型的子代神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此，NPCs穩(wěn)態(tài)的維持是保證新皮層生理功能的先決條件，任何影響NPCs增殖、分化和命運(yùn)決定的改變，都有可能損害NPCs穩(wěn)態(tài)從而導(dǎo)致多種疾病，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常和腫瘤[27]。研究表明，隨著神經(jīng)發(fā)生，大腦VZ區(qū)的NPCs細(xì)胞周期長(zhǎng)度會(huì)增加，尤其是G1期長(zhǎng)度，而且細(xì)胞周期的調(diào)控對(duì)NPCs的命運(yùn)決定具有重要作用[25,26]。在小鼠大腦皮質(zhì)條件性敲除Ash2l之后，研究者發(fā)現(xiàn)，小鼠的大腦皮質(zhì)發(fā)育嚴(yán)重受損，尤其是淺層神經(jīng)元生成障礙，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白 D1表達(dá)下調(diào)，Cyclin E1表達(dá)上調(diào)，這證明了NPCs的G1期受到影響[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育后期，Ash2l敲除小鼠大腦皮質(zhì)中的兩類NPCs排布紊亂，原分布在VZ區(qū)的RGCs減少，分布在SVZ區(qū)的IPs細(xì)胞核滯留在VZ區(qū)，結(jié)合30 min EdU插入異常，進(jìn)一步說明了NPCs增殖能力下降。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上[21]，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，并成功地證明Ash2l-cKO小鼠NPCs的S期長(zhǎng)度縮短，細(xì)胞的DNA復(fù)制受到影響。另外，Cyclin A作為細(xì)胞周期G2期的蛋白質(zhì)[28]，在大腦皮質(zhì)中的表達(dá)量也出現(xiàn)了下調(diào)。最后，M期的NPCs細(xì)胞核分布紊亂，說明Ash2l敲除之后影響了RGCs細(xì)胞核遷移現(xiàn)象。因此，本研究提示了Ash2l可能是RGCs細(xì)胞INM過程形成的重要調(diào)控分子，為揭示RGC細(xì)胞INM的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。

綜上所述，在Ash2l敲除鼠的大腦皮質(zhì)中，NPCs的增殖能力減弱，細(xì)胞周期G1-S-G2-M各時(shí)期均受到嚴(yán)重的影響，進(jìn)一步導(dǎo)致NPCs穩(wěn)態(tài)失調(diào)，使NPCs不能按照既定的程序分裂、分化形成神經(jīng)元，導(dǎo)致個(gè)體的腦皮質(zhì)發(fā)育異常，皮質(zhì)變薄，最終個(gè)體表現(xiàn)出不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)癥，例如小頭畸形、腦積水和癲癇等[20]。我們的工作對(duì)胚胎時(shí)期Ash2l表達(dá)改變所致的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，進(jìn)行了深層的原因探索，揭示了Ash2l在個(gè)體早期神經(jīng)發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的線索和思路。

本研究仍存在許多不足之處。由于本研究所使用的工具鼠為D6-Cre，D6-Cre表達(dá)情況在個(gè)體之間存在差異，不同的敲除小鼠之間的敲除效率存在差異，導(dǎo)致表型嚴(yán)重程度不同[29]。另外，本研究尚未進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究。