趙洪煥， 韓素桂， 陳艷梅， 李穎， 徐康， 鄭璇， 田立斌

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，其中非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的常見類型，約占85%[1]。近年來，關于NSCLC的診斷和預后評估成為研究熱點。微小RNA(microRNA，miR)在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。有研究表明，miR-744在肝癌患者中表達異常，miR-744可作為輔助評估肝癌預后的指標之一[4-5]。但目前關于微小RNA-744-5p(miR-744-5p)在NSCLC患者中的表達情況及其與患者臨床病理特征相關性的報道尚少。有研究表明，血清巨噬細胞抑制因子-1(macrophage inhibitory cytokine-1, MIC-1)水平與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關，但目前關于MIC-1表達與NSCLC患者預后的研究報道較少[6-7]。本研究通過研究NSCLC患者血清外泌體miR-744-5p及MIC-1水平與臨床病理特征的關系及其對預后的預測價值，以期為NSCLC的臨床診療及預后評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2018年1月至2019年12月唐山市人民醫(yī)院收治的126例NSCLC患者為觀察組，納入標準：①符合NSCLC的診斷標準，且經影像、病理等檢查確診為NSCLC[8]；②年齡≥18周歲；③術前未接受抗腫瘤治療。排除標準：①合并慢性阻塞性肺疾病或肺部感染等其他肺部疾病患者；②合并其他原發(fā)性惡性腫瘤或轉移瘤患者；③嚴重肝、腎、心功能不全或有結核、血液病患者；④精神障礙或意識模糊患者；⑤隨訪資料不完整或缺失者。選取同期在我院體檢的126例體檢健康者為對照組。本研究通過本院倫理委員會審核批準(批準號：2018015)。

1.2 研究方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法測定血清MIC-1水平[6]所有研究對象于入組次日清晨(未接受治療前)空腹抽取靜脈血5 ml，4 000 r/min離心10 min，分離血清并置于-80 ℃冷藏保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清MIC-1水平，試劑盒購自上海通蔚實業(yè)有限公司，操作步驟按照說明書進行。

1.2.2 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測定血清外泌體miR-744-5p水平[9]取5 ml靜脈血，采用RNA提取試劑盒提取外周全血RNA，并用反轉錄試劑盒進行反轉錄，根據(jù)SYBR RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR實驗。反應體系為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35次。采用2-△△Ct法測定miR-744-5p相對表達量，以U6為內參，每個樣本重復3次，取平均值。引物由北京博爾邁生物技術有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 觀察組與對照組miR-744-5p、MIC-1水平比較

觀察組的miR-744-5p水平低于對照組，MIC-1水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 觀察組與對照組miR-744-5p、MIC-1水平比較

2.2 不同預后NSCLC患者miR-744-5p及MIC-1水平比較

隨訪3年后，根據(jù)存活狀態(tài)將126例NSCLC患者分為生存組(94例)與死亡組(32例)。生存組的miR-744-5p水平高于死亡組，MIC-1水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表3。

表3 生存組與死亡組miR-744-5p及MIC-1水平比較

2.3 miR-744-5p及MIC-1判斷NSCLC患者預后的價值

ROC曲線分析結果顯示，miR-744-5p判斷NSCLC患者預后的截斷值為0.016，MIC-1為1 013.21 pg/ml，其他診斷試驗參數(shù)見表4。

表4 ROC曲線分析miR-744-5p及MIC-1判斷NSCLC患者預后的價值

2.4 不同臨床病理特征患者的miR-744-5p及MIC-1水平比較

根據(jù)miR-744-5p截斷值0.016將126例NSCLC患者分為高表達組(74例)與低表達組(52例)，亞組分析結果顯示，兩亞組的腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結轉移比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表5)；根據(jù)MIC-1截斷值1013.21 pg/ml將126例NSCLC患者分為高表達組(48例)與低表達組(78例)，亞組分析結果顯示，兩亞組的腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結轉移比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表6)。

表5 miR-744-5p高表達組與低表達組的臨床病理特征比較 [例(%)]

表6 MIC-1高表達組與低表達組的臨床病理特征比較 [例(%)]

