張莉（北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗實驗室,北京 100176）

乙型病毒肝炎DNA（HBV-DNA）是一類嗜肝細(xì)胞DNA病毒，是感染人類最小的DNA病毒，具有易傳染、難治愈的特點，其本身對肝臟沒有致病性，只有在免疫細(xì)胞參與的情況下才會導(dǎo)致肝損傷[1]。我國是乙型病毒肝炎病毒感染人群最多的國家，乙型肝炎隨著病情進展可逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌，我國每年約有30多萬人因肝硬化、肝癌等肝臟疾病死亡[2]。因此，準(zhǔn)確及時地診斷對乙肝患者的預(yù)后極其重要。臨床上HBV-DNA檢測主要依靠熒光定量PCR檢測法，是一種能夠準(zhǔn)確獲得病毒載量的定量檢測方法。檢測前常常需要提取樣本的DNA，目前主要有手工煮沸法（手工法）和全自動磁珠法（全自動法）兩種。本研究依據(jù)CNAS-CL02《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》、CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》等相關(guān)要求對HBV-DNA檢測的兩種不同核酸提取方法在使用相同的儀器和試劑的條件下進行性能驗證，分析其驗證結(jié)果，從而選擇合適的優(yōu)化系統(tǒng)提高實驗的正確性。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 HBV-DNA陽性標(biāo)本（北京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司）；正確度驗證室間質(zhì)評樣本（國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心）；精密度驗證高低值室內(nèi)質(zhì)控品（北京康斯坦徹公司）。

1.2儀器和試劑 實時熒光定量PCR檢測采用美國ABI7500實時熒光定量PCR儀；核酸提取儀為中山達安基因公司Smart32全自動核酸提取儀；檢測試劑采用中山達安基因公司生產(chǎn)的HBV-DNA檢測試劑盒；長沙湘智高速冷凍離心機。

1.3方法

1.3.1批內(nèi)精密度 采用北京康斯坦徹公司生產(chǎn)的HBV-DNA質(zhì)控血清，樣本濃度為3.01×106Copies/ml作為高值血清樣本和2.54×103Copies/ml作為低值血清樣本，由同一操作人員在同一臺儀器進行檢測。采用手工法和全自動提取法在同一次實驗中重復(fù)檢測高低值血清樣本各20次，記錄結(jié)果并計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV（%）。

1.3.2批間精密度 采用北京康斯坦徹公司生產(chǎn)的HBV-DNA高值血清，樣本濃度為2.11×106Copies/ml，每個工作日分別采用手工法和全自動提取法在同一次實驗中各檢測1次，檢測時間為2021年12月1日-2021年12月31日，共計23個質(zhì)控數(shù)據(jù)，記錄結(jié)果，計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)CV（%）。

1.3.3正確度 采用國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參考物質(zhì)，進行正確度驗證實驗。選取5個濃度水平的參考物質(zhì)，每種重復(fù)檢測2次，連續(xù)檢測5天，取平均值并計算每個濃度水平的偏倚。

1.3.4線性范圍 取一份HBV-DNA混合血清定值為2.58×108Copies/ml的樣本進行驗證，用陰性血清標(biāo)本按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000系列進行稀釋至濃度為2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml、2.58×102Copies/ml。每個濃度重復(fù)檢測3次，以稀釋計算值作為理論值，對各濃度稀釋樣品的實測值與理論值進行回歸分析，計算回歸方程y=bx+a，相關(guān)系數(shù)為R2。R2越接近1，表明相關(guān)性越好。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對所有檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1批內(nèi)精密度比較 分別采用手工法和全自動法檢測樣本濃度為3.01×106Copies/ml的高值血清樣本和2.54×103Copies/ml的低值血清樣本，均值比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），全自動法的CV值更小，批內(nèi)精密度更好，具體見表1。

表1 手工法和全自動法的批內(nèi)精密度比較

2.2批間精密度比較 分別采用手工法和全自動法檢測樣本濃度為2.11×106Copies/ml，共檢測23次，均值比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），全自動法的CV值更小，批間精密度更好，具體見表2。

