姚晨虓，李小杰，劉暢，邱睿，白靜科，徐敏，陳玉國(guó)，康業(yè)斌，李淑君*

植物保護(hù)

3株拮抗煙草尖孢鐮刀菌的木霉菌篩選鑒定及促生防病效果評(píng)價(jià)

姚晨虓1,2，李小杰2，劉暢2，邱睿2，白靜科2，徐敏3，陳玉國(guó)2，康業(yè)斌1，李淑君2*

1 河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，洛陽(yáng) 471023；2 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000；3 中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州 450018

【目的】為篩選對(duì)煙草鐮刀菌根腐病菌具有較好拮抗效果的菌株?！痉椒ā繌暮幽鲜≈饕獰熑~產(chǎn)區(qū)健康煙株根際土壤中，分離純化對(duì)尖孢鐮刀菌（）具有一定拮抗作用的真菌菌株，對(duì)篩選出的拮抗菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并測(cè)定促生作用和防治效果?！窘Y(jié)果】分離純化得到的3株木霉菌分別為棘孢木霉（）Ta-0101、哈茨木霉（）Th-0201和毛簇木霉（）Tv-0207，具有較強(qiáng)的抑菌能力，對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為91.24%、84.71%和82.48%。3株木霉菌對(duì)煙草種子根長(zhǎng)和總長(zhǎng)均有顯著的促生效果，根長(zhǎng)增長(zhǎng)率分別為28.89%、25.92%和22.22%，根系活力也顯著提高；對(duì)煙株最大葉面積和鮮重的促生作用明顯，其中棘孢木霉Ta-0101促生效果最顯著。3株木霉菌對(duì)尖孢鐮刀菌的相對(duì)盆栽防效分別為78.95%、69.73%和69.73%，均高于70%甲基硫菌靈1000倍液處理的防效?！窘Y(jié)論】3株拮抗木霉菌具有較好的抑菌效能和促生防病效果，應(yīng)用前景良好。

煙草尖孢鐮刀菌；木霉菌；抑制效果；促生作用；防效

隨著區(qū)域性環(huán)境變化和耕作制度的變遷，威脅煙草安全生產(chǎn)的土傳病害日益嚴(yán)重[1-2]。尖孢鐮刀菌（）和茄病鐮刀菌（）等引起的煙草鐮刀菌根腐病是我國(guó)煙草最嚴(yán)重的根莖類病害之一[3]，河南省尖孢鐮刀菌發(fā)生危害較為嚴(yán)重，重病田塊發(fā)病率達(dá)30%以上，給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。病原鐮刀菌可在土壤和病殘?bào)w中存活多年，難以根除，防治難度極大[7]。

目前，煙草病害的主要防控技術(shù)仍依靠抗病品種和化學(xué)藥劑，但高抗品種少，化學(xué)藥劑效果不穩(wěn)定[8-10]。微生物菌劑以安全綠色、抗病抗逆、改善土壤微生態(tài)、提高品質(zhì)和產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)成為主要的防治手段[11-12]。小麥、玉米、香蕉等作物均已開(kāi)展了鐮刀菌病害的流行規(guī)律、致病菌種類、致病特點(diǎn)、寄主的互作等研究[13]。但關(guān)于煙草鐮刀菌根腐病生物防治的報(bào)道相對(duì)較少，尚未登記相關(guān)的專用生防制劑。

本研究篩選鑒定了對(duì)煙草鐮刀菌具有較好抑菌效果的拮抗菌株，評(píng)價(jià)其促生防病效果，為煙草鐮刀菌的綠色防控提供理論依據(jù)，為微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土樣

供試土樣于2020年采自河南省許昌市、平頂山市、洛陽(yáng)市、漯河市、三門峽市、南陽(yáng)市、駐馬店市煙區(qū)團(tuán)棵至旺長(zhǎng)期發(fā)病田中健康煙株的根際土壤，共26份。

