閔思敏，劉小碣，丁渡山，張小楠，陶偉婷，李 言，3△

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233000；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠 233000；3常州大學(xué)，江蘇常州 213000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征的肺部表現(xiàn)［1］。中性粒細(xì)胞積聚和促炎細(xì)胞因子作用于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞間連接的破壞，例如緊密連接，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生滲漏，肺泡腔內(nèi)富含蛋白的水腫液積聚，發(fā)生低氧血癥［2-3］。Rho GTPase家族成員通過(guò)皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白的形成動(dòng)態(tài)調(diào)控細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架重塑。Ras 相關(guān)C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）是Rho GTP 酶家族的Rac亞家族中的一員，通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架來(lái)維持微血管屏障功能。在LPS刺激下，Rac1 增加，從而激活下游的調(diào)控因子p21 活化激酶（p21-activated kinases，PAKs），進(jìn)而調(diào)控LIM激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）的活性。LIMK1 在體外和體內(nèi)又能使絲切蛋白（cofilin）在Ser3 位點(diǎn)特異性磷酸化，而這一磷酸化使cofilin 失活［4-5］。cofilin 的Ser3 位點(diǎn)的磷酸化是肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞外信號(hào)的主要交集，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮，內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成，細(xì)胞通透性增高［6］。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是中藥川芎的主要有效成分，主要化學(xué)成分為四甲基吡嗪［7］。TMP 具有廣泛的臨床作用，包括擴(kuò)張血管和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞［8］、通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)靶器官循環(huán)來(lái)減輕機(jī)體膿毒血癥的臨床癥狀［9］。但TMP 是否對(duì)ALI 具有保護(hù)作用還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將TMP 與Rac1/LIMK1 信號(hào)通路及其磷酸化水平聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)構(gòu)建脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ALI小鼠模型，探討TMP在ALI中的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小 鼠，6～8 周 齡，體重為（20±2）g，購(gòu)于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0004。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障環(huán)境12 h 光照黑暗交替、（24±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%下自由攝食飲水。

2 主要試劑

鹽酸TMP 購(gòu)自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；地塞米松（dexamethasone，Dex）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；LPS購(gòu)自Sigma；Rac1和LIMK1抗體購(gòu)自Abcam；p-LIMK1 抗體購(gòu)自Affinity；β-actin 抗體購(gòu)自ABclonal；PhosSTOP 磷酸酶抑制劑購(gòu)自Roche；蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液購(gòu)自Biosharp；ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；BCA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司；羊抗兔/鼠的II 抗購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動(dòng)物分組及造膜 將60 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為6 組：對(duì)照（control，CON）組、模型組（LPS 組）、Dex 組、低劑量（40 mg/kg）TMP（low-dose TMP，TMPL）組、中劑量（80 mg/kg）TMP（middle-dose TMP，TMP-M）組和高劑量（120 mg/kg）TMP（high-dose TMP，TMP-H）組，每組10 只。ALI 小鼠模型制備：實(shí)驗(yàn)前將LPS 配成0.5 g/L 和2 g/L 的溶液。每只動(dòng)物第1 次腹腔注射LPS（2 mg/kg），第2 次氣管滴注LPS（4 mg/kg），滴注后立即將動(dòng)物直立并左右旋轉(zhuǎn)進(jìn)行造模。對(duì)照組小鼠第1 次腹腔注射與模型組等體積的生理鹽水，第2 次氣管滴注與模型組等體積的生理鹽水。Dex 組及各劑量TMP 組在第1 次腹腔注射LPS 前30 min 和第2 次氣管滴注LPS 后30 min 腹腔注射Dex（3 mg/kg）和TMP（40、80和120 mg/kg），對(duì)照組和模型組小鼠在Dex 組和各劑量TMP 組給藥同時(shí)給予等體積的生理鹽水。

3.2 肺組織濕干重比值（wet-to-dry weight ratio，W/D）檢測(cè) 用濾紙輕輕吸干肺組織表面水分并精密稱取濕重，在70 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘烤48 h至恒重，精密稱取干肺重量并按照公式計(jì)算W/D。

