張旭敏，謝 龍，趙雨芯，李芝蓓，李小芳

茶皂素穩(wěn)定的芹菜素納米乳制備及其體外釋放研究

張旭敏，謝 龍，趙雨芯，李芝蓓，李小芳*

成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

以茶皂素為天然乳化劑制備芹菜素納米乳液（AP-NE），并對其進行穩(wěn)定性和體外釋放特性的考察，以期獲得新型綠色的納米制劑。采用高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)制備AP-NE，以平均粒徑和多分散指數(shù)（PDI）為自變量，運用總評歸一值（OD）法對數(shù)據(jù)進行處理，采用Box-Behnken效應面法優(yōu)化處方并進行驗證，并對最優(yōu)處方制備的AP-NE進行理化性質(zhì)和體外釋放特性考察。優(yōu)化結(jié)果表明AP-NE的最優(yōu)制備處方為芹菜素質(zhì)量分數(shù)0.40%、茶皂素質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、油相用量（蓖麻油-辛癸酸甘油酯1∶3）3 mL；測得AP-NE的平均粒徑為（259.5±3.6）nm、PDI為0.103±0.005、ζ電位為（?35.81±0.42）mV、電導率為（88.60±1.00）μS/cm，pH為7.37±0.08，溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，載藥量為（5.77±0.08）%，濁度為（99.45±1.69）cm?1（＝3）；經(jīng)染色法鑒別為O/W乳液，透射電子顯微鏡觀察乳滴不粘連，大小均一，呈圓球狀；穩(wěn)定性試驗表明AP-NE穩(wěn)定性良好；體外釋放研究表明AP-NE中芹菜素的釋放具有緩慢和持續(xù)的趨勢。以茶皂素作為乳化劑制備的納米乳可明顯提高芹菜素的溶解度和穩(wěn)定性，是一種潛在的可提高藥物有效性的新型納米制劑。

芹菜素；納米乳；茶皂素；高速剪切-高壓均質(zhì)技術(shù)；Box-Behnken效應面法；理化性質(zhì)；穩(wěn)定性；體外釋放

芹菜素（apigenin），又稱芹黃素、洋芹素，是一種天然植物黃酮，大量存在于常見的水果和蔬菜中，例如橙子、柚子、芹菜、歐芹、洋蔥、百里香、薄荷、橄欖、甘菊和麥牙菜中，被認為是一種具有抗炎、抗氧化和抗癌作用的生物活性類黃酮[1-4]。然而，由于芹菜素在水中溶解度低，最大溶解度為2.16 μg/mL，且腸通透性高，被歸為生物藥劑學分類系統(tǒng)（Biopharmaceutics Classification System，BCS）的II類藥物[5]，嚴重影響其口服生物利用度進而影響其臨床療效的發(fā)揮。目前，為了改善芹菜素溶解度和生物利用度低的問題，大量學者引入了多種新型的制劑，例如納米晶[6-7]、納米粒[8-9]、醇質(zhì)體[10]、膠束[11]、納米囊[12]、乳劑[13-14]，這些制劑存在載藥量低，加入大量合成輔料使安全性降低等問題。

納米乳作為一種新型載體，其內(nèi)部同時存在親水和親油區(qū)域，可以形成牢固的油水界面膜，能顯著改善難溶性藥物的溶解性和生物利用度，為解決中藥難溶性有效成分和有效部位的成藥性問題提供了新思路[15]。然而，合成類表面活性劑的加入給制劑臨床上的使用帶來了安全隱患，例如聚山梨酯-80會導致嚴重的神經(jīng)毒性、腎毒性或細胞毒性，長期使用會對人體產(chǎn)生毒副作用[16]。