1.1.2 供試菌株和煙草品種

供試煙草尖孢鐮刀菌（）、煙草茄病鐮刀菌（）、煙草疫霉菌（）、根串珠霉菌（）、鏈格孢菌（）、擬莖點(diǎn)霉（）、煙草炭疽菌（）、立枯絲核菌（）、葡萄座腔菌（）、灰葡萄孢菌（），以及煙草品種（中煙100）均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所菌源庫(kù)和種質(zhì)資源庫(kù)提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基用于菌株的培養(yǎng)和保存；PDB培養(yǎng)基同PDA培養(yǎng)基（不含瓊脂），用于菌株發(fā)酵液的制備。有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，MgSO40.3 g/L，MnSO40.03 g/L，K2SO40.3 g/L，F(xiàn)eSO40.03 g/L，Ca3(PO4)25.0 g/L，卵磷脂0.2 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0～7.5，用于解有機(jī)磷活性測(cè)定；無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基同有機(jī)磷培養(yǎng)基（不含卵磷脂），用于解無(wú)機(jī)磷活性測(cè)定。固氮培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCO35.0 g/L，CaSO40.1 g/L，甘露醇10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 6.9～7.1，用于固氮活性測(cè)定。嗜鐵素培養(yǎng)基：鉻天青S（CAS）60.5 mg/L，十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）72.9 mg/L，F(xiàn)eCl3?6H2O 2.645 mg/L，NaH2PO4?2H2O 295.25 mg/L，Na2HPO4?12H2O 1213.5 mg/L，NH4Cl 125.0 mg/L，KH2PO437.5 mg/L，NaCl 62.5 mg/L，瓊脂9.0 g/L，pH 6.7～6.9，用于產(chǎn)嗜鐵素活性測(cè)定。解鉀硅酸鹽培養(yǎng)基：蔗糖5.0 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO30.1 g/L，Na2HPO42.0 g/L，F(xiàn)eCl30.005 g/L，玻璃粉1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 6.9～7.1，用于解鉀硅酸鹽活性測(cè)定。蛋白酶培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基和淀粉水解培養(yǎng)基用于水解酶活性測(cè)定[14]。

1.1.4 其它材料

供試煙草育苗基質(zhì)為普通市售，購(gòu)自于許昌科宏工貿(mào)有限公司，滅菌后用于育苗和盆栽試驗(yàn)。70%甲基硫菌靈（Thiophanate-Methyl）可濕性粉劑（WP）購(gòu)自于山東省青島奧迪斯生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌株的分離篩選

采用稀釋涂布平板法在PDA培養(yǎng)基上分離拮抗真菌[15]，純化后保存于4℃冰箱。并以尖孢鐮刀菌為靶標(biāo)，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[16]進(jìn)行初篩，在距離平板中心2.5 cm的對(duì)稱位置上分別接種5 mm已純化的拮抗真菌和病原菌菌餅，以只接種病原菌菌餅為對(duì)照，重復(fù)3次，25℃恒溫倒置培養(yǎng)6～8 d，測(cè)量病原菌落半徑并計(jì)算抑菌率。拮抗菌的復(fù)篩及木霉菌拮抗系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

參照《真菌鑒定手冊(cè)》[18]，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢方式，子實(shí)體形態(tài)、大小、顏色等特征，初步確定菌株的分類地位。

參照文獻(xiàn)[17]提取基因組DNA（生工生物工程(上海)股份有限公司，試劑盒編號(hào)：SK8259），以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增真菌rDNA-ITS片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收（生工生物工程（上海）股份有限公司，試劑盒編號(hào)：SK8131）后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的rDNA-ITS基因序列作為參比對(duì)象，運(yùn)用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 拮抗木霉菌的抑菌譜測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定拮抗木霉菌對(duì)9種煙草病原菌的抑菌譜。其中立枯絲核菌和灰葡萄孢菌需培養(yǎng)3 d，煙草疫霉菌、擬莖點(diǎn)霉和葡萄座腔菌需培養(yǎng)4 d，煙草炭疽菌培養(yǎng)5 d，煙草茄病鐮刀菌培養(yǎng)8 d，鏈格孢菌培養(yǎng)11 d，根串珠霉菌培養(yǎng)14 d，并計(jì)算抑菌率。

