徐麗萍 宋欣偉 戴巧定 關(guān)天容 張艷 藺娜 王吉安

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

炎癥性貧血（anemia of inflammation，AI）廣泛存在于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者中，我國(guó)RA患者貧血發(fā)生率高達(dá)51.40%～72.06%[1]。研究表明，RA伴AI患者疾病活動(dòng)度更高，軀體功能更差，達(dá)到緩解的比例更低，治療花費(fèi)更高，且貧血越嚴(yán)重，影像學(xué)進(jìn)展越快[2-3]，治療難度更大，預(yù)后更差[4]。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）在RA伴貧血的機(jī)制中發(fā)揮核心作用[5-6]，一方面通過促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖、破骨細(xì)胞激活、類風(fēng)濕因子等自身抗體生成等多種途徑，導(dǎo)致或加重RA；另一方面還能夠刺激肝細(xì)胞釋放鐵調(diào)素（hepcidin），鐵調(diào)素可抑制網(wǎng)狀內(nèi)皮組織區(qū)域巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放、十二指腸上皮細(xì)胞對(duì)鐵的吸收，以及骨髓紅系祖細(xì)胞對(duì)鐵的利用，從而導(dǎo)致貧血[7]。目前針對(duì)RA伴AI患者，多以糖皮質(zhì)激素、IL-6受體阻斷劑托珠單抗為主要治療手段，但前者不良反應(yīng)大，后者價(jià)格昂貴[8-10]。中醫(yī)藥糾正貧血有效低毒，具一定優(yōu)勢(shì)，益氣消毒方（Yiqi Xiaodu prescription，YQXD）系宋欣偉全國(guó)名老中醫(yī)傳承工作室的常用經(jīng)驗(yàn)方，用于輔助治療自身免疫性血細(xì)胞減少效果良好。前期臨床研究證實(shí)，該方能夠顯著提高自身免疫性疾病患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)[11]，但作用機(jī)制尚未明確。基于此，本研究以膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎伴炎癥性貧血（collagen-induced arthritis with anemia of inflammation，CIA-AI）大鼠模型為對(duì)象，探究YQXD糾正AI的相關(guān)機(jī)制，以期為臨床推廣提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，5周齡，體質(zhì)量（150±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012]，實(shí)驗(yàn)程序均按照中國(guó)科學(xué)技術(shù)部制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)意見”進(jìn)行（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-2021115-13）。大鼠飼養(yǎng)于22℃的恒溫環(huán)境，晝夜周期各12 h，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料并每周稱取體質(zhì)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 BX51T-PHD-J11型顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司；RM2016型切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)萊卡公司；MEK-6400C型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購(gòu)于日本SYSMEX有限公司；AE100型電子天平購(gòu)于瑞士METTER公司；MDF-382E型低溫冰箱為日本三洋公司產(chǎn)品。

1.3 藥物與試劑 YQXD由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，臨床60 kg成人每日劑量為黨參20 g，白術(shù)12 g，茯苓15 g，水牛角30 g，金銀花15 g，連翹12 g，牡丹皮10 g，全蝎3 g，蜈蚣3 g，蘄蛇3 g，按照臨床等效劑量換算公式[12]，換算得出動(dòng)物等效劑量即YQXD低劑量13.4 g/（kg·d），2倍使用劑量即中劑量26.8 g/（kg·d），4倍使用劑量即高劑量53.6 g/（kg·d）。由醫(yī)院制劑室配置成顆粒劑，臨用前用蒸餾水配置成相應(yīng)濃度的混懸液。注射用人IL-6購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司（批號(hào)：200-06-20）；大鼠IL-6、鐵蛋白（ferritin）和hepcidin酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購(gòu)于江蘇晶美生物科技有限公司 （批號(hào)：ELK1158、ELK3783、ELK8206）；血清鐵（Fe）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所（批號(hào)：A039-1-1）；伊紅（hematoxylin，H）、蘇木素（eosin，E）染液均購(gòu)于上海華藍(lán)生物科技公司（批號(hào)：17372-87-1、517-28-2）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組與給藥

