程 瑜 胡 建 劉 強(qiáng) 楊晉煒 王 鉅 辛東帥 郝 寧

(1.江蘇省有色金屬華東地質(zhì)勘查局地球化學(xué)勘查與海洋地質(zhì)調(diào)查研究院,江蘇 南京 210007;2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210000)

在我國(guó)部分有色金屬礦區(qū),因早期無(wú)序開發(fā)導(dǎo)致礦區(qū)土壤及周邊耕地受到不同程度的重金屬污染,從而嚴(yán)重影響礦區(qū)的生態(tài)安全。研究表明,重金屬離子可通過(guò)多種途徑進(jìn)入土壤,并通過(guò)作物的食物鏈循環(huán)進(jìn)入人體,進(jìn)而危害人體健康[1]。目前,修復(fù)重金屬污染土壤的方法主要有物理化學(xué)法和生物法:物理化學(xué)法可有效去除土壤中的重金屬,但存在成本高、易破壞土壤結(jié)構(gòu)及造成二次污染等問(wèn)題;生物法因土壤微生物綠色無(wú)害且能夠有效地固化重金屬?gòu)亩蔀橐环N有著廣闊應(yīng)用前景的土壤修復(fù)方法[2-3]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外開展了大量關(guān)于微生物固化及礦化修復(fù)土壤的機(jī)理研究。李馳等[4]研究發(fā)現(xiàn),利用微生物礦化技術(shù)可使分散性土壤變得密實(shí)緊結(jié)從而解決土壤過(guò)于分散難以種植等問(wèn)題;滕應(yīng)等[5]總結(jié)發(fā)現(xiàn)硫還原菌可通過(guò)自身呼吸作用將硫酸鹽還原成硫化物,還可以在同化作用過(guò)程中利用硫酸鹽合成氨基酸,如胱氨酸和蛋氨酸,再通過(guò)脫硫作用使S2-分泌于體外,并與重金屬形成硫化物沉淀從而達(dá)到礦化重金屬的目的;FUJITA、劉睿等[6-8]基于生物礦化原理,利用細(xì)菌分解尿素等底物產(chǎn)生CO32-,使重金屬離子礦化從而達(dá)到修復(fù)污染土壤的目的。

本研究利用從福建某鉛鋅礦區(qū)周邊土壤中篩選出的優(yōu)勢(shì)礦化菌種—糞產(chǎn)堿桿菌[9-11],針對(duì)配制的不同濃度的Pb2+、Cd2+和Zn2+溶液,在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行尿素濃度、礦化時(shí)間、溶液pH值對(duì)重金屬離子礦化效果影響的研究,從而確定最優(yōu)的礦化條件和最佳微生物,并將該微生物用于實(shí)際土壤進(jìn)行礦化效果驗(yàn)證,為后期礦區(qū)土壤治理提供依據(jù)。

1 菌種采集與分析

試驗(yàn)所用礦化菌種來(lái)自礦區(qū)內(nèi)有機(jī)質(zhì)含量高的農(nóng)田、菜地等位置的土壤中,通過(guò)細(xì)菌富集與分離、純化、鑒定、BLAST比對(duì)分析后得到8種可能的礦化菌種,分別與糞產(chǎn)堿桿菌1、糞產(chǎn)堿桿菌2、奇異變形桿菌1、奇異變形桿菌2、普通變形桿菌1、普通變形桿菌2、溶藻弧菌1、溶藻弧菌2的同源性分別達(dá)到98.7%、97.5%、96.8%、98.9%、97.8%、99.2%、97.8%、98.2%。 8種菌分別用編號(hào) BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 表示,其形態(tài)見圖1所示,培養(yǎng)基配方如表1。

圖1 8種礦化細(xì)菌形態(tài)圖Fig.1 Morphology of eight mineralized bacteria

表1 微生物培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of microbial medium

2 試驗(yàn)原理及試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)原理

碳酸鹽礦化細(xì)菌在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生特定脲酶(脲酶,系統(tǒng)命名為酰胺水解酶,是人類首次獲得晶體并發(fā)現(xiàn)含有鎳離子的金屬酶),脲酶可以催化產(chǎn)生CO32-來(lái)固結(jié)土壤中 Pb2+、Cd2+、Zn2+等重金屬離子,使其由離子可遷移態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的碳酸鹽礦化態(tài),從而達(dá)到礦化的目的。重金屬離子礦化過(guò)程可用如下方程式近似表示:

