李明棟 王佳佳 葛倩倩 秦 楨 劉 萍 李 健 李吉濤

脊尾白蝦水通道蛋白基因4和11在堿度脅迫過(guò)程中的作用*

李明棟1,2王佳佳1,2葛倩倩1,2秦 楨1,2劉 萍1,2李 健1,2李吉濤1,2①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071)

水通道蛋白(aquaporin)是一種細(xì)胞膜上特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子及其他中性代謝分子的膜蛋白家族，對(duì)生物的細(xì)胞內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了了解水通道蛋白在脊尾白蝦()應(yīng)對(duì)堿度脅迫中的作用，本研究利用RACE技術(shù)成功克隆了脊尾白蝦水通道蛋白4 (aquaporin 4,)與水通道蛋白11 (aquaporin 11,)基因cDNA全長(zhǎng)，基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?21 bp，編碼206個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為21.673 kDa，理論等電點(diǎn)為8.30，為疏水性蛋白，具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為783 bp，編碼260個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為28.490 kDa，理論等電點(diǎn)為5.40，為疏水性蛋白，具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)結(jié)果顯示，基因與羅氏沼蝦()同源性最高，為94.63%；與斑節(jié)對(duì)蝦()同源性最高，為81.47%。為驗(yàn)證水通道蛋白的功能，利用RNA干擾技術(shù)特異性沉默和基因，結(jié)果顯示，碳酸鹽堿度脅迫后，注射干擾后的脊尾白蝦死亡率顯著升高，干擾組72 h死亡率達(dá)到45%，干擾組72 h死亡率達(dá)到55%，與對(duì)照組差異顯著(<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，干擾組在碳酸鹽堿度脅迫24、48與72 h時(shí)的血液滲透壓變化幅度顯著高于對(duì)照組(<0.05)，72 h時(shí)滲透壓顯著升高(<0.05)；干擾組血液滲透壓在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(<0.05)。以上結(jié)果表明，水通道蛋白在脊尾白蝦應(yīng)對(duì)堿度脅迫過(guò)程中起到了調(diào)節(jié)滲透壓、維持體內(nèi)外離子平衡的作用。

脊尾白蝦；水通道蛋白；基因克?。粷B透壓

脊尾白蝦()又稱(chēng)小白蝦、迎春蝦，主要分布于黃渤海淺海低鹽水域，是我國(guó)重要的中小型經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。脊尾白蝦為廣溫、廣鹽、廣布種，具有生長(zhǎng)速度快、繁殖周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為我國(guó)沿海地區(qū)的特色養(yǎng)殖品種。我國(guó)有低洼鹽堿水域4600萬(wàn)hm2，具有養(yǎng)殖潛力的鹽堿水面積可達(dá)667萬(wàn)hm2，鹽堿水由于具有高pH、高碳酸鹽堿度及離子組成復(fù)雜等特點(diǎn)，阻礙了鹽堿水資源的充分開(kāi)發(fā)利用。脊尾白蝦作為一種對(duì)鹽堿環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)，是開(kāi)展甲殼類(lèi)鹽堿適應(yīng)分子機(jī)制研究的理想材料。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一種細(xì)胞膜上特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子及其他中性代謝分子的膜蛋白家族(馮學(xué)超等, 2005; 王渝等, 2014)。目前，共有13種哺乳動(dòng)物水通道蛋白被鑒定，根據(jù)其功能可分為三類(lèi)：AQP0、AQP1、AQP2、AQP4和AQP5僅對(duì)水分子有通透性，為水選擇性水通道蛋白；AQP3、AQP7、AQP9和AQP10對(duì)水、甘油、尿素等均有通透性，為水甘油通道蛋白；AQP11與AQP12的功能還未確定且基因同源性低，為超級(jí)水通道蛋白。水通道蛋白對(duì)生物的細(xì)胞內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用，其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生存意義重大?，F(xiàn)階段對(duì)水通道蛋白的研究主要集中于植物與哺乳動(dòng)物，研究表明，植物水通道蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)根部的導(dǎo)水率來(lái)增加水分的吸收以響應(yīng)鹽脅迫與干旱脅迫；在哺乳動(dòng)物中，水通道蛋白在腎臟的表達(dá)量最高，在水運(yùn)輸?shù)闹饕M織中發(fā)揮重要作用(Li, 2019; 段夢(mèng)莎, 2020; 郝建峰, 2020; 李娟等, 2021; 李青云, 2020; 張亞楠等, 2019)。目前，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物水通道蛋白的研究尚少，主要集中于三疣梭子蟹() (王渝等, 2014)、中華絨螯蟹() (楊志剛等, 2021)、薩羅羅非魚(yú)() (甘遠(yuǎn)迪, 2014)等水產(chǎn)動(dòng)物中，研究表明，水通道蛋白基因在水產(chǎn)動(dòng)物的腸道、胃與鰓組織中相對(duì)表達(dá)量較高，且鹽度脅迫可顯著改變其表達(dá)模式，推測(cè)水通道蛋白在水產(chǎn)動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用。本研究根據(jù)前期堿度脅迫下脊尾白蝦的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆堿度脅迫下的差異表達(dá)基因和，并分析其序列特征；利用RNA干擾技術(shù)特異性地沉默和基因的表達(dá)，然后對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行堿度脅迫，驗(yàn)證和基因在堿度脅迫過(guò)程中的作用。結(jié)果可為解析脊尾白蝦響應(yīng)堿度脅迫機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