1.4.1.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)預(yù)留5只大鼠為正常組，另35只參照文獻(xiàn)[13]方法制備CIA大鼠模型。具體造模方法：大鼠尾部皮下注射牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑的混合乳劑0.2 mL/只，并于第7天注射牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑的混合乳劑0.1 mL/只，進(jìn)行二次免疫。關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥1分，表示造模成功。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無發(fā)紅、腫脹；1分：踝關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)輕度發(fā)紅、腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)重度發(fā)紅、腫脹；3分：整個(gè)腳掌包括趾端嚴(yán)重發(fā)紅、腫脹；4分：不能負(fù)重。造模成功的25只CIA大鼠，連續(xù)7 d腹腔注射0.1 μg·mL-1的IL-6溶液0.4 mL，誘導(dǎo)CIA-AI模型。造模后第7天以血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行大鼠外周血紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）計(jì)數(shù)，以確定造模是否成功，RBC＜7.8×1012/L表示造模成功[14-15]。 將造模成功的20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：模型組及YQXD低、中、高劑量組，每組各5只。

1.4.1.2 給藥方式 YQXD低劑量組大鼠予臨床等效劑量（35 mg·mL-1），中劑量組予2倍等效劑量（70 mg·mL-1）；高劑量組予4倍等效劑量（140 mg·mL-1），正常組及模型組每日分別予注射用水灌胃，各組灌胃均為2 mL，持續(xù)2周。

1.4.2 樣本采集 大鼠末次給藥1 h后，0.3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血1 mL，抗凝待用，另取4 mL全血于促凝管中，3 000 r·min-1離心15 min，取血清-20℃保存待用。分離肝臟并稱質(zhì)量，另外將右側(cè)股骨保存于4%的多聚甲醛中，固定待用。

1.4.3 臟器指數(shù)測(cè)定 取上述分離的肝臟和單側(cè)完整股骨，稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)（mg·g-1）=臟器質(zhì)量（mg）/動(dòng)物體質(zhì)量（g）。 測(cè)定完成后剪取每份肝臟組織100 mg左右，制備組織勻漿，-20℃保存待用。

1.4.4 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血細(xì)胞水平取上述抗凝管中的全血，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，檢測(cè)外周血細(xì)胞水平，包括外周血中白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、RBC、血小板（platelet，PLT）計(jì)數(shù)，以及HGB、平均紅細(xì)胞體積（mean red blood cell volume，MCV）水平。

1.4.5 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色檢測(cè)股骨骨髓病理形態(tài)學(xué)變化 取浸泡于固定液中的完整股骨，4℃下存放15 d后，常規(guī)石蠟包埋后切片，將厚度3～5 μm的組織切片附于多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜，HE染色，光鏡下觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4.6 ELISA檢測(cè)血清與肝組織勻漿IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平 取凍存的血清與肝組織勻漿樣本，按照ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)各組大鼠血清與肝組織勻漿中IL-6、鐵蛋白和hepcidin水平。

1.4.7 比色法測(cè)定血清與肝組織勻漿中鐵水平 取凍存的血清與肝組織勻漿樣本，按照血清鐵測(cè)定試劑盒說明書，檢測(cè)各組大鼠血清與肝組織勻漿中的鐵水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差不齊，用Dunnett's T3檢驗(yàn)，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臟器指數(shù)比較 與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，YQXD高劑量組肝臟指數(shù)下降（P＜0.05），低、中劑量組肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組大鼠的單側(cè)股骨指數(shù)顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，YQXD低、中、高劑量組單側(cè)股骨指數(shù)上升（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量相關(guān)性。 見表1。

表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較Tab.1 Comparison of organs index in each group （±s， mg·g-1）

表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較Tab.1 Comparison of organs index in each group （±s， mg·g-1）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group， *P＜0.05， **P＜0.01;compared with model group， ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