1.2.4 拮抗木霉菌對(duì)種子促生及根系活力的測(cè)定

采用培養(yǎng)皿濾紙保濕法[17]測(cè)定對(duì)煙草種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響，方法略有改動(dòng)，種子經(jīng)孢子懸浮液（1×107孢子/mL）浸種16 h后，整齊擺放在鋪有滅菌沙子和濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌水浸種為空白對(duì)照，每皿25粒（5×5），重復(fù)3次，第14 d統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率、煙苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和總長(zhǎng)（以種子生長(zhǎng)節(jié)點(diǎn)區(qū)分根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)，總長(zhǎng)為根長(zhǎng)與莖長(zhǎng)之和），并計(jì)算相較于空白對(duì)照組的增長(zhǎng)率。

滅菌基質(zhì)與拮抗菌發(fā)酵液（5×107孢子/mL）按質(zhì)量體積比10:1均勻混合，采用漂浮育苗法播種育苗（7×10孔），以等體積PDB培養(yǎng)基混拌基質(zhì)為空白對(duì)照，重復(fù)3次，期間溫度與水肥管理一致，第43 d采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[19]測(cè)定根系活力。

1.2.5 拮抗木霉菌對(duì)煙草促生作用測(cè)定

采用溫室盆栽法，參照文獻(xiàn)[20]，溫度（26±0.5）℃、相對(duì)濕度50%～60%、光暗周期12L/12D，選擇40 d苗齡長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行移栽，緩苗后每株灌根20 mL拮抗菌發(fā)酵液（5×107孢子/mL），每處理10株，重復(fù)3次，共灌根2次，間隔10 d，以等體積PDB培養(yǎng)基灌根為空白對(duì)照，期間溫度與水肥管理一致，30 d后根據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法（YC/T142—2010）測(cè)量煙株農(nóng)藝性狀，并計(jì)算最大葉的葉面積。

葉面積（cm2）=0.6345×葉長(zhǎng)（cm）×葉寬（cm）

1.2.6 拮抗木霉菌的促生能力及水解酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法定性檢測(cè)菌株的促生能力和部分水解酶活性，包括產(chǎn)IAA能力[21]、解磷能力[14]、固氮能力[14]、解鉀能力[22]、產(chǎn)NH3能力[22]、產(chǎn)嗜鐵素活性[14]、產(chǎn)蛋白酶活性[14]、產(chǎn)纖維素酶活性[14]、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性[14]、產(chǎn)淀粉酶活性[23]。

秸稈制取生物柴油由于其成本和技術(shù)的因素，不能完全取代石油燃料，因此對(duì)于該技術(shù)的反應(yīng)機(jī)理、反應(yīng)設(shè)備及生物油的應(yīng)用技術(shù)應(yīng)當(dāng)投入更大的精力進(jìn)行深入研究[51-52]。在制取過(guò)程中，秸稈前期改性水解是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，如何提高其轉(zhuǎn)化率以及降低成本是主要的考慮因素，必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理和水解過(guò)程破壞木質(zhì)素的纏繞作用與纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使其在溶劑、催化劑或酶的作用下進(jìn)行水解。通過(guò)大量的研究工作，目前采用新型工藝超(亞)臨界預(yù)處理與水解技術(shù)，將會(huì)為利用秸稈轉(zhuǎn)化制取乙醇技術(shù)提供重要的理論依據(jù)和應(yīng)用前景[53]。