表2 手工法和全自動法的批間精密度比較

2.3正確度比較 分別采用手工法和全自動法檢測濃度為2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清樣本。結(jié)果顯示，全自動法和手法檢測結(jié)果存在一定差異，全自動法的CV值更小，具體見表3。

表3 手工法和全自動法的正確度比較（Copies/ml）

2.4線性范圍比較 分別采用手工法和全自動法檢測濃度為2.58×108Copies/ml、2.58×107Copies/ml、2.58×106Copies/ml、2.58×105Copies/ml、2.58×104Copies/ml、2.58×103Copies/ml定值血清樣本及其稀釋后的樣本進行驗證。結(jié)果顯示，兩種方法在檢測濃度為2.58×103Copies/ml-2.58×108Copies/ml之間線性范圍較好，全自動法R2更接近1，優(yōu)于手工法，見表4。

表4 手工法和全自動法的線性范圍比較

3 討論

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一種準(zhǔn)確、快速的核酸定量檢測技術(shù)，是病原學(xué)檢測和分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。而核酸提取則是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[4]。手工法常常利用煮沸法將病毒的DNA直接從病毒顆粒中釋放出來，離心后的上清液除了含有核酸，還含有一部分干擾物質(zhì)，如血紅蛋白等[5]。手工法也存在一些生物安全隱患，比如氣溶膠[6]等。全自動法以磁珠法應(yīng)用最多，適合大批量樣本檢測[7]。磁珠由于能夠提供最接近天然抗原遞呈細(xì)胞的作用而提高了激活能力，簡化了核酸提取過程[8]。它的原理是利用磁性硅膠對DNA的特異性吸附，在磁場的作用下可分離獲得純度較高的病毒DNA。

在本研究中，全自動法檢測高值血清精密度、低值血清精密度的CV值分別為1.88%、2.50%，明顯低于手工法；用2.11×106Copies/ml的高值血清做批間精密度的驗證，結(jié)果顯示全自動法的CV值為2.70%，明顯低于手工法；用2.0×107Copies/ml、2.0×106Copies/ml、2.0×105Copies/ml、2.0×104Copies/ml、2.0×103Copies/ml的定值血清樣本進行兩種核酸提取方法的驗證，全自動法的偏倚分別為-1.17%、-1.11%、0.63%、0.58%、-0.98%，CV值均低于手工法。這可能是在操作過程中，操作人員的工作習(xí)慣和熟練程度存在差異造成。全自動法提取DNA的過程不需要人參與操作，減少了人工操作的污染以及操作過程中的不確定性，避免了因操作帶來的系統(tǒng)誤差[9]。對兩種操作方法的線性范圍對比后發(fā)現(xiàn)，兩種方法在較寬的線性范圍都具有良好的線性；相比較而言，全自動法優(yōu)于手工法，能更好地滿足臨床需要，這與馬貞麗[10]、董劍[11]等人的報道相一致。

全自動法和手工法都存在一定優(yōu)缺點。全自動法與手工法相較，主要依靠全自動核酸提取儀以及配套試劑耗材，成本較高；而手工法操作主要依靠于人，不需要儀器，耗材成本也相對較低，但也可能存在一些因操作差異而導(dǎo)致的誤差，如高溫分解病原體、高速離心、棄除上層廢液等環(huán)節(jié)易出現(xiàn)交叉污染[12]。另外，檢驗日常工作中避免不了儀器故障，檢修常常需要較長時間。此時，手工法就可取而代之。本實驗中兩種檢測方法都能滿足日常工作需求，但全自動法優(yōu)于手工法，手工法可用作全自動法出現(xiàn)故障時的備用。

綜上所述，全自動核酸提取法在精密度、正確度、線性范圍等方面均優(yōu)于手工法，簡化了工作流程，能更好地滿足實驗室自動化檢測工作，值得推廣應(yīng)用。