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 微生物菌種培養(yǎng)、脲酶活度測(cè)定

將從礦區(qū)分離得到的 BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2菌株在特定條件下培養(yǎng)后,取少量菌液用分光光度計(jì)測(cè)定其光密度值(optical density,簡(jiǎn)寫為OD),以確定培養(yǎng)的菌液濃度。將培養(yǎng)的菌液離心后棄上清液,按提取比例加入提取液,超聲破碎細(xì)胞4℃條件下離心棄上清液,置冰上待測(cè)。將菌液加入試劑盒中行酶促反應(yīng)并測(cè)量其吸光度值A(chǔ)用以測(cè)量氨量,并使用標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程y=0.091 5x+0.037 3,測(cè)定菌液濃度計(jì)算細(xì)菌酶活性,其中x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值A(chǔ),最后以UE表示酶活力,單位的定義為每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N,定義為一個(gè)酶活力單位。

2.2.2 細(xì)菌礦化影響因素試驗(yàn)

通過(guò)細(xì)菌脲酶活度檢測(cè),選定兩種活度最高的細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)研究。首先在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行單一重金屬離子礦化試驗(yàn),將不同類型重金屬離子溶液分別在不同尿素濃度、重金屬離子濃度、重金屬離子的加入時(shí)間、礦化反應(yīng)時(shí)間時(shí)進(jìn)行礦化反應(yīng),從而確定2種細(xì)菌在進(jìn)行礦化反應(yīng)時(shí)最佳的條件,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行混合重金屬離子試驗(yàn),以此篩選出該礦區(qū)最優(yōu)的礦化菌種。

2.2.3 原土與田間試驗(yàn)

利用確定的最優(yōu)礦化菌種進(jìn)行原土試驗(yàn),通過(guò)考察重金屬離子礦化效果找出原土試驗(yàn)與溶液試驗(yàn)之間的差距,并為最終在田間進(jìn)行試驗(yàn)提供依據(jù)。

3 試驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 礦化微生物菌種選定

選用0.5%的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖乳糖肉湯(LB)培養(yǎng)基,在自然 pH 值條件下,將得到的 BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 菌株按照每 100 mL培養(yǎng)基接種純菌株1環(huán),在37℃恒溫培養(yǎng)箱中以170 r/min培養(yǎng)24 h,待培養(yǎng)基渾濁取出菌液。取3 mL細(xì)菌液于1 cm內(nèi)徑比色皿,利用細(xì)菌液中細(xì)胞濃度與其渾濁度成正比,與透光度成反比,用分光光度計(jì)測(cè)定其OD值表示相應(yīng)菌液濃度。標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基配方組成為:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%。

礦化細(xì)菌脲酶活度測(cè)定方法為將培養(yǎng)后細(xì)菌收集,離心后棄上清液,按提取比例加入提取液,超聲破碎細(xì)胞(冰浴,功率200 W,超聲3 s,間隔10 s,重復(fù)30次)4℃條件下離心棄上清液,置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟如下:①分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至578 nm,用蒸餾水將設(shè)備調(diào)零。②酶促反應(yīng):按照試劑盒加入尿素。混勻,放入37℃水浴1 h后,10 000 r/min、25℃離心10 min,取上清液。③將上清液稀釋10倍(取0.1 mL上清液,加入0.9 mL蒸餾水)。④測(cè)氨量(在微量石英比色皿96孔板中加入試劑,充分混勻),室溫放置20 min。 混勻,于578 nm處,蒸餾水調(diào)零,讀吸光值A(chǔ),計(jì)算A-A,測(cè)定管-A對(duì)照管,每個(gè)測(cè)定管設(shè)置一個(gè)對(duì)照管。⑤活力計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.091 5x+0.037 3;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值A(chǔ)。

應(yīng)用上述方法對(duì)選取的8種細(xì)菌的脲酶活性進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定的脲酶活性數(shù)據(jù)見表2。

表2 脲酶活性比較Table 2 Comparison of urease activity

由表2可知,BF1(糞產(chǎn)堿桿菌1)和BF2(糞產(chǎn)堿桿菌2)的脲酶活性較高,故將采用BF1和BF2作為礦化菌種進(jìn)行試驗(yàn)。

