陸勝民，王 璐，鄭美瑜，汪麗霞，趙四清，朱衛(wèi)東

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021；2.常山縣農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，浙江 常山 324200；3.衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院中藥材研究所，浙江 衢州 324000）

常山胡柚（Citrus changshan-huyouY.B. Chang）為我國(guó)柑橘屬植物一新種，是浙江省衢州市常山縣特有的雜柑類(lèi)良種[1]。2016 年12月，常山胡柚小青果干片以“衢枳殼”原藥材的名稱(chēng)正式納入《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015 年版）[2]。衢枳殼味苦、辛、酸，性微寒，含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等多種活性物質(zhì)[3]，其中的有效成分柚皮苷和新橙皮苷具有抑制癌細(xì)胞增殖[4-5]、修復(fù)皮膚損傷[6]、調(diào)節(jié)腸道菌群、減輕體重[7]、抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)[8]、助消化理氣[9]和消炎[10]等生物活性。常山縣全力助推衢枳殼產(chǎn)業(yè)發(fā)展，將其納入《常山胡柚產(chǎn)業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃（2017—2019）》，并制定出臺(tái)《關(guān)于加強(qiáng)“衢枳殼”藥材管理的指導(dǎo)意見(jiàn)（試行）》《衢枳殼原藥材管理指導(dǎo)意見(jiàn)》等文件，對(duì)種植、采摘、加工、銷(xiāo)售、倉(cāng)儲(chǔ)等各環(huán)節(jié)進(jìn)行了初步的規(guī)范。根據(jù)《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015 年版）[11]和《衢枳殼藥材種植、初加工技術(shù)規(guī)范》的要求，只有在7月份采摘的胡柚小青果才能作為衢枳殼中藥材原料，要求果徑為3～5 cm，外觀光潔、無(wú)病斑，且柚皮苷和新橙皮苷含量應(yīng)分別大于4%和3%（干重計(jì)）[12]。然而，實(shí)際上果農(nóng)和企業(yè)未能完全嚴(yán)格遵從有關(guān)要求進(jìn)行種植管理及生產(chǎn)加工，小青果的田間施藥情況、采摘時(shí)間和干燥方式難以統(tǒng)一，導(dǎo)致衢枳殼原藥材的質(zhì)量參差不齊，安全性也難以控制。

柑橘種植管理過(guò)程中需使用大量化學(xué)農(nóng)藥防治病蟲(chóng)害，易造成食品、中藥材安全與環(huán)境污染問(wèn)題，也會(huì)導(dǎo)致病蟲(chóng)害的抗藥性增強(qiáng)[13]。因此，為提高胡柚小青果的合格率，保障衢枳殼原藥材的安全性和藥理作用，需對(duì)7月份采摘的胡柚小青果及其干制品中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，若發(fā)現(xiàn)超標(biāo)原料應(yīng)調(diào)整果實(shí)下一年的用藥情況或?qū)ζ溥M(jìn)行去除。目前，鮮果去除農(nóng)殘的方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法[14]。臭氧處理因具有安全、廣譜、無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于食品、衛(wèi)生、醫(yī)藥等行業(yè)[15]。臭氧降解目標(biāo)有機(jī)物的機(jī)理包括由臭氧分子引發(fā)的直接氧化過(guò)程和由臭氧自分解產(chǎn)生的羥基自由基引發(fā)的間接氧化過(guò)程[16]。Lozowicka 等[17]使用超聲波輔助臭氧水沖洗草莓，經(jīng)1 mg/L 臭氧水處理5 min 后，四唑類(lèi)農(nóng)藥殘留降低了36.1%，毒死蜱農(nóng)藥殘留降低了75.1%。伍小紅等[18]使用不同濃度的臭氧水清洗蘋(píng)果，發(fā)現(xiàn)用初始濃度為1.17 mg/L 的臭氧水浸泡經(jīng)農(nóng)藥處理的蘋(píng)果，經(jīng)過(guò)15 min后，臭氧濃度為5.52 mg/L，對(duì)甲胺磷、敵敵畏以及久效磷的降解率分別達(dá)到86.02%、79.32%和61.30%。