組別 肝臟指數(shù) 單側(cè)股骨指數(shù)正常組 0.0345±0.00071 0.665±0.021模型組 0.0360±0.00081* 0.618±0.062**YQXD 低劑量組 0.0355±0.00071 0.635±0.007▲YQXD 中劑量組 0.0355±0.00212 0.645±0.021▲YQXD高劑量組 0.0345±0.00071▲ 0.655±0.021▲▲

2.2 各組大鼠外周血細(xì)胞比較 與正常組比較，模型組WBC、RBC計(jì)數(shù)和HGB水平均明顯下降（P＜0.01），但PLT、MCV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與模型組比較，YQXD干預(yù)后WBC、RBC和HGB水平出現(xiàn)劑量依賴式升高（P＜0.05，P＜0.01），PLT和MCV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠外周血細(xì)胞比較Tab.2 Comparison of peripheral blood cells in each group （±s）

表2 各組大鼠外周血細(xì)胞比較Tab.2 Comparison of peripheral blood cells in each group （±s）

注：與正常組比較， **P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group， **P＜0.01;compared with model group， ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

組別 WBC（×109/L） RBC（×1012/L） HGB（g·L-1） MCV（fL） PLT（×109/L）正常組 5.99±0.09 8.51±0.31 151.0±1.41 53.95±1.21 1 092.5±24.7模型組 4.84±0.18** 7.52±0.39** 144.3±2.06** 52.70±0.88 1 162.0±11.4 YQXD 低劑量組 4.88±0.28 7.89±0.46 148.0±2.83 52.05±0.21 1 141.5±15.9 YQXD 中劑量組 5.09±0.08▲ 8.19±0.41▲ 148.5±0.71▲ 52.30±0.42 1 138.5±19.1 YQXD 高劑量組 5.34±0.06▲▲ 8.50±0.09▲▲ 151.0±1.41▲▲ 52.60±0.14 1 110.5±13.9

2.3 各組大鼠股骨骨髓病理形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠股骨骨膜、髓腔和軟骨組織結(jié)構(gòu)清晰，髓腔內(nèi)可見豐富的細(xì)胞成分（粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、有核細(xì)胞等），未見脂肪細(xì)胞和纖維組織。模型組粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞減少，髓腔內(nèi)充填水腫的血管纖維脂肪組織。與模型組比較，YQXD各劑量組骨髓造血情況逐漸改善，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞逐漸減少。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨骨髓病理形態(tài)學(xué)（HE染色，100×）Fig.1 Pathological morphology of femoral bone marrow in each group（HE stain， 100×）

2.4 各組大鼠血清及肝組織勻漿IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清及肝組織勻漿中IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，YQXD高劑量組大鼠血清及肝組織勻漿中IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平明顯降低（P＜0.05），中、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清及肝組織勻漿IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平比較Tab.3 Comparison of IL-6， ferritin and hepcidin levels in serum and liver tissue homogenate in each group （±s）

表3 各組大鼠血清及肝組織勻漿IL-6、鐵蛋白、hepcidin水平比較Tab.3 Comparison of IL-6， ferritin and hepcidin levels in serum and liver tissue homogenate in each group （±s）

注：與正常組比較， **P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with normal group， **P＜0.01;compared with model group， ▲P＜0.05.

