■高 陽(yáng) 張國(guó)慧 郭曉淼 紀(jì)志誠(chéng) 譚曉彤 杜 鑫 周業(yè)勛 張丹丹*

（1.白城師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林白城 137000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

現(xiàn)今，在集約化、規(guī)?；酿B(yǎng)豬模式中，仔豬斷奶日齡逐漸提前，這既能加快豬場(chǎng)的周轉(zhuǎn)率，還能提高母豬的利用率[1]。然而，斷奶日齡的提前會(huì)給仔豬帶來(lái)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)。斷奶后環(huán)境變化與腸道生理負(fù)擔(dān)嚴(yán)重影響了仔豬的生長(zhǎng)性能，繼而影響豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益[2]。眾所周知，腸道在仔豬的消化系統(tǒng)中扮演重要角色，發(fā)育健全的腸道功能不僅為消化酶提供適宜的催化場(chǎng)所，還為腸道菌群提供良好的定植環(huán)境[3]。因此，在“全面禁抗”的大環(huán)境下，尋求新型、高效的飼料添加劑，改善斷奶仔豬腸道發(fā)育對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

角鯊烯是一種天然不飽和三萜，廣泛存在于動(dòng)物肝臟和皮膚中。1916年，日本學(xué)者在鯊魚(yú)肝臟中提取出角鯊烯。最初，角鯊烯多用于皮膚表面單態(tài)氧的清除和改善心臟的缺氧耐受力。隨后，體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明角鯊烯的佐劑安全性和飼用可行性。研究表明，角鯊烯對(duì)種公豬精液品質(zhì)具有較好的改善作用[4]。Gabás-rivera等[5]研究表明，補(bǔ)飼角鯊烯可增加小鼠血清中高密度脂蛋白和對(duì)氧磷酶-1的水平，并緩解小鼠的氧化應(yīng)激損傷。也有研究指出角鯊烯能改善羅斯雞胸肌肉品質(zhì)[6]。然而，角鯊烯作為畜禽飼料添加對(duì)斷奶仔豬的效果很少有報(bào)道。眾所周知，腸道健康關(guān)系著動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和經(jīng)濟(jì)效益，健全的腸道屏障和腸道機(jī)能有利于維持腸道穩(wěn)態(tài)和菌群定植。因此，本試驗(yàn)利用角鯊烯作為飼料添加劑，探究其對(duì)斷奶仔豬腸道發(fā)育、腸道菌群及消化機(jī)能的影響，為角鯊烯在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

純度約為92%的角鯊烯，宜春大海龜生命科學(xué)有限公司；抗氧化指標(biāo)試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光染料，天根生化科技有限公司；試驗(yàn)所需抗體，Abcam（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇24 頭25 日齡的斷奶三元雜交豬（杜×長(zhǎng)×大），體重相近且均為去勢(shì)雄性。試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將動(dòng)物隨機(jī)分為兩個(gè)處理，每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2 頭仔豬。A 組和B 組仔豬飼糧中角鯊烯添加水平分別為0 和250 mg/kg。預(yù)試期3 d，正試期25 d，所有仔豬自由飲水和采食，每日記錄采食量和剩料量。飼養(yǎng)試驗(yàn)于2021 年7 月在吉林省四平市梨樹(shù)市四棵樹(shù)鄉(xiāng)養(yǎng)殖合作社進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)日糧營(yíng)養(yǎng)水平參考NRC（2012）和《動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)參數(shù)及飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2010版）[7-8]，基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，屠宰仔豬，打開(kāi)仔豬腹腔收集空腸和回腸樣本，每個(gè)腸段收集4份，1份置于4%多聚甲醛溶液中，其余3份液氮預(yù)冷，轉(zhuǎn)置-80 ℃冰箱中。盲腸內(nèi)容物收集在2 mL凍存管中，液氮預(yù)冷，轉(zhuǎn)置-80 ℃冰箱中。