實(shí)驗(yàn)用脊尾白蝦平均體長(zhǎng)為(2.1±0.4) cm，均取自山東日照海辰水產(chǎn)有限公司。實(shí)驗(yàn)前將脊尾白蝦在100 L的桶中暫養(yǎng)7 d，按時(shí)投喂飼料，連續(xù)充氧。

取6尾體長(zhǎng)、體重相近且活力旺盛的脊尾白蝦，取其鰓、肝胰腺、肌肉、腸、血細(xì)胞和胃組織于液氮中儲(chǔ)存，用于合成RACE模板。

1.2 AQP4與AQP11基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

使用Up Plus RNA試劑盒(TRAN, 中國(guó))提取脊尾白蝦RNA。配制1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的條帶完整性；使用Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。RACE模板第一鏈?zhǔn)褂肧MARTer?RACE 5′/3′試劑盒合成。根據(jù)脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組中與的測(cè)序結(jié)果，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3′與5′引物，引物序列見(jiàn)表1。使用Advantage 2 Polymerase Mix高保真聚合酶依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的基因RACE 5′和3′末端巢式PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化，然后挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng)M13通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，并將所篩選的菌液進(jìn)行測(cè)序。

表1 水通道蛋白基因克隆所用引物序列

Tab.1 The sequence of primers used for AQP gene cloning

1.3 生物信息學(xué)分析

使用Contig Express軟件進(jìn)行拼接，得到基因與基因cDNA全長(zhǎng)，將cDNA序列用ORFFinder在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框，得到基因的氨基酸序列后，使用在線軟件SignalP-5.0 Server (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)、SMART(http://smart.embl- heidelberg.de/)、TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)和ProtParam tool(http://web. expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)信號(hào)肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白跨膜情況、蛋白質(zhì)特性和親水性。

利用在線軟件NCBI BLAST (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因與其他物種的同源性和一致性；使用DNAMAN軟件對(duì)多個(gè)物種氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbor- joining進(jìn)化樹(shù)。

1.4 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

1.4.1 dsRNA的合成 使用T7 RNAi Transcription Kit-BOX1 (Vazyme, 中國(guó))合成dsRNA。合成干擾的引物需添加T7啟動(dòng)子，使用在線設(shè)計(jì)軟件https:// www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

本次干擾實(shí)驗(yàn)以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein (GFP)為對(duì)照，具體的合成步驟：將GFP質(zhì)粒溶解，取2 μL質(zhì)粒溶液加入100 μL大腸桿菌() DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，42℃熱激90 s，再冰浴2 min，加入900 μL未加卡那霉素(KAN)的LB液體培養(yǎng)基，200 r/min震蕩培養(yǎng)45 min。將菌液6000 r/min離心5 min，取沉淀涂至已加KAN的LB固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)12 h以上。挑取單克隆菌落至已加KAN的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 h。以培養(yǎng)后的菌液為模板，使用T7 RNAi Transcription Kit-BOX1按照dsRNA合成步驟合成GFP，其引物GFP-T7F：GATCACTAATACGACTCACT ATAGGGATGGTGAGCAAGGGGGAGGA；GFP-T7R：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGTTACTTGTACAGCTCGTCCA。

1.4.2 dsRNA的注射 準(zhǔn)備9個(gè)10 L整理箱，每個(gè)箱子加入8 L海水，調(diào)節(jié)其碳酸鹽堿度至8.26 mmol/L，穩(wěn)定24 h，每天調(diào)節(jié)2次海水堿度。設(shè)置GFP組、組和組，每組3個(gè)平行。挑選體長(zhǎng)、體重相近的脊尾白蝦進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，每個(gè)箱子放入10尾蝦，依據(jù)組別在脊尾白蝦的第4腹足基部注射干擾，注射量為1 μg/g，觀察記錄脊尾白蝦在24、48和72 h的死亡率。

另設(shè)置空白組、GFP組、組和組，調(diào)節(jié)其碳酸鹽堿度至8.26 mmol/L，每個(gè)箱子放入30尾脊尾白蝦，依據(jù)組別在脊尾白蝦的第4腹足基部注射干擾，注射量為1 μg/g，空白組不進(jìn)行脅迫與干擾，在24、48和72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取其血液測(cè)量滲透壓，并取鰓組織檢測(cè)其中基因表達(dá)量。

1.4.3 干擾后血淋巴滲透壓的變化 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6尾蝦的血淋巴混合測(cè)量其滲透壓。將混合后的血淋巴樣品放入4℃冰箱中24 h后，3000 r/min離心15 min，取60 μL上清液，使用滲透壓測(cè)定儀測(cè)量滲透壓，每個(gè)樣品測(cè)量3次。

1.4.4 干擾后AQP基因表達(dá)量的檢測(cè) 在干擾后24、48和72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取GFP組、組與組的鰓組織，液氮研磨，使用Up Plus RNA kit (TRAN，中國(guó))提取RNA。

通過(guò)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析與在不同組織中的表達(dá)，以18S基因作為內(nèi)參基因，針對(duì)、與18S設(shè)計(jì)特異性引物(表2)，按照ChamQTM SYBR?Color qPCR master mix說(shuō)明書(shū)，利用熒光定量PCR儀器進(jìn)行定量分析，通過(guò)2–ΔΔCt法計(jì)算分析注射干擾后與基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，運(yùn)用多重比較進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

表2 qRT-PCR所用引物

Tab.2 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 EcAQP4與EcAQP11基因cDNA的克隆與序列分析

本研究利用RACE技術(shù)成功克隆了脊尾白蝦與的cDNA全長(zhǎng)，序列分析結(jié)果顯示，基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為621 bp，共編碼206個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為21.673 kDa，理論等電點(diǎn)為8.30，為疏水性蛋白(圖1)；跨膜分析結(jié)果顯示，該基因跨膜5次；SMART分析顯示，該基因具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)?；騉RF長(zhǎng)度為783 bp，共編碼261個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子量為28.490 kDa，理論等電點(diǎn)為5.40，為疏水性蛋白(圖3)；跨膜分析結(jié)果顯示，該基因跨膜4次；SMART分析顯示，該基因具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4)。

2.2 AQP4與AQP11氨基酸序列及同源性分析

將EcAQP4與ECAQP11的氨基酸序列在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與EcAQP4氨基酸序列同源性較高的物種有羅氏沼蝦()斑節(jié)對(duì)蝦()、凡納濱對(duì)蝦()、三疣梭子蟹(圖5)；與EcAQP11氨基酸序列同源性較高的物種有斑節(jié)對(duì)蝦、灰眼雪蟹()、凡納濱對(duì)蝦(圖6)。同源性分析顯示，EcAQP4具有多個(gè)保守區(qū)域，其中與羅氏沼蝦同源性最高，為94.63%，與三疣梭子蟹同源性最低，為68.14%，所比對(duì)的物種均含有HINPAVT和PLAIGL這2個(gè)保守域；EcAQP11比EcAQP4保守性較差，與斑節(jié)對(duì)蝦同源性最高，達(dá)到81.47%，與灰眼雪蟹同源性最低，為67.18%。