I L-6（p g·m L-1） 鐵蛋白（p g·m L-1） h e p c i d i n（n g·m L-1）血清 肝組織勻漿 血清 肝組織勻漿 血清 肝組織勻漿正常組 1 1.6 6±0.7 5 7 2 8.7 9±3 7.8 6 2 5.4 5±2.6 4 1 6 1 1.7 1±1 4 1.3 6 0.9 2±0.0 2 1 7.7 7±0.4 9模型組 1 4.1 4±1.8 8** 1 0 5 8.0 4±6 0.4 9** 2 9.4 2±0.5 1** 2 1 1 0.8 5±2 8 4.4 4** 1.0 1±0.0 3** 2 2.5 6±2.0 9**Y Q X D 低劑量組 1 3.5 8±1.5 2 1 0 3 5.2 8±8 2.5 2 2 8.2 3±0.0 4 2 0 8 3.4 9±2 5.5 3 0.9 9±0.0 9 2 2.0 6±0.2 1 Y Q X D 中劑量組 1 2.2 3±0.9 2 9 5 6.4 7±7 4.5 6 2 7.9 6±0.3 5 1 9 7 9.9 7±1 5.9 4 0.9 8±0.1 0 2 1.4 6±0.0 8 Y Q X D高劑量組 1 1.9 1±0.0 4▲ 9 4 7.1 3±4 4.8 4▲ 2 6.3 2±0.4 1▲ 1 8 4 8.7 9±1 7.1 3▲ 0.9 4±0.0 4▲ 2 0.5 9±1.6 5▲組別

2.5 各組大鼠血清及肝組織勻漿中鐵水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清及肝組織勻漿中鐵水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，YQXD高劑量組大鼠血清及肝組織勻漿中鐵水平顯著升高（P＜0.01）。 見表4。

表4 各組大鼠血清及肝組織勻漿中鐵水平比較Tab.4 Comparison of iron level in serum and liver tissue homogenate in each group （±s， mg·L-1）

表4 各組大鼠血清及肝組織勻漿中鐵水平比較Tab.4 Comparison of iron level in serum and liver tissue homogenate in each group （±s， mg·L-1）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲▲P＜0.01。Note:Compared with normal group， *P＜0.05;compared with model group，▲▲P＜0.01.

鐵水平血清 肝組織勻漿正常組 2.1 5 6±0.7 9 4 4.0 2 9±3.1 2模型組 1.5 9 3±0.1 4* 3 3.7 3 9±4.1 8*Y Q X D 低劑量組 1.6 1 9±0.1 6 3 4.7 7 3±2.5 2 Y Q X D 中劑量組 1.6 8 6±0.8 9 3 5.8 2 6±4.1 4 Y Q X D 高劑量組 1.7 8 1±0.2 5▲▲ 3 6.8 7 9±3.1 2▲▲組別

3 討論

貧血影響著全世界1/3的人口[16]，而AI是臨床常見的貧血類型，不僅給患者造成乏力、疲勞、心功能衰竭等機(jī)體功能下降的臨床癥狀，更會(huì)加速基礎(chǔ)病情發(fā)展，增加治療難度，甚至成為某些疾病的獨(dú)立死亡因素，RA患者的現(xiàn)狀即是如此。理論上只要RA患者關(guān)節(jié)炎癥得到控制，AI的情況就能隨即改善，但實(shí)際上并非完全如此，非甾體消炎止痛藥、免疫抑制劑，以及拮抗腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）類生物制劑，均能不同程度地控制關(guān)節(jié)炎癥，但對(duì)貧血的改善效果不夠理想；盡管糖皮質(zhì)激素及IL-6拮抗劑能同時(shí)改善部分患者的RA及AI病情，但因藥物不良反應(yīng)、價(jià)格等各種影響因素，臨床長(zhǎng)期使用受到限制。