茶皂素分子是由疏水性的苷元和親水性的糖體以及有機酸3部分構(gòu)成，由于其糖體、有機酸及配基上的羥基是親水基團，同時五元環(huán)配基主體為疏水基團，因此，茶皂素可作為一種天然非離子型表面活性劑[17-18]，近年來已被應用于多種研究[16,19-22]之中。本實驗以天然表面活性劑茶皂素為乳化劑制備芹菜素納米乳（apigenin nanoemulsion，AP-NE），旨在提高芹菜素的溶解度和生物利用度，并探索茶皂素作為天然穩(wěn)定劑的可能。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測器，美國Agilent公司；AH100D型高壓均質(zhì)機，加拿大ATS公司；NICOMP 380ZLS型激光粒度測定儀，美國PSS粒度儀公司；DDS-11C型電導率儀、pHs-2F pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；C25型實驗室分散乳化均質(zhì)機，上海恒川機械設(shè)備有限公司；XMI9007-8型智能溫濕度儀，重慶英博實驗儀器有限公司；80-1型離心沉淀器，江蘇正基儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-6100型紫外分光光度儀，上海美譜達儀器有限公司；JEM 1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司。

1.2 材料

芹菜素對照品（批號MUST-21030615，質(zhì)量分數(shù)98.03%），成都曼斯特生物科技有限公司；芹菜素（批號GL20201223，質(zhì)量分數(shù)98.30%）、茶皂素（批號GL20200429，質(zhì)量分數(shù)90.31%），西安小草植物科技有限責任公司；辛癸酸甘油酯（CT，食品級）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM，日化級）、棕櫚酸異丙酯（PI，日化級），山東優(yōu)索化工科技有限公司；油酸、蓖麻油、甲醇，均為分析純，成都市科隆化學品有限公司；油酸乙酯，批號20180926，質(zhì)量分數(shù)98.0%～100.0%，化學純，國藥集團化學試劑有限公司；聚山梨酯-80、磷酸（GR級），成都市科龍化工試劑廠；透析袋MD34-5m（截留相對分子質(zhì)量8000～14 000），成都諾舟生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 AP-NE的制備

采用高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)法制備AP-NE[23]。精密稱取處方量的芹菜素原料藥，加入油相，超聲使其充分混勻。另精密稱取處方量的茶皂素，加入去離子水，超聲使其充分溶解，作為水相。將水相轉(zhuǎn)入油相中，置于轉(zhuǎn)速為19 000 r/min的高速剪切機下進行剪切2 min，制得粗乳液，將粗乳液在100 MPa壓力條件下進行高壓均質(zhì)6次，即得AP-NE。

在不加原料藥的條件下，按AP-NE的制備方法制備，即得空白納米乳。

2.2 芹菜素的測定

參考文獻方法[4,8]進行。

2.2.1 色譜條件[8]色譜柱為Comatex-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長337 nm；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（62∶38）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備[23]精密稱取芹菜素對照品5.32 mg，置于50 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，超聲，定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為106.40 μg/mL的芹菜素對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取芹菜素納米乳液（AP-NE）1 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲30 min破乳后，靜置10 min，用甲醇定容，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 乳液分層指數(shù)的計算

將制得的AP-NE裝于玻璃瓶中，室溫靜置，定時觀察分層、絮凝、沉淀等現(xiàn)象，記錄乳液層高度，計算乳液分層指數(shù)[23]。

分層指數(shù)＝1－H/0

H、0分別為、0時刻乳液層的高度

2.4 Box-Behnken響應面法優(yōu)化AP-NE處方

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計試驗 在前期單因素試驗[4]的基礎(chǔ)上，以芹菜素質(zhì)量分數(shù)（1）、茶皂素質(zhì)量濃度（2）、油相用量（3）為影響因素，分別以AP-NE的平均粒徑（1）和PDI（2）的總評歸一值（overall desirability，OD）為評價指標，采用3因素3水平的Box-Behnken效應面法進行試驗設(shè)計[24-25]。因素與水平及試驗安排與結(jié)果見表1。由于2個指標值均越小越好，因此選用公式OD＝(12…d)1/n以及d＝(max－Y)/(max－min)對OD值進行計算。