1.2.7 拮抗木霉菌的防效測(cè)定

采用盆栽試驗(yàn)法，參照文獻(xiàn)[24-25]，選擇60 d苗齡長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行移栽，緩苗后每株灌根20 mL拮抗菌發(fā)酵液（5×107孢子/mL），3 d后每盆接種20 g煙草尖孢鐮刀菌麥粒培養(yǎng)物（打取新鮮的菌絲塊，接種于高溫滅菌過(guò)的麥粒培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d，制成帶菌麥粒培養(yǎng)物），施足水后，（28±0.5）℃保濕培養(yǎng)、光暗周期12L/12D，10 d后再次灌根，每處理10株，重復(fù)3次，以不接病菌為陰性對(duì)照（CK1），以只接種病菌為陽(yáng)性對(duì)照（CK2），以陽(yáng)性對(duì)照組盆栽均出現(xiàn)典型的矮小萎蔫、根部壞死癥狀為標(biāo)準(zhǔn)，在接種病原20 d時(shí)以株為單位，按照煙草國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法（GB/T23222—2008）調(diào)查病害發(fā)生情況，并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；采用DPS 7.05軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 拮抗真菌的分離篩選

26份土樣中，共分離純化真菌371株，其中有明顯抑菌效果的拮抗菌株38株，抑菌率均在70%以上，菌株P(guān)DSLS0101（分離自平頂山市魯山縣煙田）、NYZP0201（分離自南陽(yáng)市鎮(zhèn)平縣煙田）和LYRY0207（分離自洛陽(yáng)市汝陽(yáng)縣煙田）的抑菌效果最好，抑菌率分別為91.24%、84.71%和82.48%（表1）。復(fù)篩結(jié)果表明，增加拮抗菌的接種量可以明顯提高菌株P(guān)DSLS0101和NYZP0201的抑菌效果，說(shuō)明增加使用量可以更好地發(fā)揮空間競(jìng)爭(zhēng)作用；菌株P(guān)DSLS0101能夠覆蓋上病原菌的菌落，說(shuō)明其能夠重寄生該病原菌（圖1）。

表1 拮抗菌株對(duì)煙草尖孢鐮刀菌的平板抑制效果

Tab.1 Plate inhibitory effect of antagonistic strains on F. oxysporum in tobacco

注：A1、A2為病原菌正反面； B1、C1和D1為菌株P(guān)DSLS0101、NYZP0201和LYRY0207的初篩抑制效果；B2、C2和D2為復(fù)篩抑制效果。

2.2 拮抗真菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

如圖2所示，3株拮抗真菌培養(yǎng)3 d時(shí)菌絲已布滿整個(gè)平板，6 d時(shí)均有明顯的產(chǎn)孢，具有較好的生長(zhǎng)繁殖和空間競(jìng)爭(zhēng)能力。菌株P(guān)DSLS0101氣生菌絲茂盛棉絮狀，菌落背面淺綠色至綠色；分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)彎曲安瓿狀，次級(jí)分枝對(duì)生，分生孢子球形、近球形，淺綠色。菌株NYZP0201菌絲纖細(xì)無(wú)色，具分隔，多分枝，菌落初為白絮狀、灰綠色，菌落背面后期黃綠色；分生孢子梗對(duì)生或互生，分生孢子的小梗瓶形或錐形，分生孢子多為球形、近球形，藍(lán)綠色。菌株LYRY0207氣生菌絲卷毛狀，產(chǎn)孢簇同心輪紋狀分布，菌落后期形成明顯的同心環(huán)，背面淺綠色；分生孢子梗對(duì)生或輪狀互生，分枝較短，瓶梗粗大安瓿型，分生孢子橢圓形，淺綠色。初步將3株拮抗真菌鑒定為木霉屬（spp.）。

注：A、B和C為PDSLS0101、NYZP0201和LYRY0207菌株；1、2：3d和6d的菌落形態(tài)；3：子實(shí)體；4：分生孢子。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)擴(kuò)增3株木霉菌PDSLS0101、NYZP0201和LYRY0207的基因組ITS區(qū)段序列，得到大小為600 bp左右的特異性條帶，測(cè)序結(jié)果顯示序列有效長(zhǎng)度為608 bp、598 bp和626 bp。Blast比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)DSLS0101與upm13（MK027316）同源相似性為99.67%，且位于同一進(jìn)化分支，并命名為Ta-0101；菌株NYZP0201與CRC32（MK738148）同源相似性為100.00%，且位于同一進(jìn)化分支，命名為Th-0201；菌株LYRY0207與TVEPSk68（MH651384）同源相似性為99.18%，且位于同一進(jìn)化分支，命名為Tv-0207（圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果將菌株Ta-0101鑒定為棘孢木霉，菌株Th-0201鑒定為哈茨木霉，菌株Tv-0207鑒定為毛簇木霉。