3.3 ELISA 試劑盒檢測(cè)肺組織中IL-1β 和TNF-α 含量 切割一定重量的肺組織，加入一定量的組織蛋白萃取劑，在自動(dòng)勻漿機(jī)中充分勻漿，3 000 r/min 離心20 min。按照ELISA 試劑盒方法，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，采用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行規(guī)范加樣，最后選擇450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值及相應(yīng)的濃度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度值。

3.4 Western blot 取肺組織50 mg 置于預(yù)冷的1.5 mL EP 管中，剪碎，加入500 μL RIPA 裂解液（含1%蛋白酶抑制劑100×和10% PhosSTOP 磷酸酶抑制劑10×），經(jīng)自動(dòng)勻漿機(jī)充分勻漿裂解，以12 000 r/min離心15 min 后收集上清液；BCA 法測(cè)定蛋白濃度，與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混勻，99 ℃煮5 min；每孔上樣量為30μg，120 V電壓跑膠60 min，200 mA電流轉(zhuǎn)膜120 min 后經(jīng)5%BSA 或脫脂牛奶搖床封閉2 h，Ⅰ抗置于冰箱4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min，Ⅱ抗常溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，用ECL 化學(xué)發(fā)光劑對(duì)膜進(jìn)行顯影，ImageJ 軟件分析其灰度值。

3.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）獲取和檢測(cè) 檢測(cè)脫頸處死小鼠，打開(kāi)胸腔暴露氣管，用預(yù)冷PBS（0.75 mL）沖洗4 次，2 500 r/min 離心5 min 沉淀細(xì)胞，取上清并將沉淀細(xì)胞重新懸浮在PBS 中，計(jì)算BALF 中白細(xì)胞總數(shù)及BALF 的蛋白濃度。

3.6 電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化 取右肺上葉組織，2.5%戊二醛預(yù)固定后，梯度乙醇脫水，包埋劑滲透，包埋、超薄切片，采用電子透射電鏡觀察并對(duì)比各組血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

3.7 肺組織病理學(xué)檢查及損傷評(píng)分 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h，流水沖洗，乙醇脫水石蠟包埋，切片機(jī)制備5μm 石蠟切片，烤片2 h，烘片4 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，蘇木精伊紅染色，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。分別以肺泡內(nèi)充血、肺泡出血、肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集在空氣和血管壁、肺泡壁厚度增加和透明膜形成程度評(píng)分［10］：最小損害為0分，輕微損害為1分，中等損害為2 分，嚴(yán)重?fù)p害為3 分，最大損害為4 分，累計(jì)上述4項(xiàng)的分值即為肺組織損傷評(píng)分。

3.8 血液動(dòng)力學(xué)的測(cè)量 使用PhysioSuite（Kent Scientific）測(cè)量心率和外周血氧飽和度（peripheral blood oxygen saturation，SpO2），測(cè)量在基線和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行。各處理組動(dòng)物均于LPS 第2 次氣管滴注后24 h讀數(shù)，取平均值進(jìn)行分析。

3.9 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h 后進(jìn)行冰凍切片，冰凍切片機(jī)制備5μm 冰凍切片，使用TUNEL 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織切片中是否存在凋亡細(xì)胞。

3.10 免疫組織化學(xué)染色 肺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后將組織切成5 μm 的切片，然后脫蠟、水化后，PBS 洗滌，放入檸檬酸緩沖液中在95 °C下孵育10 min，再次PBS 洗滌，在室溫下用3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min 后，5%的牛血清蛋白液封閉30 min，加入p-LIMK1 和Rac1 單克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，加入通用性II 抗室溫下孵育30 min，滴加DAB 顯色后用蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)（滿足正態(tài)分布及方差齊性），多組之間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Brown-Forsythe 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS對(duì)小鼠SpO2和心率的影響

我們用LPS 處理C57BL/6 小鼠建立ALI 小鼠模型（圖1A），模型組小鼠在LPS 刺激后發(fā)生明顯的肺水腫及炎癥（圖1B）。ALI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)是通過(guò)動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y(cè)定動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）/吸入氧濃度百分比（FiO2）比值（PaO2/FiO2）來(lái)評(píng)估低氧血癥的程度［11-12］。本研究的ALI 動(dòng)物模型是在沒(méi)有呼吸機(jī)支持的情況下構(gòu)建的，于是我們主要選用顯著、持續(xù)的SpO2下降代替PaO2/FiO2比值來(lái)衡量低氧血癥的程度。本研究中24 h 內(nèi)SpO2顯著下降（＞10%），心率明顯增高（P＜0.05），見(jiàn)圖1C、D，表明該動(dòng)物模型已被成功建立。