2.4.2 數(shù)學模型擬合及分析 基于以上數(shù)據(jù)，使用Design-Expert 8.0.6軟件對OD值進行多元回歸二次多項式擬合，得到回歸方程OD＝0.83－0.0921＋0.0302＋0.0693＋0.19012＋0.20013＋0.01323－0.40012－0.05822－0.09432，2＝0.978 9，＜0.000 1。

方差分析結(jié)果（表2）表明該模型的值小于0.000 1，表明該模型有意義，可用于優(yōu)化AP-NE的制備工藝。回歸方程的擬合決定系數(shù)2為0.978 9＞0.95，表明實測值與預測值之間存在高度的相關(guān)性，能準確預測實驗結(jié)果；其校正決定系數(shù)（adj2）＝0.951 8，表明模型響應值的變化有95.18%來源于本實驗所選自變量，實驗誤差較小，試驗方法可靠。以上數(shù)據(jù)表明，該模型可用于預測和分析AP-NE的最佳制備工藝。

2.4.3 響應面優(yōu)化與預測 根據(jù)擬合結(jié)果，繪制三維效應曲線圖，預測AP-NE的最佳制備處方工藝，結(jié)果見圖1。基于Box-Behnken響應面，通過Design- Expert 8.0.6軟件預測優(yōu)化后的最優(yōu)處方為芹菜素質(zhì)量分數(shù)0.40%，茶皂素質(zhì)量濃度2.04 mg/mL，油相用量為2.98 mL，最優(yōu)配方的OD預測值為0.842。為使測定結(jié)果更加準確，優(yōu)化處方修改為AP質(zhì)量分數(shù)0.40%，茶皂素質(zhì)量濃度2.00 mg/mL，油相用量3.00 mL。

表1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

Table 1 Arrangement and results of response surface test

編號X1/%X2/(mg?mL?1)X3/mLY1/nmY2OD編號X1/%X2/(mg?mL?1)X3/mLY1/nmY2OD 10.30 (?1)1.75 (?1)2.40 (0)252.20.1980.597100.30 (?1)2.00 (0)0.60 (?1)282.70.1620.547 20.40 (0)2.25 (+1)0.60 (?1)294.80.1010.573110.50 (+1)1.75 (?1)2.40 (0)262.30.2890.000 30.40 (0)1.75 (?1)4.20 (+1)262.40.1230.750120.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)254.80.1290.778 40.30 (?1)2.00 (0)4.20 (+1)320.60.1290.263130.40 (0)1.75 (?1)0.60 (?1)272.90.1550.619 50.50 (+1)2.25 (+1)2.40 (0)302.10.0950.516140.50 (+1)2.00 (0)4.20 (+1)274.50.1910.522 60.30 (?1)2.25 (+1)2.40 (0)285.20.2300.363150.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)253.40.0930.869 70.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)251.70.1350.779160.40 (0)2.25 (+1)4.20 (+1)284.90.0350.756 80.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)260.00.0900.836170.50 (+1)2.00 (0)0.60 (?1)329.10.0880.000 90.40 (0)2.00 (0)2.40 (0)252.30.0950.871

表2 OD回歸方程的方差分析

Table 2 Variance analysis of regression equation of OD

方差來源離差平方和自由度均方F值P值方差來源離差平方和自由度均方F值P值 模型1.17090.13036.08＜0.000 1X120.67010.670185.73＜0.000 1 X10.06710.06718.530.003 5X220.01410.0143.920.088 2 X27.293×10?317.293×10?32.020.198 6X320.03710.03710.270.015 0 X30.03810.03810.520.014 2殘差0.02573.617×10?3 X1X20.14010.14038.860.000 4失擬項0.01735.606×10?32.640.186 0 X1X30.16010.16044.920.000 3純誤差8.500×10?342.125×10?3 X2X36.611×10?416.611×10?40.180.681 8總離差1.20016