2.3 AQP4與AQP11基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 7.0軟件對(duì)脊尾白蝦與基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖7，圖8)，結(jié)果顯示，基因的進(jìn)化樹(shù)分為兩支，第一支為節(jié)肢動(dòng)物門(mén)，第二支為脊索動(dòng)物門(mén)，脊尾白蝦與羅氏沼蝦聚為一支，親緣關(guān)系最為相近，與其他甲殼綱動(dòng)物親緣關(guān)系也較近；脊索動(dòng)物門(mén)中的硬骨魚(yú)類(lèi)為一支，與脊尾白蝦親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；虻倪M(jìn)化樹(shù)分為兩支，第一支為昆蟲(chóng)綱，第二支為甲殼綱，脊尾白蝦與斑節(jié)對(duì)蝦與凡納濱對(duì)蝦聚為一支，親緣關(guān)系較近。

圖1 EcAQP4基因cDNA全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列

ATG：起始密碼子；TAA：終止密碼子。圖3同。

ATG: Initiation codon; TAA: Termination codon. The same as in Fig.3.

圖2 EcAQP4的跨膜結(jié)構(gòu)域

圖3 EcAQP11基因ORF及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖4 EcAQP11的跨膜結(jié)構(gòu)域

2.4 RNA干擾后EcAQP4與EcAQP11的表達(dá)變化

取干擾后脊尾白蝦的鰓組織，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)2個(gè)基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量。結(jié)果顯示，注射dsRNA對(duì)脊尾白蝦與基因干擾效果明顯。與GFP對(duì)照組相比，基因在注射干擾24 h與48 h后的表達(dá)量下降80%左右，72 h干擾效果逐漸減弱；基因在注射干擾24 h時(shí)表達(dá)量下降87%，干擾效果顯著，48 h時(shí)基因表達(dá)量下降60%，72 h時(shí)基因表達(dá)量下降35%。

2.5 RNA干擾對(duì)脊尾白蝦死亡率的影響

統(tǒng)計(jì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組別的死亡率，如圖10所示。與GFP組相比，注射干擾后，與組死亡率顯著升高(<0.05)，說(shuō)明RNA干擾這2個(gè)基因表達(dá)后，脊尾白蝦耐堿度能力降低，最終導(dǎo)致死亡。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)24 h與48 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)AQP11組死亡率顯著高于AQP4組(<0.05)，在72 h時(shí)2組死亡率接近，相比基因，基因能夠更加快速地影響脊尾白蝦滲透壓調(diào)節(jié)能力，在脊尾白蝦耐堿機(jī)制中起到更為重要的作用。綜上所述，與基因?qū)刮舶孜r耐堿能力有重要的作用。

圖5 EcAQP4基因氨基酸序列與其他已知物種同源序列比對(duì)

NPA結(jié)構(gòu)單元以方框表示；2個(gè)保守序列HINPAVT和PLAIGL以下劃線表示。

The NPA structural motifs are marked in the box. Two conserved sequences (HINPAVT and PLAIGL) are underlined.

2.6 RNA干擾對(duì)脊尾白蝦血液滲透壓的影響

使用滲透壓測(cè)量?jī)x測(cè)量各組在不同時(shí)間點(diǎn)脊尾白蝦的血液滲透壓，結(jié)果如圖11所示。與空白組相比，堿度脅迫后，脊尾白蝦血液滲透壓顯著升高(<0.05)，這是由于水體堿度升高，其中的離子濃度也隨之升高，脊尾白蝦體內(nèi)累積的離子升高所導(dǎo)致，但總體來(lái)看，GFP組脊尾白蝦血液滲透壓相對(duì)穩(wěn)定，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；干擾組的滲透壓變化趨勢(shì)與GFP組相同，在48與72 h時(shí)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)其滲透壓高于GFP組；干擾組滲透壓則是一直升高的，72 h時(shí)顯著升高(<0.05)，升高的幅度較大。推測(cè)干擾與基因表達(dá)后，水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響，脊尾白蝦滲透壓調(diào)節(jié)能力降低，造成AQP4組上升與下降趨勢(shì)大于對(duì)照組；AQP11干擾組脊尾白蝦滲透壓上升明顯，說(shuō)明EcAQP11在脊尾白蝦滲透壓調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是脊尾白蝦耐堿機(jī)制中的重要基因。

圖6 EcAQP11基因氨基酸序列與其他已知物種同源序列比對(duì)

圖7 基于EcAQP4基因氨基酸序列構(gòu)建的Neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)

圖8 基于EcAQP11基因氨基酸序列構(gòu)建的Neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)

圖9 脊尾白蝦注射干擾后EcAQP4 (A)與EcAQP11 (B)基因的表達(dá)情況

GFP為對(duì)照組。不同字母表示差異顯著(<0.05)，下同。

GFP was the control group. Different letters indicate significant difference (<0.05). The same as below.