為考察常山縣衢枳殼原藥材的質(zhì)量與安全狀況，對(duì)胡柚小青果的生產(chǎn)管理和采摘時(shí)間提出指導(dǎo)意見(jiàn)，課題組收集了7月上中旬采摘經(jīng)不同干燥方式加工的胡柚小青果切半干制品進(jìn)行主要功效成分（柚皮苷和新橙皮苷）、農(nóng)藥殘留和二氧化硫含量的測(cè)定，并以7月下旬采摘的胡柚小青果為原料，研究臭氧處理對(duì)其農(nóng)殘和主要功效成分的影響，以期明確胡柚小青果合理的用藥、采摘時(shí)間和干燥方式，為保障衢枳殼原料和原藥材的質(zhì)量與安全管理提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

胡柚小青果干片：分別于2020 年7月和2021 年7月兩批次收集于主產(chǎn)地常山縣的幾家采用不同干燥方式的加工企業(yè)，所用的小青果采收于管理措施相同的同一果園與地塊，采前30 d 禁止施用任何化學(xué)農(nóng)藥，采收后當(dāng)日進(jìn)行切半烘干。熱泵烘干：65 ℃左右干燥48～50 h，采摘烘干時(shí)間為7月中旬；日曬：溫度30～38 ℃日曬6～7 d，采摘干燥時(shí)間為7月中旬；熱風(fēng)干燥：采用生物質(zhì)顆粒蒸汽發(fā)生器，烘干溫度60～70 ℃，時(shí)間36 h，采摘烘干時(shí)間為7月中旬；柴火烘干：采用土灶柴火隔層加熱鼓風(fēng)烘干，溫度70～80 ℃，36～48 h，采摘烘干時(shí)間7月上旬。樣品含水量均在12%以下，達(dá)到原藥材收購(gòu)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。以上干燥樣品均在避光的干燥器中儲(chǔ)存，并在當(dāng)年的8月中旬之前完成相關(guān)數(shù)據(jù)的檢測(cè)。

胡柚小青果：于2020 年7月下旬采自常山縣太公山胡柚試驗(yàn)基地。在試驗(yàn)期間噴灑阿維菌素、苯醚甲環(huán)唑、螺螨酯、虱螨脲以及噻蟲(chóng)嗪等農(nóng)藥。具體施用情況如下：

3月中旬，融殺蚧螨200 倍液全園噴施；4月上旬，1.8%阿維菌素乳油2000 倍+80%代森錳鋅可濕粉600 倍混合噴施；5月上旬，5%氯氰菊脂1000 倍+0.3%苯醚甲環(huán)唑1000 倍+24%螨危（螺螨脂）懸浮劑3000倍混合噴施；6月中旬，5%氯氰菊脂1000 倍+80%代森錳鋅可濕粉600 倍混合噴施；7月中旬，2%阿維菌素和2%虱螨脲3000 倍+21%噻蟲(chóng)嗪2000倍+0.3%苯醚甲環(huán)唑1000 倍混合噴施。

乙腈（色譜級(jí)）、水（質(zhì)譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)）：阿拉丁試劑有限公司；柚皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%）：上海士鋒生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AZ-10G 型臭氧發(fā)生器：天長(zhǎng)市安澤電子科技有限公司；Acquity UPLCTM 型超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters 公司；THZ-98A 型全溫振蕩培養(yǎng)箱：常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；LG-01 型高速中藥粉碎機(jī)：瑞安市百信制藥機(jī)械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胡柚小青果干片農(nóng)藥殘留及SO2含量的測(cè)定

農(nóng)藥殘留：參照GB 23200.113—2018[19]和GB/T 20769—2008[20]中的方法測(cè)定。

SO2含量：依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015 版[21]中中藥飲片二氧化硫的檢測(cè)方法，采用酸蒸餾碘滴定法對(duì)不同干燥方式加工的胡柚小青果干片進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 臭氧處理對(duì)胡柚小青果農(nóng)藥殘留的影響