圖1 X1、X2、X3對OD值影響的效應曲面圖

2.4.4 處方驗證試驗 結(jié)合既定的工藝參數(shù)，根據(jù)上述修正后的最佳處方，平行制備3批AP-NE，測得平均粒徑、PDI和OD值見下表3。各實測值與預測值接近，說明采用總評歸一法得到的回歸方程預測性良好，處方的優(yōu)化較為理想。

表3 驗證試驗(, n = 3)

Table 3 Verification test (, n = 3)

批次粒徑/nmPDIOD值 1259.5±3.60.103±0.0050.811±0.003 2261.7±4.20.099±0.0040.807±0.007 3260.3±2.90.105±0.0030.802±0.006

2.5 理化性質(zhì)考察

2.5.1 AP-NE類型的鑒別（染色法） 利用油溶性染料蘇丹Ⅲ（紅色）和水溶性染料亞甲基藍（藍色）在納米乳中擴散的快慢來判斷納米乳的類型[26-27]。取等量的AP-NE于2支試管中，分別加入適量且等量的亞甲基藍和蘇丹III，結(jié)果顯示，亞甲基藍在AP-NE中的擴散速度快于蘇丹III，表明AP-NE為O/W型納米乳。

2.5.2 AP-NE的微觀形貌 取適量納米乳，用蒸餾水稀釋至適當濃度，滴于覆有支撐膜的銅網(wǎng)上。靜置10 min后，用濾紙吸去多余的液體，然后加入3%磷鎢酸溶液（pH 7.0）負染90 s，再用濾紙吸去多余的液體。自然蒸發(fā)后，用TEM分別在100 nm和200 nm的尺寸下觀察AP-NE的微觀形貌，結(jié)果見圖2，AP-NE呈圓球形，大小均勻，乳滴之間無粘連，成型性好。

2.5.3 溶解度的測定 采用HPLC法測得AP-NE中芹菜素的溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，與未加乳化劑的陰性對照納米乳的溶解度（34.81±0.25）μg/mL相比，增加了2.68倍；AP-NE平均載藥量為（5.77±0.08）%，包封率為（91.32±0.93）%（＝3）。

圖2 AP-NE的TEM圖

2.5.4 pH值的測定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，室溫下采用pH計測定其pH值，重復3次，求平均值，結(jié)果為7.37±0.07（＝3）。

2.5.5 電導率的測定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，室溫下采用電導率儀測定其電導率，重復3次，求平均值，結(jié)果為（88.60±1.14）μS/cm（＝3）。

2.5.6 ζ電位的測定 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，采用激光粒度測定儀測定其ζ電位，重復3次，求平均值，結(jié)果為（?35.81±0.38）mV（＝3）。

2.5.7 濁度的測定[28]按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，精密吸取適量的納米乳于50 mL量瓶中，用去離子水稀釋1000倍，采用紫外分光光度法在680 nm下測定其透光率，重復3次，求平均值，光程長為1 cm，根據(jù)公式計算得其濁度為（99.45±1.69）cm?1（＝3）。

＝/ln(0/)＝/ln(1/)

為濁度，為光程長，為稀釋倍數(shù)，0為光透過參比測試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強度，為光透過被測試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強度，為透光率

2.6 離心穩(wěn)定性考察

按最佳制備工藝制備2組新鮮的AP-NE，I組為加了乳化劑茶皂素的納米乳液，II組為不加乳化劑茶皂素的納米乳液。室溫下精密吸取8 mL于離心管中，在4000 r/min下離心60 min，觀察納米乳的外觀形態(tài)，以離心前、后吸光度（）值的變化表征其離心穩(wěn)定性，計算離心穩(wěn)定常數(shù)（）[29]。