H.E.染色切片處理與分析參照沈夢(mèng)城[9]的方法。將收集到的仔豬空腸和回腸樣本置于4%多聚甲醛中固定48 h，設(shè)置Thermo Fisher Scientific 1000D型全自動(dòng)脫水機(jī)Daytime Rapidly 程序，依次浸入60%、70%、75%、80%、95%和100%。置于二甲苯中透明后，浸泡于脫水系統(tǒng)的蠟液中，包埋。設(shè)置切片機(jī)參數(shù)，空腸厚度5.5 μm，回腸5 μm。經(jīng)攤片烘干后，置于Thermo Fisher Scientific 24-4 型全自動(dòng)切片染色機(jī)，按內(nèi)置程序染色，中性樹(shù)膠封片。使用Toupview（X86）軟件對(duì)空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度測(cè)量，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度值。

RT-PCR 中mRNA 提取、反轉(zhuǎn)及IGF-1和GLP基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量及IGF-1 和GLP 蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定均參照Z(yǔ)hao 等[10]的方法。采用Primer Premier 6.0 軟件進(jìn)行PCR 引物設(shè)計(jì)，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

腸道胰蛋白酶（A080-2）、淀粉酶（C016-2）和脂肪酶（A054-1）的活性使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。

盲腸內(nèi)容物微生物組成檢測(cè)采用RT-PCR，具體方法參照溫曉鹿等[11]的方法。采用（Tiangen公司）試劑盒提取盲腸內(nèi)容物總細(xì)菌DNA，應(yīng)用ND-1000型核酸分析儀檢測(cè)DNA濃度，然后使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度。將總細(xì)菌DNA分別與不同濃度的總細(xì)菌、大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)指令進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度與Ct值做回歸分析，獲得回歸曲線(xiàn)，將樣品Ct值代入回歸方程計(jì)算得到目標(biāo)菌屬的DNA拷貝數(shù)，結(jié)果以每克盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)表示（單位：lg 拷貝數(shù)/g）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0 軟件中的one-way ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用LSD模塊進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。采用Origin pro 9.1 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道發(fā)育的影響（見(jiàn)表3、表4、圖1、圖2）

表3 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道發(fā)育的影響

表4 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

由表3 可知，飼糧添加250 mg/kg 角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度（P＜0.05），并降低隱窩深度，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，飼糧添加250 mg/kg角鯊烯，仔豬空腸、回腸絨毛高度/隱窩深度值顯著升高（P＜0.05）。由圖1 可知，飼糧添加角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸組織中IGF-1和GLP基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。由表4 和圖2可知，角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸及回腸組織中IGF-1蛋白和GLP蛋白相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。

圖1 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖2 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.2 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道消化酶活性的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，飼糧添加角鯊烯可顯著提高空腸食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性（P＜0.05）。飼糧添加角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬回腸食糜中淀粉酶活性（P＜0.05），但是，飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬回腸食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表5 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道消化酶活性的影響（IU/mg）

2.3 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道抗氧化性能的影響（見(jiàn)表6）

由表6可知，飼糧添加角鯊烯可顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸組織中MDA 含量（P＜0.05），同時(shí)顯著提高仔豬空腸和回腸組織中SOD 與GSH-Px 的活性（P＜0.05）。

表6 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬腸道抗氧化性能的影響

2.4 飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物組成的影響（見(jiàn)圖3）

由圖3可知，飼糧添加角鯊烯對(duì)斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物總細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。飼糧添加角鯊烯能顯著降低斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），同時(shí)顯著提高乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量（P＜0.05）。