3.2 不同尿素濃度對(duì)礦化效果的影響

取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的BF1和BF2的菌液各5支,每支1 mL,分別添加1 mL不同濃度的尿素溶液(20、60、100、140、180 g/L),充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加1 mL配制好的重金屬離子溶液(Pb2+濃度1 g/L、Cd2+濃度 0.01 g/L、Zn2+濃度1 g/L)充分混勻,放置24 h后,經(jīng)離心測(cè)定上清液中離子的含量,3種重金屬離子的礦化率變化趨勢(shì)如圖2和圖3所示。

圖2 不同尿素濃度摻量下重金屬離子礦化率(BF1)Fig.2 Mineralization rates of heavy metal ions with different concentrations of urea(BF1)

圖3 不同尿素濃度摻量下重金屬離子礦化率(BF2)Fig.3 Mineralization rates of heavy metal ions with different concentrations of urea(BF2)

由圖2、圖3可知,當(dāng)尿素濃度為100 g/L時(shí),BF1和BF2對(duì)重金屬離子具有最佳的礦化效果。當(dāng)尿素濃度較低時(shí),菌株催化底物尿素產(chǎn)生的CO32-量不足,濃度過(guò)高時(shí),尿素溶液pH值較高,抑制脲酶的活性,從而影響重金屬離子的礦化。因此,選擇尿素濃度為100 g/L。

3.3 不同重金屬離子濃度對(duì)礦化效果的影響

因重金屬離子濃度過(guò)高會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生毒害作用,故開展了不同重金屬離子濃度的礦化試驗(yàn)。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的 BF1、BF2各 15支,每支1 mL,分別添加100 g/L的尿素溶液1 mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,分別加入1 mL配置好的不同濃度的 Pb2+、Cd2+、Zn2+溶液,充分混勻放置24 h后,離心測(cè)上清液中重金屬離子的含量并計(jì)算礦化率,結(jié)果見圖4。

圖4 不同重金屬離子不同濃度下的礦化率Fig.4 Mineralization rates of different heavy metal ions at different concentrations

由圖4可知,當(dāng)Pb2+濃度在0.01～1 g/L之間時(shí),2種菌種礦化率隨Pb2+濃度增加均呈現(xiàn)波動(dòng)提高趨勢(shì),在試驗(yàn)區(qū)間內(nèi)濃度最大時(shí)礦化率最高,其中添加BF1時(shí)礦化率最高達(dá)90.7%;當(dāng)Cd2+在0.001～0.01 g/L之間時(shí),BF1對(duì)Cd2+的礦化率在65%～69%之間,隨著離子濃度降低礦化率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),BF2對(duì)Cd2+的礦化率在60%～64%,礦化率隨離子濃度變化不明顯;當(dāng)Zn2+濃度在0.01～1 g/L之間時(shí),BF1對(duì)Zn2+的礦化率隨著濃度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),最高礦化率為81.1%,BF2對(duì)Zn2+的礦化率隨離子濃度增加而增大,最高為76.8%。綜合對(duì)比上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),BF1和BF2兩種微生物在相應(yīng)的重金屬離子濃度區(qū)間內(nèi)礦化率較為穩(wěn)定,說(shuō)明上述區(qū)間內(nèi)重金屬對(duì)菌株的毒性較小,總體而言BF1對(duì)Pb2+、Cd2+和Zn2+的礦化效果要好于BF2。

3.4 脲酶催化時(shí)間對(duì)礦化效果的影響

因菌株產(chǎn)脲酶至脲酶催化底物尿素需要反應(yīng)時(shí)間,為獲得脲酶催化底物尿素的最佳反應(yīng)時(shí)間,進(jìn)行了不同反應(yīng)時(shí)間的試驗(yàn)研究。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的BF1、BF2各5批,每批各3支,分別添加濃度為100 g/L尿素1 mL,充分振蕩混勻,在加入尿素1、2、3、4、5 h后,分別加入1mL配置好的重金屬離子溶液充分混勻,放置24 h后,離心測(cè)上清液中重金屬離子的含量并計(jì)算礦化率。脲酶催化尿素不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)重金屬離子的礦化率見圖5和圖6。

圖5 脲酶催化尿素不同反應(yīng)時(shí)間重金屬離子的礦化率(BF1)Fig.5 Mineralization rates of heavy metal ions in urea catalyzed by urease at different reaction times(BF1)