2.6.1 外觀 離心結(jié)果顯示AP-NE仍為乳白色均一狀態(tài)，未發(fā)生聚集、凝結(jié)、相分離和破乳現(xiàn)象，表明AP-NE穩(wěn)定性良好。

2.6.2值的計算 按最優(yōu)處方制備新鮮的AP- NE，于離心前測定乳液的值記為0，離心后測定上清液的值記為1，平行測定3次。根據(jù)公式＝1/0計算值，值越大，表明離心穩(wěn)定性越好。離心穩(wěn)定性結(jié)果如表4所示，I組離心穩(wěn)定性遠遠優(yōu)于II組，表明AP-NE在上述離心條件下含量、性質(zhì)保持穩(wěn)定，離心穩(wěn)定性良好，且乳化劑茶皂素可以提高納米乳的穩(wěn)定性。

表4 離心穩(wěn)定性結(jié)果(, n = 3)

Table 4 Results of centrifugal stability (, n = 3)

組別A0A1K/% I0.479±0.0010.465±0.00197.08 II0.352±0.0010.256±0.00072.73

2.7 溫度和光照穩(wěn)定性考察

分別制備2組AP-NE，I組為以最佳工藝制備的AP-NE，II組為不加乳化劑茶皂素制備的AP-NE，分別于4、25、60 ℃，（4500±500）lx的藥品穩(wěn)定性試驗箱中放置20 d以上，分別在第0、5、10、15、20天進行取樣考察，分析在不同溫度和光照條件下乳劑粒徑、PDI、濁度、含量變化率、乳液分層指數(shù)等參數(shù)變化。

表5顯示了從納米乳液分層指數(shù)變化角度的穩(wěn)定性結(jié)果?？梢悦黠@看出，I組和II組納米乳在60 ℃保存20 d后分層指數(shù)明顯增加，分別達到2.86%、14.26%，且2組納米乳在儲存20 d后分層指數(shù)變化趨勢均為60 ℃＞25 ℃＞強光＞4 ℃。另外，I組納米乳在強光照射條件下穩(wěn)定性較好。

表5 不同溫度和強光對AP-NE的分層指數(shù)的影響(, n = 3)

Table 5 Effects of different temperature and bright light on stratified index of AP-NE (, n = 3)

t/dI組分層指數(shù)/%II組分層指數(shù)/% 4 ℃25 ℃60 ℃強光4 ℃25 ℃60 ℃強光 000000000 5000.220.160.751.472.141.91 100.811.321.710.741.181.853.973.87 150.911.762.111.304.866.8611.438.21 201.691.942.861.798.5212.0514.2610.95

表6、7分別展示了不同環(huán)境分別對2組納米乳液粒徑、濁度和含量變化率的影響。溫度穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，在粒徑方面上，除60 ℃外，I組納米乳液在不同環(huán)境脅迫下在260 nm左右穩(wěn)定20 d。這可能與ζ電位相對較高且恒定的絕對值密切相關(guān)，從而導致強烈的靜電排斥以維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性；而II組粒徑呈現(xiàn)不同程度的增長趨勢，其中60 ℃組增長最為明顯，在20 d后粒徑增長率達到26.67%，這是因為納米乳液為熱力學不穩(wěn)定體系，隨著溫度的升高，分子運動速率逐漸加快，增大了粒子間相互碰撞的幾率，從而使粒徑加大，而茶皂素可以有效緩解高溫所致的聚集現(xiàn)象的發(fā)生。

表6 不同溫度和強光對I組(含茶皂素)AP-NE穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

Table 6 Effects of different temperature and bright light on stability of AP-NE (I) (, n = 3)

t/d粒徑/nm濁度/cm?1含量變化率/% 4 ℃25 ℃60 ℃強光4 ℃25 ℃60 ℃強光4 ℃25 ℃60 ℃強光 0259.0259.7259.2259.499.82100.93103.2199.820000 5260.7259.8263.9263.691.02124.43118.7896.515.972.5117.552.18 10261.3261.1265.5261.788.83116.53103.14115.418.815.4523.2610.22 15261.7261.4268.8269.697.61114.29107.59125.0312.6715.5939.3312.29 20262.9264.2277.5267.493.21123.30140.41123.3017.2618.5940.8310.28