貧血屬中醫(yī)虛勞之血虛范疇，中醫(yī)認(rèn)為其根本病機(jī)是脾腎虧虛，病位在髓，治療上需運(yùn)用血肉有情之品以補(bǔ)益脾腎，陰陽同補(bǔ)，促進(jìn)氣血恢復(fù)[17-18]，但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)上述治療對(duì)于AI收效甚微。YQXD系宋欣偉全國(guó)名老中醫(yī)傳承工作室最常用的有效經(jīng)驗(yàn)方，用于輔助治療自身免疫性血細(xì)胞減少。宋師基于“久病入絡(luò)”理論，認(rèn)為免疫性血細(xì)胞減少癥的發(fā)生與瘀毒浸潤(rùn)骨髓之絡(luò)（即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的骨髓微環(huán)境）有關(guān)，瘀毒有先天、后天之分，先天瘀毒即稟賦不足，基因缺陷帶來的病理改變；后天瘀毒，即免疫異常介導(dǎo)的各類免疫細(xì)胞過度分泌的炎癥因子帶來的病理改變。團(tuán)隊(duì)針對(duì)先天不足、后天瘀毒入絡(luò)的病機(jī)，擬定了YQXD，方中以健脾益氣之黃芪、黨參、白術(shù)為基礎(chǔ)，具有培補(bǔ)后天之本的功效，輔以水牛角、金銀花、連翹、牡丹皮清熱涼血解毒，全蝎、蜈蚣、蘄蛇等蟲類藥搜風(fēng)通絡(luò)、攻毒散結(jié)，共奏益氣消毒、搜剔髓絡(luò)、刺激造血之效。前期研究發(fā)現(xiàn)，YQXD治療干燥綜合征引起的白細(xì)胞減少具有顯著療效，提示其治療結(jié)締組織病血液系統(tǒng)受累的有效性[11]，同時(shí)臨床也觀察到Y(jié)QXD治療RA合并AI患者的療效確切，但其機(jī)制未明。

目前，以多次多點(diǎn)注射Ⅱ型膠原和（或）完全弗氏佐劑的方式，建立AI動(dòng)物模型較為多見[19-21]，本研究在CIA模型基礎(chǔ)上聯(lián)合腹腔注射IL-6，建立CIA-AI模型大鼠，更符合臨床實(shí)際。造模成功后的大鼠呈正細(xì)胞正色素性貧血，血清鐵水平降低，鐵蛋白、炎癥因子IL-6以及hepcidin水平升高，臟器指數(shù)、骨髓造血功能亦有顯著下降，而YQXD干預(yù)后，上述指標(biāo)有不同程度的改善，提示YQXD糾正RA患者AI的作用機(jī)制涉及IL-6、hepcidin等核心因子。 見圖2。

圖2 YQXD糾正CIA-AI模型大鼠貧血的作用機(jī)制假設(shè)Fig.2 Hypothesis on the mechanism of YQXD in relieving anemia in CIA-AI model rats

骨髓是機(jī)體主要造血組織，其造血功能受多種信號(hào)通路因子調(diào)控，其中IL-6、hepcidin占據(jù)主導(dǎo)地位[5、7]。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，具有促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖、分化的作用，主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。RA等慢性炎癥狀態(tài)下，機(jī)體免疫細(xì)胞分泌更多的IL-6，后者刺激肝細(xì)胞釋放hepcidin，一方面抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放，以及十二指腸上皮細(xì)胞對(duì)鐵的吸收；另一方面阻礙骨髓紅系祖細(xì)胞對(duì)鐵的利用。本研究中，經(jīng)腹腔注射IL-6的模型組大鼠，其貧血情況更嚴(yán)重，血清及肝組織勻漿中IL-6、hepcidin、鐵蛋白水平顯著升高，而鐵水平明顯下降，此外骨髓組織中粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞明顯減少，髓腔內(nèi)充填著大量水腫的血管纖維脂肪組織，證實(shí)了IL-6在RA伴貧血發(fā)病機(jī)制中的核心作用。同時(shí)，本研究還證實(shí)了YQXD能不同程度修復(fù)慢性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨髓病理損傷，減少骨髓內(nèi)增生的脂肪細(xì)胞，增加造血細(xì)胞數(shù)量，但低劑量YQXD效果尚不理想。本研究探討了YQXD免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制，為臨床治療AI提供一定的理論基礎(chǔ)。但是，該研究?jī)H集中于骨髓造血細(xì)胞和免疫相關(guān)指標(biāo)，而其他相關(guān)指標(biāo)需要進(jìn)一步研究闡明。