2.5 Logistic回歸分析結果

分別以miR-744-5p水平低表達為因變量(是=1，否=0)，以MIC-1水平高表達為因變量(是=1，否=0)，以年齡(<60=0，≥60=1)，性別(女=0，男=1)，腫瘤大小(<3 cm=0，≥3 cm=1)，病理類型(鱗癌=0，腺癌=1)，TNM分期(Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1)，分化程度(中高分化=0，低分化=1)，吸煙(無=0，有=1)，淋巴結轉移(無=0，有=1)為自變量進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示，腫瘤≥3 cm、有淋巴結轉移及低分化是影響NSCLC患者miR-744-5p水平低表達和MIC-1水平高表達的獨立危險因素，見表7、8。

表7 影響miR-744-5p水平低表達的Logistic回歸分析結果

表8 影響MIC-1水平高表達的Logistic回歸分析結果

3 討論

NSCLC是臨床最常見的肺癌類型，其組織學類型以鱗癌和腺癌為主。在臨床上，NSCLC發(fā)病率高，惡性程度高，無進展生存期短，預后較差[10-11]。目前，NSCLC的治療仍以手術聯(lián)合放療、化療方式為主，但在治療的同時也面臨著諸多問題，如治療費用高、手術創(chuàng)傷大、治療效果不理想、早期不易診斷等，再加之腫瘤轉移、突變等也給NSCLC患者的臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[12]。因此尋找可用于NSCLC早期篩查及預測預后的生物學標志物具有重要的臨床意義。血清腫瘤標志物濃度的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是肺癌診查和預后評估的重要手段[13]。

miRNA是長度為18～25個核苷酸的非編碼內源性短鏈RNA，其在血清中性質穩(wěn)定，通過檢測其特異表達水平能夠及時有效地反映腫瘤的病理進程，在癌細胞的增殖、分化、凋亡等過程中均發(fā)揮著重要作用[14-15]。近年來，miRNA已作為潛在的腫瘤標志物常被應用于腫瘤的早期篩查[15]。外泌體是由多種物質組成、直徑為30～100 nm的微小囊泡，存在于人體血、尿、唾液中[16]，其結構有利于保護miRNA不受核糖核酸酶催化活性的影響，能精確反映腫瘤的主要特征[16-18]。

血清外泌體miR-744-5p是miRNA中特異性較高的一種，近年來被廣泛用于NSCLC的檢測。李少鵬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清外泌體miR-744-5p水平較健康組明顯降低，ROC曲線的AUC為0.934，提示血清外泌體miR-744-5p對NSCLC具有良好的診斷性能。本研究結果顯示，NSCLC患者的血清外泌體miR-744-5p呈低表達，與先前的研究結果一致。

MIC-1作為細胞因子，是轉化生長因子-β(TGF-β)超家族中的重要成員，其通過激活信號通路或抑制基因表達的方式對腫瘤細胞的生長、分離及轉移均具有重要影響，是參與肺癌細胞凋亡、侵襲、轉移的重要生物標志物[6-7]。本研究結果顯示，NSCLC患者的血清MIC-1水平呈高表達，與王紅敏等[7]的研究一致。

本研究進一步行ROC曲線分析顯示，當外周血miR-744-5p和MIC-1截斷值分別為0.016和1 013.21時，其預測患者死亡的AUC分別為0.875和0.821，提示外周血miR-744-5p和MIC-1水平可作為輔助指標用于預測NSCLC患者的預后。本研究進一步以miR-744-5p和MIC-1的截斷值為界，將患者分為高表達組與低表達組，比較不同臨床病理特征患者的miR-744-5p和MIC-1表達情況。結果顯示，腫瘤≥3 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化以及有淋巴結轉移患者的miR-744-5p表達水平更低，MIC-1表達水平更高，說明miR-744-5p低表達和MIC-1高表達均與腫瘤大小、TNM分期、分化程度及淋巴結轉移密切相關。而Logistic回歸分析結果進一步提示腫瘤≥3 cm、有淋巴結轉移及低分化是影響miR-744-5p水平低表達和MIC-1水平高表達的獨立危險因素。本研究未探討血清miR-744-5p和MIC-1對NSCLC發(fā)生發(fā)展的可能機制，且樣本量不大，仍需后續(xù)研究進一步探討。

綜上所述，NSCLC患者miR-744-5p呈低表達，MIC-1呈高表達，二者均與患者病情程度存在一定聯(lián)系，且在預測患者預后中具有一定的臨床價值。腫瘤≥3 cm、有淋巴結轉移及低分化是影響miR-744-5p水平低表達和MIC-1水平高表達的獨立危險因素。