表7 不同溫度和強光對II組(不含茶皂素)AP-NE穩(wěn)定性的影響(, n = 3)

Table 7 Effects of different temperature and bright light on stability of AP-NE (II) (, n = 3)

t/d粒徑/nm濁度/cm?1含量變化率/% 4 ℃25 ℃60 ℃強光4 ℃25 ℃60 ℃強光4 ℃25 ℃60 ℃強光 0414.7416.0422.2419.6270.50271.81271.81270.500000 5416.2418.3432.6420.7301.11310.61316.08313.346.978.2221.947.62 10420.6420.5456.7435.3343.90350.98350.98348.1434.7338.0151.2742.36 15421.2425.4480.0440.9279.71265.27251.03262.6652.4760.2869.1956.35 20456.9461.2534.8471.2218.16221.89194.80219.4067.3065.5973.0762.54

濁度方面，由表6可以看出，I組納米乳在4 ℃和25 ℃條件下，納米乳液的濁度沒有隨著儲存時間的延長而發(fā)生顯著變化，而60 ℃組納米乳液的濁度呈逐漸增加的趨勢，特別是存放20 d后，濁度增長速度達到34.55%。這可能是由于在高溫條件下較長的儲存時間會導致乳化劑親水端的脫水和較低的界面張力，導致顆粒聚集增加，乳液體系渾濁，最終導致渾濁度增加。

此外，表面活性劑脫水降低了油滴之間的空間排斥，從而使油滴更靠近并聚結(jié)[30]；而II組納米乳各條件下濁度均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是因為納米乳在儲存初期由于不存在乳化劑，粒子間相互碰撞聚集，導致乳液體系變渾濁，濁度增大，繼續(xù)放置儲存，乳液因分層沉降從而使透明度增大，濁度降低。此外，含量變化率越低，穩(wěn)定性越好。2組納米乳在60 ℃下儲存20 d后芹菜素含量的變化率均遠高于4 ℃和25 ℃條件下的變化率，且II組納米乳在各條件下儲存15 d后含量變化率均達到50%以上。綜上所述，溫度穩(wěn)定性測試表明，I組納米乳在各項條件下的各項指標均優(yōu)于II組，表明茶皂素可以在一定程度上起到穩(wěn)定納米乳液的作用，且納米乳液最好在25 ℃以下保存。另外，茶皂素乳化的納米乳液在強光條件下，考察期間各項指標均無明顯變化，說明該納米乳液體系在該條件下較為穩(wěn)定。

2.8 短期儲存穩(wěn)定性考察

按優(yōu)化后的處方平行制備3批新鮮的AP-NE，乳劑室溫保存40 d，分別在第0、5、10、15、20、25、30、35、40天進行取樣考察，以粒徑、PDI、濁度、ζ電位和乳液分層指數(shù)等指標評價其短期穩(wěn)定性。40 d短期穩(wěn)定性測試結(jié)果如表8所示。結(jié)果表明，40 d內(nèi)茶皂素乳化的AP-NE具有良好的穩(wěn)定性，在40 d的儲存期內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的分層、絮凝、聚集等不穩(wěn)定現(xiàn)象。粒徑和濁度分別保持在260 nm和105 cm?1左右，而PDI始終在0.09～0.15波動。

此外，ζ電位大致表征了乳液顆粒的表面電荷。高絕對值會導致粒子之間的排斥力，這可能會提高多相系統(tǒng)的物理穩(wěn)定性[31]。ζ電位的絕對值較高，維持在33 mV左右，這可能是納米乳液體系穩(wěn)定的重要原因。

表8 AP-NE在40d內(nèi)的粒徑、PDI、ζ電位和濁度的變化(, n = 3)