圖6 脲酶催化尿素不同反應(yīng)時(shí)間重金屬離子的礦化率(BF2)Fig.6 Mineralization rates of heavy metal ions in urea catalyzed by urease at different reaction times(BF2)

由圖5、圖6可知,BF1和BF2在添加尿素2 h后加入重金屬離子進(jìn)行反應(yīng)時(shí)礦化效果最好。加入時(shí)間過(guò)早,脲酶不能完全催化底物尿素分解為CO32-;加入時(shí)間過(guò)晚,酶易分解,進(jìn)而影響脲酶催化底物尿素分解產(chǎn)生碳酸根,因而重金屬離子的最佳添加時(shí)間為加入尿素后的2 h左右。

3.5 礦化反應(yīng)時(shí)間對(duì)礦化效果的影響

通過(guò)礦化反應(yīng)時(shí)間對(duì)重金屬礦化率的影響試驗(yàn),得到不同礦化時(shí)間下重金屬離子的礦化率,試驗(yàn)結(jié)果見圖7、圖8。 取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液各5批,每批各3只,分別添加濃度100 g/L的尿素1 mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加入1 mL配制好的重金屬離子溶液,充分混勻,放入37℃、170 r/min的搖床中,每隔12 h每種菌分別取3支,共取5次,離心分析上清液中重金屬離子的含量并計(jì)算礦化率。

圖7 不同礦化時(shí)間下重金屬離子的礦化率(BF1)Fig.7 Mineralization rates of heavy metal ions at different mineralization times(BF1)

圖8 不同礦化時(shí)間下重金屬離子的礦化率(BF2)Fig.8 Mineralization rates of heavy metal ions at different mineralization times(BF2)

由圖7、圖8可知,礦化時(shí)間越長(zhǎng),重金屬離子的礦化率越好,但是從48 h后,礦化率增長(zhǎng)緩慢并趨于平緩,故最佳的礦化時(shí)間應(yīng)控制在48 h左右。

3.6 混合重金屬離子礦化效果試驗(yàn)

在確定了各因素對(duì)重金屬離子礦化率的影響及最佳摻量后,模擬真實(shí)土壤在溶液環(huán)境下開展混合重金屬離子礦化試驗(yàn)。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液共8支,每支1mL,分別添加濃度100 g/L的尿素1mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加入1 mL配置好的混合重金屬離子溶液,充分混勻,放置24 h后,離心測(cè)上清液中重金屬離子的含量并計(jì)算礦化率,試驗(yàn)結(jié)果見圖9(其中,A組試驗(yàn)Pb2+濃度 0.01 g/L,Cd2+濃度 0.001 g/L,Zn2+濃度0.01 g/L;B組試驗(yàn)Pb2+濃度 1 g/L,Cd2+濃度 0.01 g/L,Zn2+濃度 1 g/L;C組試驗(yàn)Pb2+濃度0.04 g/L,Cd2+濃度 0.02 g/L,Zn2+濃度 0.02 g/L;D組試驗(yàn)Pb2+濃度 0.1 g/L,Cd2+濃度0.01 g/L,Zn2+濃度0.1 g/L)。

圖9 混合重金屬離子礦化率Fig.9 Mineralization rates of mixed heavy metal ions

由圖9可知,用BF1、BF2進(jìn)行混合重金屬離子礦化試驗(yàn)時(shí),在不同重金屬濃度配比條件下,Pb2+的礦化率大于80%,Cd2+的礦化率大于62%,Zn2+的礦化率均在77%以上。對(duì)比前述單因素條件試驗(yàn)可知,混合離子的礦化效果和單元素離子試驗(yàn)的礦化效果相當(dāng),由此說(shuō)明BF1、BF2對(duì)混合重金屬離子的礦化效果均較為理想。在混合體系中,BF1細(xì)菌的礦化效果均好于BF2菌。

3.7 菌種pH耐受性試驗(yàn)

對(duì)菌株的pH耐受性進(jìn)行試驗(yàn),取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液各5 mL,采用HCl、NaOH 調(diào)節(jié) pH 為 4、5、6、7、8、9 進(jìn)行細(xì)菌的活性試驗(yàn)。測(cè)得細(xì)菌的活性值見圖10。

圖10 不同pH條件下菌株的脲酶活性Fig.10 Urease activity of strains under different pH conditions