2 TMP對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常、組織輪廓清晰未見(jiàn)明顯異常，而LPS 組小鼠肺泡腔和間質(zhì)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，肉眼可見(jiàn)片狀血灶，肺組織肺泡壁明顯增厚，肺組織損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；TMP 各組及Dex 組小鼠肺組織紅細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔滲出減輕，肺泡壁與LPS 組相比變薄，TMP-M 組和Dex 組肺組織炎癥浸潤(rùn)減少最為顯著，肺泡結(jié)構(gòu)改善明顯，片狀血灶明顯減少及肺組織損傷評(píng)分明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。

Figure 1.LPS induced severe lung injury in mice.A：LPS administration process；B：the gross appearance of the lung was observed（white arrows：the space between the left and right lungs；blue arrows：the inflammation/redness of lung tissues；yellow arrow：the edema of lung tissues）；C and D：peripheral blood oxygen saturation（SpO2）and heart rate，respectively.Mean±SEM. n=5.#P＜0.05 vs control（CON）group.圖1 LPS導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重的肺損傷

HE 染色可見(jiàn)TMP 對(duì)LPS 導(dǎo)致的肺部病理?yè)p傷具有一定的保護(hù)改善作用，并且中劑量的TMP 治療效果最好，所以我們想知道中劑量的TMP 對(duì)細(xì)胞凋亡是否也有作用。與CON 組相比，LPS 會(huì)導(dǎo)致肺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多；而中劑量TMP 治療可以有效抑制細(xì)胞凋亡（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。

3 TMP對(duì)小鼠血管通透性的影響

血管通透性增加時(shí)，血管滲漏發(fā)生，肺部發(fā)生水腫，蛋白滲出以及白細(xì)胞增多。與對(duì)照組相比，模型組W/D 升高（P＜0.01）；與模型組相比，TMP-M 組及Dex 組的W/D 顯著降低，TMP-M 組降低最為明顯（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。

白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠BALF 中白細(xì)胞總數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，TMP 各組及Dex 組BALF 中白細(xì)胞總數(shù)顯著降低，且TMP-M 處理組效果最明顯（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

BCA法測(cè)定BALF中蛋白濃度結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠BALF 中蛋白濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，TMP 各組及Dex 組BALF 中蛋白濃度顯著下降，且TMP-M 組的下降最明顯（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。這說(shuō)明在40～120 mg/kg 劑量范圍內(nèi)，TMP的治療效果并不呈劑量依賴性。

4 TMP 對(duì)ALI 小鼠肺組織中IL-1β 和TNF-α 的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與CON 組相比，模型組小鼠肺組織中IL-1β 和TNF-α 表達(dá)水平顯著升高；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照Dex 組IL-1β 和TNF-α 的水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），中、高劑量TMP 組的IL-1β水平顯著下降（P＜0.01），低劑量TMP 組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TMP 各組TNF-α 水平均顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

5 TMP對(duì)ALI小鼠緊密連接的影響

上面實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TMP 可以改善LPS 誘導(dǎo)的小鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加，且中劑量（80 mg/kg）TMP 的治療效果較為理想。緊密連接是維持上皮細(xì)胞通透性的重要結(jié)構(gòu)，緊密連接受損則通透性增加。因此我們通過(guò)電鏡觀察了對(duì)照組、LPS組和中劑量TMP組的細(xì)胞緊密連接。正常小鼠肺組織毛細(xì)血管相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)連續(xù)條帶狀的緊密連接，細(xì)胞間未見(jiàn)縫隙；LPS 處理使部分內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)的緊密連接受損，有的內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)明顯裂隙；TMP處理后可抑制LPS 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的損傷，部分受損的緊密連接被修復(fù)，見(jiàn)圖5。

Figure 2.HE staining and TUNEL assay results of mouse lung tissues.A：HE staining of lung tissues；B：the apoptosis of lung tissue sections.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs CON group；**P＜0.01 vs LPS group.圖2 各組小鼠肺組織HE染色及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6 TMP 抑制LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞Rac1/LIMK1通路的激活