Table 8 Changes in particle size, PDI, ζ potential and turbidity of AP-NE within 40 d (, n = 3)

t/d粒徑PDIζ電位/mV濁度/cm?1 0259.80.105?35.97106.51 5255.00.122?32.22102.05 10260.20.095?32.95108.78 15261.90.101?34.50103.53 20266.80.145?32.19108.97 25260.40.128?27.08108.97 30258.60.142?29.41105.56 35266.00.106?32.50109.91 40263.00.143?32.55109.26

2.9 體外釋放度考察

精密吸取AP-NE 5 mL，置于預先處理好的透析袋中，透析袋兩端用夾子固定，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）和1%聚山梨酯-80用作釋放介質(zhì)，然后放入裝有50 mL釋放介質(zhì)的燒杯中，透析袋完全沒入液面以下，同時以芹菜素對照品溶液作為對照。在37 ℃的環(huán)境溫度下，將其在恒溫搖床中以100 r/min的恒定速度攪拌3 d。分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24、36、48、60、72 h末從燒杯中取出2 mL透析液，并補充等溫等量的新鮮透析介質(zhì)保持水槽狀態(tài)，樣品經(jīng)微孔濾膜濾過后，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定芹菜素的質(zhì)量濃度，根據(jù)下式計算芹菜素的累積釋放率并繪制累積釋放曲線，結(jié)果見圖3。

使用動力學模型分析納米乳中藥物的釋放數(shù)據(jù)，動力學分析結(jié)果見表9。

圖3 對照品溶液和AP-NE中AP在含有1%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中的累積釋放率(, n = 3)

表9 AP-NE釋放研究中芹菜素的動力學模型

Table 9 Kinetic model of apigenin in AP-NE release studies

擬合模型方程R2 零級動力學Q＝0.760 t＋15.4050.807 一級動力學lnQ＝54.616－0.093 t0.933 HiguchiQ＝7.273 t1/2＋4.0620.940 Ritger-PeppaslnQ＝0.402 lnt＋11.3500.955

Q＝(0C＋C)/

Q為藥物不同時刻的累積釋放率，為不同時刻，0為釋放介質(zhì)的總體積，C為不同時刻測得的藥物質(zhì)量濃度，為每次取樣體積，為投入藥物總質(zhì)量

從圖3中可以清楚地看出，與AP-NE相比，對照品溶液中芹菜素的釋放速度要快得多。在前12 h內(nèi)，（73.94±1.58）%的芹菜素從游離溶液中釋放出來，而（41.25±0.46）%的芹菜素從AP-NE中釋放出來。該成分從納米乳中緩慢釋放可能是由于茶皂素穩(wěn)定的AP-NE的強包封作用，它為模擬胃腸道條件下的藥物提供了保護屏障。

從表9中可觀察到，與零級釋放模型（2＝0.807）相比，一級動力學模型具有更好的擬合（2＝0.933），這表明納米乳液的藥物釋放過程取決于濃度。Higuchi和Ritger-Peppas模型很好地擬合了實驗數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)在0.940～0.955，表明藥物從納米乳液中的釋放涉及多種機制，例如指數(shù)（）小于0.5的菲克釋放機制[32]。從該釋放研究中發(fā)現(xiàn)，茶皂素穩(wěn)定的AP-NE中的芹菜素遵循緩釋模式，可以在更長的時間內(nèi)發(fā)揮治療作用。

3 討論

根據(jù)能量獲得方式的不同將制備納米乳的方法分為高能乳化法和低能乳化法[33]，本實驗著眼于采用高能乳化法，即高速剪切結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)，以天然表面活性劑茶皂素為乳化劑制備AP-NE，以期改善芹菜素的溶解度，克服其口服利用度低和給藥不穩(wěn)定的問題，并探究茶皂素作為天然乳化劑形成和穩(wěn)定芹菜素納米乳的潛力。研究表明AP-NE中芹菜素的溶解度為（128.12±1.35）μg/mL，與芹菜素在水中的溶解度2.16 μg/mL相比，增加了58.31倍；與未加乳化劑的陰性對照納米乳的溶解度（34.81±0.25）μg/mL相比，增加了2.68倍。此外，體外釋放試驗表明AP-NE可有助于改善芹菜素的口服生物利用度。