圖10 RNA干擾后脊尾白蝦的死亡率

圖11 RNA干擾后脊尾白蝦的血液滲透壓變化

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因的分析，發(fā)現(xiàn)在堿度脅迫后，與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的基因大量表達(dá)，為了進(jìn)一步了解脊尾白蝦的耐堿機(jī)制，我們從差異表達(dá)基因中挑選了水通道蛋白這一滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因(Deane, 2006; Holm, 2005; MacIver, 2009; Preston, 1992; Robinson, 1996; 隋海心等, 2004)，通過(guò)RACE技術(shù)克隆cDNA全長(zhǎng)并對(duì)其進(jìn)行序列分析，利用RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證其在堿度脅迫過(guò)程中的響應(yīng)機(jī)制。

3.1 AQP4與AQP11基因的氨基酸序列及同源性分析

本研究利用RACE技術(shù)首次克隆獲得脊尾白蝦與基因的cDNA全長(zhǎng)，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦基因保守性較好，具有HINPAVT和PLAIGL兩個(gè)保守域，與高沿等(2017)研究結(jié)果相同。

3.2 EcAQP4與EcAQP11基因的功能驗(yàn)證

水通道蛋白是生物細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的重要結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡中起重要作用，現(xiàn)階段關(guān)于水通道蛋白的研究有很多，最初人們?cè)谀X星形膠質(zhì)細(xì)胞、胃壁細(xì)胞和腎集合小管等部位發(fā)現(xiàn)AQP4蛋白，它是一種水特異性通道蛋白，僅對(duì)水分子具有滲透性，其在人體中主要作用為維持腦內(nèi)水平衡及腦水腫發(fā)生發(fā)展(張士保等, 2013)。現(xiàn)階段對(duì)AQP4的研究主要集中于其在腦水腫、視神經(jīng)脊髓炎(Yang, 2013)、癲癇(Hsu, 2011)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所起的作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制主要是維持細(xì)胞間隙K+緩沖與滲透壓平衡，但其在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究還未見(jiàn)報(bào)道?；蛟诟鱾€(gè)物種之間的氨基酸同源性低，功能尚不確定，但有研究表明，具有水轉(zhuǎn)運(yùn)活性，作為水通道發(fā)揮作用(Yakata, 2007)，對(duì)體內(nèi)水的穩(wěn)態(tài)平衡有重要作用(He, 2017)，其發(fā)揮作用的主要方式為維持上皮細(xì)胞水和離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，保持細(xì)胞滲透壓平衡。