由圖10可知,BF1的脲酶活性耐受能力比BF2要強(qiáng),在pH=4.0時(shí)脲酶活性最低,pH=8.0時(shí)脲酶活性最高,pH=9.0時(shí)脲酶活性略有降低,BF1最佳的pH適用范圍是pH=6～8,由此也說(shuō)明在強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿條件下,細(xì)菌活性受到抑制,對(duì)于如何使細(xì)菌在該范圍內(nèi)保持活性,正是國(guó)際和國(guó)內(nèi)攻堅(jiān)克難的重點(diǎn)。

綜合上述試驗(yàn)可知,BF1菌無(wú)論是脲酶活性還是對(duì)重金屬離子的礦化率都好于BF2菌,后續(xù)將使用BF1菌開展重金屬污染土壤的修復(fù)試驗(yàn)。

3.8 實(shí)驗(yàn)室土壤修復(fù)試驗(yàn)

3.8.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)土壤樣品采自福建某鉛鋅礦區(qū),依據(jù)土壤污染狀況調(diào)查結(jié)果,挑選出污染程度不同的兩種土壤:重污染土壤(簡(jiǎn)稱S1)、中度污染土壤(簡(jiǎn)稱S2)。土壤樣品采取時(shí)遵循NYT 1121.1-2006《土壤檢測(cè)第1部分:土壤樣品的采集、處理和貯存》[12]去除雜物后封裝運(yùn)輸,其中S1樣品30 kg、S2 樣品 20 kg。

將取回的土壤樣品按四分法,縮分至2 kg左右自然風(fēng)干,研磨,過(guò)0.2 mm篩,分別保存用于分析和試驗(yàn),兩種土壤重金屬Pb、Cd、Zn總量和各形態(tài)分析結(jié)果見表3、表4,土壤形態(tài)分析采用Tesier順序提取法。

表3 S1土壤總量及各形態(tài)含量Table 3 Total and morphological contents of S1 soil mg/kg

表4 S2土壤總量及各形態(tài)含量Table 4 Total and morphological contents of S2 soil mg/kg

由表3可知,S1土壤中Pb、Cd、Zn總量高,其中Cd主要以離子態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)形式存在,而Pb、Zn大部分以鐵錳結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)形式存在,以離子態(tài)存在的含量?jī)H占總量的0.69%和0.38%。表4顯示S2土壤中Pb、Cd、Zn總量高,但離子態(tài)含量與土壤S1類似,Pb、Zn離子態(tài)含量很低,Cd離子態(tài)含量較高。依據(jù)福建省地方標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級(jí)》[13]中的農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬有效態(tài)(離子態(tài))限制值標(biāo)準(zhǔn)(Pb2+含量＜35 mg/kg、Cd2+含量＜0.3 mg/kg、Zn2+含量＜60 mg/kg)可判斷,2種土壤3種重金屬中僅有Cd2+超過(guò)限制值,會(huì)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品造成危害。

3.8.2 結(jié)果分析

使用培養(yǎng)后的BF1菌液對(duì)試驗(yàn)土壤進(jìn)行礦化試驗(yàn)研究。取S1、S2各20 g于小碗中(碗底平鋪四層紗布),將1.2 mL、37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1菌液和3 mL濃度100 g/L的尿素溶液混合2 h后,加入上述土壤充分混勻,靜置48 h后,應(yīng)用Tesier順序提取法分析重金屬離子的含量并與原土對(duì)比,反應(yīng)后結(jié)果見圖11,結(jié)果見表5、表6。

圖11 不同土壤礦化效果Fig.11 Different soil mineralization effects

表5 S1土壤樣重金屬離子礦化效果Table 5 Mineralization effect of heavy metal ions in S1 soil samples

表6 S2土壤樣重金屬離子礦化效果Table 6 Mineralization effect of heavy metal ions in S1 soil sample

由表5、表6數(shù)據(jù)可知,在與離子溶液條件基本相同的情況下,BF1菌對(duì)S1、S2兩種土壤中 Pb2+、Zn2+礦化率均到達(dá)83%以上,Cd2+的礦化率在60%左右,且礦化后土壤中所有重金屬離子濃度均達(dá)到《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級(jí)》(DB35/T 859-2016)指標(biāo)中的限制值標(biāo)準(zhǔn),可作為耕地繼續(xù)使用。同時(shí),與前述混合離子溶液試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比可知,BF1菌在真實(shí)土壤中的礦化效果略差于溶液中,其主要原因可能是土壤成分復(fù)雜,對(duì)菌株生長(zhǎng)、細(xì)菌脲酶活性均有一定影響,可考慮向礦化菌中添加甘油作為保護(hù)劑,以阻止部分導(dǎo)致酶失活的物質(zhì)接近活性中心,從而提高了酶的穩(wěn)定性。