Western blot 結(jié)果顯示，與CON 組比較，LPS 組Rac1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；與LPS 組比較，低、中劑量TMP 組Rac1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），與陽(yáng)性對(duì)照Dex組的結(jié)果趨勢(shì)相一致（P＜0.01），而高劑量組與LPS 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A）。與CON 組比較，LPS 組p-LIMK1 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.01）；與LPS組比較，在各劑量TMP的預(yù)保護(hù)下p-LIMK1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），與陽(yáng)性對(duì)照Dex 組的結(jié)果趨勢(shì)相一致（P＜0.01）；LPS 組與各處理組相比LIMK1 表達(dá)無(wú)顯著差異，但p-LIMK1/LIMK1 水平與p-LIMK1 水平趨勢(shì)相一致（圖6B）。另外，免疫組化結(jié)果也顯示，與CON組比較，LPS 組Rac1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與LPS組比較，TMP 治療后Rac1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，與陽(yáng)性對(duì)照Dex 組的趨勢(shì)相一致；與CON 組比較，LPS 組p-LIMK1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與LPS 組比較，TMP 治療后Rac1 蛋白表達(dá)水平降低，這也與陽(yáng)性對(duì)照Dex組的趨勢(shì)相一致（圖6C）。這些結(jié)果表明TMP 可能是通過(guò)抑制Rac1/LIMK1 信號(hào)通路改善毛細(xì)血管通透性的。

Figure 3.Effects of TMP on total leukocyte count and protein concentration in BALF of mice.A：effect of TMP on lung wet-to-dry weight ratio in ALI mice；B：leukocyte suspension was used to suspend the cell precipitation in BALF and calculate the total number of leukocytes；C：BCA was used to measure the protein concentration in BALF.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs CON group；**P＜0.01 vs LPS group.圖3 TMP對(duì)小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和蛋白濃度的影響

Figure 4.Effect of TMP on inflammatory factors in lung tissues of ALI mice.The content of IL-1β（A）and TNF-α（B）in lung tissues was detected by ELISA.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs CON group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖4 TMP對(duì)ALI小鼠肺組織炎癥因子的影響

Figure 5.Effects of TMP on tight junctions in ALI mice.Red arrows represent tight junctions，and yellow boxes represent increased intercellular space.圖5 TMP對(duì)ALI小鼠緊密連接的影響

Figure 6.Effect of TMP pre-protection on the protein levels of Rac1，LIMK1 and p-LIMK1 in lung tissue of the mice with LPS-induced ALI.A and B：the protein levels of Rac1，LIMK1 and p-LIMK1 were determined by Western blot；C：the protein levels of Rac1 and p-LIMK1 were determined by immunohistochemical staining.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs CON group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.圖6 TMP預(yù)保護(hù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的Rac1、LIMK1和p-LIMK1蛋白水平的影響

討 論

ALI 是以肺組織發(fā)生急性炎癥反應(yīng)及毛細(xì)血管通透性增加為主要特點(diǎn)的臨床綜合征，ALI發(fā)生的標(biāo)志是內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的肺毛細(xì)血管膜通透性增加［13］。ALI可由多種病因?qū)е?，其中?xì)菌感染是最常見(jiàn)的病因，LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠誘導(dǎo)ALI［14］。本實(shí)驗(yàn)采用LPS 二次打擊誘導(dǎo)ALI小鼠模型，因?yàn)檎n題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用LPS 對(duì)小鼠進(jìn)行二次打擊建立的ALI 模型更接近臨床ALI 的復(fù)雜病理生理機(jī)制［15］。

TMP 是中藥川芎的根莖提取物，具有抗炎、改善微循環(huán)的作用，中藥成分復(fù)雜，為避免其他成分的影響，我們實(shí)驗(yàn)采用的是TMP單體即四甲基吡嗪。Dex是一種糖皮質(zhì)激素，常被用作抗炎藥物［16-17］；此外，已有研究證實(shí)Dex 可以通過(guò)干擾AKT/mTOR/RhoA 通路影響細(xì)胞骨架進(jìn)而抑制細(xì)胞通透性增加，故我們選擇Dex 作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組［18］。通過(guò)綜合文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)我們確定了TMP 低、中、高三個(gè)梯度，探究TMP對(duì)ALI的保護(hù)機(jī)制。