圖3 基于rDNA-ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 拮抗木霉菌抑菌譜的測(cè)定

平板對(duì)峙培養(yǎng)法結(jié)果表明，3株木霉菌對(duì)9種煙草病原菌均有不同程度的抑制作用（圖4），抑菌率介于35.42%～92.00%（表2），表明3株木霉菌具有非常好的抑菌廣譜性。其中對(duì)根串珠霉菌的抑菌效果最顯著，抑菌率介于88.23%～92.00%，拮抗系數(shù)均為Ⅰ級(jí)。

表2 3株拮抗木霉菌對(duì)常見(jiàn)煙草病原菌的抑制作用

Tab.2 Inhibition effects of 3 antagonistic Trichoderma spp. strains on common tobacco pathogens

圖4 3株拮抗木霉菌對(duì)常見(jiàn)煙草病原菌的平板抑制效果

2.4 拮抗木霉菌對(duì)煙草種子促生及根系活力的影響

培養(yǎng)皿濾紙保濕法結(jié)果顯示（表3），3株木霉菌浸種處理的萌發(fā)率和莖長(zhǎng)均高于空白對(duì)照組，以Ta-0101處理結(jié)果最顯著；3株木霉菌浸種處理的根長(zhǎng)和總長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組，且都達(dá)到極顯著差異水平。圖5所示，漂浮育苗中3株木霉菌處理的根系活力均顯著高于空白對(duì)照組，棘孢木霉Ta-0101、哈茨木霉Th-0201和毛簇木霉Tv-0207處理的根系活力分別高出對(duì)照組99.53%、74.72%和84.03%，具有較好的根系促生作用。

表3 拮抗木霉菌孢子懸浮液浸種對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

Tab.3 Effects of seed soaking in spore suspension of antagonistic Trichoderma spp. strains on seed germination and growth

注：每列每個(gè)處理中不同小寫字母之間表示處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），大寫字母（＜0.01）。下同。

Note: Different lowercase letters in each column and each treatment indicate statistically significant differences between treatments (<0.05), and uppercase letters (<0.01). The same as below.

圖5 拮抗木霉菌發(fā)酵液對(duì)煙苗根系活力的影響

2.5 拮抗木霉菌對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

由表4可知，木霉菌處理與空白對(duì)照組相比，在各農(nóng)藝性狀指標(biāo)上均有較好的促進(jìn)作用，處理組的煙株長(zhǎng)勢(shì)均衡，葉片結(jié)構(gòu)緊密，根系發(fā)達(dá)。棘孢木霉Ta-0101處理的煙株各農(nóng)藝性狀指標(biāo)均顯著高于空白對(duì)照組，其中最大葉面積增加56.55%，地上部鮮重提高136.69%，根系鮮重提高140.28%。

表4 拮抗木霉菌發(fā)酵液對(duì)盆栽煙草的促生效果

Tab.4 Growth-promoting effect of antagonistic Trichoderma spp. strains fermentation broth on potted tobacco

2.6 拮抗木霉菌的促生能力及產(chǎn)酶活性測(cè)定

促生能力及產(chǎn)酶活性測(cè)定結(jié)果表明，3株木霉菌均可以產(chǎn)生NH3，不產(chǎn)生IAA，能在有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上很好地生長(zhǎng)，在固氮培養(yǎng)基和解鉀硅酸鹽培養(yǎng)基上菌絲稀疏，產(chǎn)孢量較少呈點(diǎn)狀分布，具有產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)蛋白酶和解淀粉酶活性，無(wú)解纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性（表5）。以上結(jié)果初步表明，3株木霉菌均有一定的促生能力和水解酶活性，與種子及促生試驗(yàn)結(jié)果相印證，且促生能力不是通過(guò)產(chǎn)IAA引起的。