為驗(yàn)證與兩基因在脊尾白蝦適應(yīng)堿度脅迫中所起的作用，本研究設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)的dsRNA，對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行注射干擾后，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了堿度脅迫后上述2個(gè)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)基因的表達(dá)均發(fā)生了顯著下降，說(shuō)明所設(shè)計(jì)的dsRNA具有良好的干擾效果。對(duì)脊尾白蝦注射干擾后進(jìn)行堿度脅迫，發(fā)現(xiàn)其死亡率明顯升高，堿度脅迫72 h時(shí)，組死亡率達(dá)到45%，組達(dá)到55%，說(shuō)明基因的沉默對(duì)脊尾白蝦的耐堿度能力產(chǎn)生明顯影響。滲透壓測(cè)定結(jié)果顯示，與空白組相比，GFP對(duì)照組血液滲透壓升高，各時(shí)間點(diǎn)總體變化不大，從側(cè)面反映了脊尾白蝦的耐堿能力較強(qiáng)。滲透壓的變化趨勢(shì)總體來(lái)說(shuō)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與鹽堿脅迫對(duì)尼羅羅非魚(yú)()血清滲透壓變化趨勢(shì)相同(趙麗慧等, 2014)。在堿度脅迫條件下，脊尾白蝦體內(nèi)的離子逐漸累積增強(qiáng)，導(dǎo)致血液滲透壓增高，但脊尾白蝦通過(guò)體內(nèi)的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制將滲透壓維持穩(wěn)定。與GFP對(duì)照組相比，干擾組脊尾白蝦的血液滲透壓上升下降的幅度變大，說(shuō)明基因的沉默表達(dá)影響了脊尾白蝦的滲透壓調(diào)節(jié)能力，從而導(dǎo)致脊尾白蝦耐堿度能力減弱，死亡率升高。相比對(duì)照組和干擾組，干擾組的滲透壓升高更明顯，且呈現(xiàn)一直升高的趨勢(shì)，這可能是基因在脊尾白蝦耐堿機(jī)制中起到了更重要的作用，其對(duì)脊尾白蝦的滲透壓調(diào)節(jié)影響較大。前文提到，基因現(xiàn)階段的功能與調(diào)控機(jī)制尚未完全解析，但本研究結(jié)果表明，基因在脊尾白蝦滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

本研究成功克隆了脊尾白蝦與基因，設(shè)計(jì)干擾dsRNA并對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行注射沉默上述2個(gè)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，注射干擾后的脊尾白蝦在堿度脅迫下死亡率明顯升高；干擾組脊尾白蝦血液滲透壓變化幅度增大，干擾組血液滲透壓升高明顯，干擾與表達(dá)后的脊尾白蝦耐堿度脅迫能力減弱，表明上述2個(gè)基因在脊尾白蝦適應(yīng)堿度脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

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The Roles of Aquaporin Gene 4 and 11 ofunder Alkalinity Stress

LI Mingdong1,2, WANG Jiajia1,2, GE Qianqian1,2, QIN Zhen1,2, LIU Ping1,2, LI Jian1,2, LI Jitao1,2①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China;2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China)

Aquaporins are a family of cell membrane proteins, and their key role is to specifically transport water molecules and other neutral metabolic molecules. Moreover, aquaporins play an important role in regulating the balance between internal and external osmotic pressure in organisms. Here, aquaporin 4 and 11 genes fromwere successfully cloned using rapid amplification of cDNA ends cloning. The open reading frame ofis 621 bp, encoding 206 amino acids, with a predicted molecular weight of 21.673 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.30; it is a hydrophobic protein with five transmembrane structural domains. The open reading frame ofis 783 bp, encoding 260 amino acids, with a predicted molecular weight of 28.490 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.40; it is a hydrophobic protein with four transmembrane domains. In sequence alignment, AQP4 inshared the highest homology with that in(94.63%), while AQP11 inshared the highest homology with that in(81.47%).Furthermore, RNA interference was used for silencingandexpression to verify their function. In carbonate alkalinity stress, the mortality ofincreased significantly following RNA interference. At 72 h, mortality reached 45% and 55% in theandgroups, respectively, being significantly higher than that in the control group. The blood osmotic pressure ofin thegroup was significantly higher than that in the control group. Similarly, the blood osmotic pressure ofin thegroup was significantly increased. In summary, aquaporins play important roles in regulating osmotic pressure and maintaining ion balance in response to alkalinity stress in.

; Aquaporin;Gene cloning; Osmolality

LI Jitao, E-mail: lijt@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20211231003

S917

A

2095-9869(2022)04-0051-10

*國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2018YFD0901302)、國(guó)家自然科學(xué)基金(32072974)、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2020TD46)共同資助 [This study was supported by National Key Research and Development Program of China (2018YFD0901302), National Natural Science Foundation of China (32072974), China Agriculture Research System of MOF and MARA, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 李明棟，E-mail: lmdanyany@163.com

李吉濤，研究員，E-mail: lijt@ysfri.ac.cn

2021-12-31,

2022-02-11

http://www.yykxjz.cn/

李明棟, 王佳佳, 葛倩倩, 秦楨, 劉萍, 李健, 李吉濤. 脊尾白蝦水通道蛋白基因4和11在堿度脅迫過(guò)程中的作用. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(4): 51–60

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(編輯 馮小花)