圖3 角鯊烯對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物組成的影響

3 討論

近年來(lái)，斷奶仔豬的腸道發(fā)育狀態(tài)得到了廣泛關(guān)注與研究。一般認(rèn)為，仔豬的腸道在42～45 d 發(fā)育健全，而仔豬的斷奶多為21～35 d[12-13]。研究表明，斷奶后，仔豬腸道的應(yīng)激損傷會(huì)加速腸上皮細(xì)胞凋亡，阻礙腸道發(fā)育，對(duì)仔豬的免疫和消化功能也產(chǎn)生嚴(yán)重影響[14-15]。因此，仔豬快速度過(guò)斷奶應(yīng)激并完成腸道發(fā)育，對(duì)其健康生長(zhǎng)具有重要的意義。角鯊烯具有機(jī)體抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和心血管保護(hù)等功能[16]。研究表明，飼糧添加125～250 mg/kg 角鯊烯能夠改善早期斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和抗氧化性能，促進(jìn)空腸絨毛生長(zhǎng)[17]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸VH 和VCR，同時(shí)顯著提高空腸組織中IGF-1和GLP基因相對(duì)表達(dá)量及IGF-1和GLP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。GLP-2 蛋白通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)合成速率，促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，防止腸黏膜萎縮[18]。此外，GLP 蛋白可以刺激腸道上皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IGF-1，IGF-1可以誘導(dǎo)隱窩的增殖、絨毛的伸長(zhǎng)和腸道屏障功能的完整性[19]。在上述過(guò)程中，得益于角鯊烯良好的流動(dòng)性，使其可以在腸道上皮均勻分布，發(fā)揮抗炎及抑菌作用，為空腸和回腸絨毛的發(fā)育提供有利條件。

眾所周知，腸道消化酶的活性受多種因素制約（如動(dòng)物年齡、腸道穩(wěn)態(tài)、生理階段和健康狀況等）。一般認(rèn)為，發(fā)育良好的腸道結(jié)構(gòu)有利于發(fā)揮消化酶的高效性。一方面，良好腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)能為消化酶提供反應(yīng)場(chǎng)所；另一方面，健康的腸道環(huán)境有利營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。該研究中，飼糧添加角鯊烯顯著提高斷奶仔豬空腸食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，并有效改善空腸中上述消化酶活性。已有研究表明，早期斷奶仔豬飼糧中添加角鯊烯能促進(jìn)空腸絨毛生長(zhǎng)，降低空腸隱窩深度并改善空腸黏膜層通透性[17]。此外，角鯊烯在改善腸道緊密連接蛋白表達(dá)量方面也發(fā)揮重要作用。因此，可初步認(rèn)為角鯊烯可能在維持腸道結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性中扮演重要角色，繼而改善空腸與回腸中消化酶的活性。

飼糧的改變是導(dǎo)致斷奶仔豬腸道應(yīng)激的重要因素之一，仔豬的營(yíng)養(yǎng)源從母乳變?yōu)橹参镄燥暳?，飼糧中的纖維雖能促進(jìn)腸道的發(fā)育，但更容易造成絨毛受損，導(dǎo)致腸細(xì)胞抗氧化性能降低和腸屏障通透性增大，進(jìn)而影響腸道的發(fā)育及功能[20]。研究表明，肉雞和大鼠補(bǔ)飼角鯊烯能顯著降低血清、肝臟和肌肉組織中的MDA 水平，并提高SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性[6,21-22]。該研究表明，飼糧添加250 mg/kg 角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬空腸、回腸組織中SOD 和GSH-Px活性，并降低MDA含量。其原因可能有兩方面；一方面角鯊烯自身具備良好的單態(tài)氧清除能力，在清除自由基和超氧陰離子的同時(shí)，調(diào)控機(jī)體多種抗氧化酶的活性，二者協(xié)同作用改善仔豬腸道抗氧化機(jī)能；另一方面，角鯊烯通過(guò)維持三羧酸循環(huán)酶和呼吸標(biāo)記酶活性，改善能量狀態(tài)并增強(qiáng)線(xiàn)粒體的抗氧化能力。

正常情況下，仔豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)平衡，有益菌群和有害菌群相互博弈，共同影響宿主的健康狀態(tài)[11]。然而，斷奶應(yīng)激會(huì)打破仔豬腸道中原有的微生物穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉、消化酶活性降低和采食量降低等問(wèn)題[23]。該研究中，飼糧添加角鯊烯可顯著降低仔豬盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量，并提高乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量。其原因可能是角鯊烯在維持腸道結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。良好的腸道結(jié)構(gòu)為益生菌的定植提供條件，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制有害菌的增殖，維持動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，有利于腸道發(fā)育和動(dòng)物生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

角鯊烯可提高斷奶仔豬空腸和回腸的VH 和VCR，提高空腸和回腸內(nèi)容物中消化酶活性，增強(qiáng)腸道的抗氧化機(jī)能并改善盲腸內(nèi)容物的微生物組成。