表5 拮抗木霉菌的促生潛力及產(chǎn)酶活性

Tab.5 The growth-promoting potential and enzyme-producing activity of antagonizing Trichoderma spp. strains

注：IAA：產(chǎn)IAA；NPA：解無(wú)機(jī)磷；OPA：解有機(jī)磷；NFb：固氮；Sil：解鉀硅酸鹽；NH3：產(chǎn)氨；Sid：產(chǎn)噬鐵素；Pro：產(chǎn)蛋白酶；Amy：產(chǎn)淀粉酶；Cel：產(chǎn)纖維素酶；Chi：產(chǎn)幾丁質(zhì)酶；＋：陽(yáng)性；－：陰性；A：可以生長(zhǎng)；A+：生長(zhǎng)良好。

Note: IAA: auxin production; NPA: inorganic phosphorus solution; OPA: organic phosphorus solution; NFb: nitrogen fixation solution; Sil: potassium silicate solution; NH3: ammonia production; Sid: iron phagocytosis; Pro: protease production; Amy: amylase production; Cel: cellulases production;Chi: chitinases production; +: positive; -: negative; A: growth; A+: good growth.

2.7 拮抗木霉菌對(duì)煙草尖孢鐮刀菌的防治效果

由表6可知，3株木霉菌發(fā)酵液和70%甲基硫菌靈處理的較陽(yáng)性對(duì)照組（CK2）發(fā)病輕，病情指數(shù)顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。不同木霉菌處理組根系被侵染程度明顯較輕，比陰性對(duì)照組（CK1）矮小黃化，根系不同程度受損（圖6）。表明3株木霉菌對(duì)煙草尖孢鐮刀菌具有較好的防治效果。

表6 拮抗木霉菌發(fā)酵液對(duì)煙草尖孢鐮刀菌的盆栽防治效果

Tab.6 Disease control effect of antagonistic Trichoderma spp. strains fermentation broth on F. oxysporum in potted tobacco plants

圖6 拮抗木霉菌發(fā)酵液對(duì)盆栽防效根系的影響

3 討論

木霉菌用于防治植物病害的研究報(bào)道較多，但用于防治煙草鐮刀菌的研究較少。田艷艷等[26]篩選的棘孢木霉、哈茨木霉和毛簇木霉對(duì)煙草尖孢鐮刀菌有較好的抑制效果，平板抑菌率在70.31%～80.95%，與本研究所報(bào)道的木霉菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果相當(dāng)。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉Tr-0111對(duì)煙草鐮刀菌具有較好的抑菌效果和一定的促生作用[17]。相比而言，本研究發(fā)現(xiàn)的棘孢木霉Ta-0101、哈茨木霉Th-0201和毛簇木霉Tv-0207抑菌能力不同，促生效果更好。同時(shí)，本研究系統(tǒng)研究了3株木霉菌對(duì)煙草尖孢鐮刀菌的抑菌能力、促生潛力、菌株的功能性以及盆栽防效，揭示了它們的抑菌效能和促生防病效果。