肺組織HE 染色和ELISA 檢測(cè)炎癥因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS 會(huì)導(dǎo)致肺部組織結(jié)構(gòu)受損，中性粒細(xì)胞聚集，發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；TMP 預(yù)處理可改善肺泡腔滲出、炎性浸潤(rùn)減少，與陽(yáng)性對(duì)照組作用一致。TUNEL實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TMP可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注TMP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的肺通透性的影響。接下來(lái)的肺組織W/D 結(jié)果表明LPS 導(dǎo)致W/D明顯增高，說(shuō)明LPS 引起毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而發(fā)生肺水腫；TMP 預(yù)處理后同Dex 組結(jié)果一致，可使內(nèi)皮通透性降低，肺水腫減輕。隨后檢測(cè)BALF 中白細(xì)胞總數(shù)和蛋白濃度結(jié)果也顯示，LPS導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞通透性增加，受損的細(xì)胞表面使蛋白質(zhì)水腫液流入，炎癥細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞，在炎癥因子，如IL-1β 和TNFα 等的影響下遷移到肺中，從而使BALF 中白細(xì)胞總數(shù)和蛋白濃度增加；TMP治療后可降低BALF中白細(xì)胞總數(shù)和蛋白濃度，與Dex治療效果一致。與Dex抗炎機(jī)制有所不同，本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注的是肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及TMP 的影響，結(jié)合電鏡結(jié)果分析我們可以看到LPS 導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接受損，通透性增高；由于前面實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TMP-M 組治療效果最好，所以我們觀察了CON 組、LPS 組和TMP-M 組的緊密連接，發(fā)現(xiàn)TMP-M 組治療后緊密連接受損程度明顯減輕。

我們已知LPS 會(huì)導(dǎo)致Rac1/LIMK1 通路激活、細(xì)胞骨架重構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的應(yīng)力纖維變粗、變短、排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞收縮，通透性增加，微血管漏發(fā)生；TMP 可減輕LPS 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高［19］。細(xì)胞骨架重構(gòu)決定內(nèi)皮細(xì)胞通透性。在之前的研究中，Rac1 被確定為決定細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的分子機(jī)制之一［20］。cofilin 的Ser3 磷酸化是肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞外信號(hào)的主要交叉點(diǎn)，cofilin被其磷酸化抑制，被其去磷酸化重新激活［21-22］。Rac1 可以通過(guò)調(diào)節(jié)p21 蛋白活化激酶（p21-activated kinase，PAK）產(chǎn)生肌動(dòng)球蛋白收縮，PAK是Rac1的下游調(diào)節(jié)器，可以調(diào)節(jié)LIMK1 的活性，LIMK1 磷酸化可促使cofilin磷酸化從而失活，所以磷酸化LIMK1增多使細(xì)胞骨架重構(gòu)［23］。Western blot 結(jié)果顯示LPS 會(huì)導(dǎo)致Rac1 增多，從而激活下游LIMK1，使p-LIMK1 增多，細(xì)胞骨架重構(gòu)，細(xì)胞通透性增加，而TMP 可以抑制Rac1/LIMK1 信號(hào)通路來(lái)降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性（圖7），保護(hù)ALI小鼠的作用與Dex組相比具有相同的療效。但低、中、高劑量的TMP 對(duì)Rac1/LIMK1 信號(hào)通路的抑制作用并不呈劑量依賴性，這可能是高劑量的TMP對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用導(dǎo)致的。

綜上所述，TMP 可以減輕ALI 小鼠的炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，對(duì)ALI 小鼠具有保護(hù)作用。Rac1/LIMK1 通路的激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)和通透性增高，這是參與和促進(jìn)肺部炎癥發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。TMP 可以通過(guò)抑制Rac1/LIMK1 通路減輕內(nèi)皮細(xì)胞骨架重構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞通透性，進(jìn)而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI，為臨床使用TMP 治療ALI 提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

Figure 7.Rac1/LIMK1 signaling pathway activation stimulated by LPS，and TMP protective mechanisms in vascular endothelial cells.圖7 LPS 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞Rac1/LIMK1 信號(hào)通路激活和TMP的保護(hù)機(jī)制