3.9 田間試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證BF1菌在實(shí)際土壤環(huán)境中礦化重金屬離子的效果,在該鉛鋅礦區(qū)內(nèi)選擇一處因重金屬Cd污染而荒廢的農(nóng)田進(jìn)行田間試驗(yàn),田塊面積約800 m2,翻耕深度300 mm,將600 L OD=7的高濃度BF1菌液,在-4℃條件下運(yùn)至礦區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行試驗(yàn)。先加尿素底物稀釋10倍后,分多次均勻噴灑在田內(nèi),每次噴灑后翻動(dòng)并混合土壤,噴灑完成后覆蓋薄膜72 h同時(shí)保持土壤濕度80%以上,在不同時(shí)間段檢測(cè)微生物礦化后土壤中重金屬離子變化情況,結(jié)果見表7。

表7 田間試驗(yàn)重金屬Cd2+離子礦化效果Table 7 Field experiment on mineralization effect of heavy metal Cd2+ion

由表7可知,在自然條件下的田間試驗(yàn)中,未礦化前Cd2+超過(guò)《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級(jí)》(DB35/T 859-2016)中限制值標(biāo)準(zhǔn),屬于限制使用的農(nóng)用地,礦化修復(fù)后Cd2+小于限制值標(biāo)準(zhǔn),屬于可利用農(nóng)用地;同時(shí)土壤中Cd2+在微生物礦化處理后1年內(nèi)變化不明顯,說(shuō)明使用該微生物進(jìn)行礦化修復(fù)后可在一定時(shí)期內(nèi)使重金屬離子濃度保持穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

(1)試驗(yàn)菌取自福建某鉛鋅礦區(qū)內(nèi)有機(jī)質(zhì)含量高的農(nóng)田、菜地、小樹林等土壤中,篩選分離得到BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 共8 種可產(chǎn)生脲酶的礦化菌種,選取活性較高的BF1、BF2進(jìn)行試驗(yàn)。最終試驗(yàn)的土壤樣品S1、S2取自礦區(qū)特定區(qū)域。

(2)研究發(fā)現(xiàn)在重金屬離子濃度區(qū)間為Pb2+0.01～1 g/L,Cd2+0.001～0.01 g/L,Zn2+0.01～1 g/L時(shí),對(duì)BF1、BF2菌株生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響。

(3)在上述重金屬離子濃度區(qū)間內(nèi),細(xì)菌礦化重金屬離子的最佳試驗(yàn)條件為尿素濃度100 g/L、加尿素反應(yīng)2 h后加入重金屬離子溶液、礦化時(shí)間48 h以上且pH范圍6-8。通過(guò)混合重金屬離子礦化試驗(yàn),表明 BF1、BF2 對(duì) Pb2+、Cd2+、Zn2+的礦化率在 80%、62%、77%以上,且BF1 細(xì)菌對(duì)Pb2+、Cd2+、Zn2+的礦化效果均好于BF2菌。

(4)通過(guò)實(shí)際土壤修復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BF1菌對(duì)S1、S2兩種土壤中Pb2+、Zn2+的礦化率均到達(dá)83%以上,Cd2+的礦化率在60%左右。真實(shí)土壤中重金屬離子礦化效果與溶液中試驗(yàn)結(jié)果相比要差,其主要原因可能是土壤成分復(fù)雜,導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)和酶活性受到影響。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用BF1菌修復(fù)鎘污染農(nóng)田,一年后礦化效果依舊理想。

(5)試驗(yàn)所選取的BF1、BF2菌種,在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程作用下產(chǎn)生酶,通過(guò)酶的催化作用分解尿素產(chǎn)生碳酸根并與重金屬離子結(jié)合形成碳酸鹽沉淀。這種生物礦物修復(fù)重金屬污染土壤方法工藝簡(jiǎn)單,實(shí)用價(jià)值高,環(huán)境友好,具有大面積推廣使用的可能性。