有些木霉菌株可以穩(wěn)定地定殖在植株根部，改善植物新陳代謝、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量[27-28]。但關(guān)于生防菌的促生機(jī)制尚未完全明確，主要包括產(chǎn)吲哚乙酸、赤霉素、嗜鐵素、抗生素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，以及溶解磷礦物和其它養(yǎng)分的能力，抑制或降解根際有害物質(zhì)等[22,27]。宋玉娟等[24]報(bào)道棘孢木霉T-6能夠促進(jìn)煙株生長(zhǎng)，提高對(duì)煙草黑脛病和根黑腐的抗性。李艷娟等[29]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉能顯著促進(jìn)杉木種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，提高幼苗抗逆性和抗氧化酶活性。潘宣圳等[30]報(bào)道毛簇木霉Lj具有拮抗楊樹(shù)爛皮病菌并促進(jìn)小白菜生長(zhǎng)的功能。本研究的3株木霉菌均能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)，煙草的各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯地提高，但影響試驗(yàn)的因素較多，需要對(duì)施用量和施用次數(shù)等進(jìn)一步優(yōu)化。雖然定性測(cè)定了3株木霉菌的部分促生能力和水解酶活性，但關(guān)于木霉菌細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)及病原-微生物-寄主植物間互作機(jī)理的研究，尚需深入完善，這也是木霉菌促生作用機(jī)制研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究篩選、鑒定的棘孢木霉Ta-0101、哈茨木霉Th-0201和毛簇木霉Tv-0207抑菌譜廣，對(duì)煙草鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑菌效果；具有一定的水解酶活性，顯著提高了根系活力；室內(nèi)盆栽促生、防病效果明顯，具有較好的應(yīng)用潛力。

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Screening and identification of three strains ofspp. antagonizingand evaluation of their effects on promoting growth and disease control

YAO Chenxiao1,2, LI Xiaojie2, LIU Chang2, QIU Rui2, BAI Jingke2, XU Min3, CHEN Yuguo2, KANG Yebin1, LI Shujun2*

1 Horticulture and Plant Protection College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2 Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area/Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang 461000, China;3 Henan Provincial Tobacco Company, Zhengzhou 450018, China

This study aims to screen out the strains with good antagonistic effects on tobaccoroot rot.The fungal strains with antagonistic effect onwere isolated and purified from the rhizosphere soil of healthy tobacco plants in the main tobacco leaf producing areas of Henan Province. The selected antagonistic strains were identified by morphological and molecular biological, and their growth-promoting and disease-control effects were determined.The three strains ofspp. with strong antibacterial ability were identified asTa-0101,Th-0201 andTv-0207. Their plate inhibition rates againstreached 91.24%, 84.71% and 82.48%, respectively. The three strains ofspp. had significant growth-promoting effects on the underground root length and total length of tobacco seeds, and the growth rate of tobacco seedling root length was 28.89%, 25.92% and 22.22%, respectively. The root vitality of tobacco seedlings was also significantly higher than that of the blank control group. Their growth-promoting effects on the maximum leaf area and fresh weight of tobacco plants were obvious, in particular the growth-promoting effect ofTa-0101 was the most significant. The pot experiments showed that the relative disease control rates of threespp. strains againstwere 78.95%, 69.73% and 69.73%, which were all higher than the disease control rateof 70% thiophanate-methyl treated with 1000 times solution.The three antagonisticstrains have good bacteriostatic efficacy, growth-promoting and disease-preventing effects, showing great application prospects.

Tobacco;spp.; inhibitory effect; growth promotion; control effect

Corresponding author. Email：lishujun9396@126.com

河南省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草根腐病害發(fā)生的微生物群落分析和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警研究”（2020410000270012）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草綠色植保創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“煙草主要病蟲害綠色防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（2022TD26）

姚晨虓（1998—），碩士研究生，主要研究方向?yàn)闊煵葜脖?，Tel：0374-4518504，E-mail：18438615892@163.com

通信作者：李淑君（1966—），研究員，研究方向?yàn)闊煵葜脖＃琓el：0374-4511016，E-mail：lishujun9396@126.com

2021-12-02；

2022-04-21

姚晨虓，李小杰，劉暢，等. 3株拮抗煙草尖孢鐮刀菌的木霉菌篩選鑒定及促生防病效果評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2022，28（4）. YAO Chenxiao, LI Xiaojie, LIU Chang, et al. Screening and identification of three strains of Trichoderma spp. antagonizing Fusarium oxysporum and evaluation of their effects on promoting growth and disease control[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi: 10. 16472/j.chinatobacco.2021.T0224