溫度和光照穩(wěn)定性試驗中，在強光條件以及不同的溫度條件下，隨著儲存時間的延長，I組的各項指標都在不同程度上優(yōu)于II組，表明茶皂素可以在一定程度上起到穩(wěn)定納米乳液的作用。I組中，光照穩(wěn)定性試驗表明，在強光照射（4500±500）lx條件下AP-NE含量和性質(zhì)保持穩(wěn)定；溫度穩(wěn)定性試驗表明，高溫60 ℃導致乳液分層指數(shù)、濁度和含量變化率發(fā)生明顯的增長，而溫度低于25 ℃組指標均無明顯的變化，說明納米乳液最好在25 ℃以下保存。另外，茶皂素穩(wěn)定的納米乳液在40 d內(nèi)的儲存穩(wěn)定性良好。

總體而言，本研究揭示了茶皂素作為天然乳化劑形成納米乳來包封水不溶性藥物芹菜素的可能性，但茶皂素的安全性和生物相容性，以及制劑的安全性和體內(nèi)藥效學評價仍需進一步開展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andrelease of tea saponin-stabilized apigenin nanoemulsion

ZHANG Xu-min, XIE Long, ZHAO Yu-xin, LI Zhi-bei, LI Xiao-fang

Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Key Laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province, Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To prepare apigenin nanoemulsion (AP-NE) with tea saponin as natural emulsifier, and investigate its stability and release characteristics, in order to obtain a new green nano-formulation.AP-NE was prepared by high-speed shearing combined with high-pressure homogenization technology. The average particle size and polydispersity index (PDI) were used as independent variables, and the data were processed by the overall desirability value (OD) method. The formulation was optimized and verified by Box-Behnken effect surface method, and the physicochemical properties andrelease characteristics of AP-NE prepared with the optimal formulation were investigated.The optimal prescription of AP-NE was as follows: apigenin at a concentration of 0.40%, tea saponin at a concentration of 2.0 mg/mL, oil phase (castor oil: caprylic capric triglyceride＝1:3) in an amount of 3 mL; The measured average particle size of AP-NE was (259.5 ± 3.6) nm, PDI was 0.103 ± 0.005, ζ potential was (?35.81 ± 0.42) mV, conductivity was (88.60 ± 1.00) μS/cm, and pH was 7.37 ± 0.08, solubility was (128.12 ± 1.35) μg/mL, drug loading was (5.77 ± 0.08)%, turbidity was (99.45 ± 1.69) cm?1(= 3); it was identified as O/W emulsion by staining method, TEM observed that the milk droplets were non-adherent, uniform in size and spherical; stability test showed that AP-NE had good stability;release study showed that the release of apigenin from AP-NE had a slow and continuous trend.Nanoemulsion prepared with tea saponin as emulsifier can greatly improve the solubility and stability of apigenin, and it is a potential new nano-formulation that can improve drug effectiveness.

apigenin; nanoemulsion; tea saponin; high-speed shear-high pressure homogenization technology; Box-Behnken effect surface method; physicochemical properties; stability;release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)17 - 5348 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.011

2022-03-15

四川省科技廳科研項目（CN）（2020095）；四川省科技廳科研項目（2019YFS0113）

張旭敏（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術(shù)。Tel: 18328757648 E-mail: zhangxumin97@stu.cdutcm.edu.cn

李小芳（1964—），女，博士生導師，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術(shù)。Tel: 13808195110 E-mail: lixiaofang@cdutcm.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]