將樣品分為未處理組（A）和臭氧處理組（B），其中B 組胡柚小青果樣品以料液比1：15（g/mL）于0.5 mg/L 臭氧水（水溫10 ℃）中浸泡1 h，然后測(cè)定阿維菌素、苯醚甲環(huán)唑、螺螨酯、虱螨脲和噻蟲(chóng)嗪的殘留量。農(nóng)藥去除率計(jì)算公式如下：

1.2.3 胡柚小青果干片及臭氧處理前后胡柚小青果中柚皮苷和新橙皮苷含量的測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件

參照嚴(yán)曉麗等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（20：80），用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱(chēng)取柚皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg，分別溶于10 mL 無(wú)水乙醇中，然后采用倍半稀釋法將上述兩種標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL，分別對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試樣進(jìn)行超高效液相色譜檢測(cè)，記錄柚皮苷、新橙皮苷在超高效液相色譜圖中的峰面積，然后以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別擬合出柚皮苷、新橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

通過(guò)上述色譜條件對(duì)柚皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行精密度的測(cè)定，重復(fù)3 次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量均為10 μL，然后分別檢測(cè)每個(gè)樣品中柚皮苷和新橙皮苷的含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，其計(jì)算公式如下：

1.2.3.3 供試樣液的提取

取各干燥方式加工的胡柚小青果干片和臭氧處理前后的胡柚小青果熱風(fēng)干燥樣品，分別于中藥粉碎機(jī)中打碎后，稱(chēng)取樣品2 g，用20 mL 濃度為80%的乙醇溶液浸沒(méi)，并在60 ℃培養(yǎng)箱中振蕩5 h；之后用定性濾紙過(guò)濾除去混合液中的濾渣，再用80%乙醇將上清液定容至20 mL；吸取定容溶液1.0 mL，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后倒入進(jìn)樣瓶中，并保存在4 ℃冰箱中等待檢測(cè)。測(cè)試條件同標(biāo)準(zhǔn)試樣。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)2 次，每次取樣3 份進(jìn)行測(cè)定，使用Excel 2003 軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式的胡柚小青果干片中農(nóng)藥殘留及SO2 含量

由表1 可知，通過(guò)各種干燥方式得到的胡柚小青果干片中均未檢出幾種常用農(nóng)藥的殘留，表明7月中旬前胡柚樹(shù)上噴灑的農(nóng)藥會(huì)隨時(shí)間自然降解或干燥加工使得小青果干片中農(nóng)藥分解。4 種樣品中含有的SO2含量為0.016～0.026 g/kg，彼此之間不具有顯著性差異。SO2可能來(lái)自干燥過(guò)程外界的引入，如大氣、柴火煤煙等，但該含量均低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局制訂的中藥材及其飲片的二氧化硫殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（150 mg/kg）[23]。由此可見(jiàn)，7月上中旬采收的胡柚小青果加工而成的衢枳殼原藥材的安全性是可保證的。

表1 不同干燥方式的胡柚小青果干片中常用農(nóng)藥殘留量和SO2 含量檢測(cè)情況Table 1 Common pesticide residues and SO2 contents in dried Huyou immature fruits slices with different drying methods

2.2 不同干燥方式的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷的含量

選擇合適的干燥方法以保證藥材質(zhì)量是目前中藥材研究的重要內(nèi)容之一[24]。經(jīng)檢測(cè)可以得出，柚皮苷（y1）和新橙皮苷（y2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y1=67774 134x1-171433（R2=0.9996）；y2=41914 299x2+134326（R2=0.9991）。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明柚皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.015625～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)的線性擬合度良好；精密度試驗(yàn)結(jié)果表明柚皮苷和新橙皮苷的RSD 值分別為0.95%和0.97%。表明所采用的檢測(cè)方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

由表2 可知，不同干燥方式的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷含量分別為6.75%～12.04%和4.39%～10.08%。柴火烘干的胡柚小青果采收時(shí)間為7月初，其他3 種干燥方式的胡柚小青果采收時(shí)間為7月中旬。柴火烘干得到的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷含量均顯著高于其他3 種方式（P＜0.05），其原因是胡柚果實(shí)中的黃酮成分含量會(huì)隨著果實(shí)的生長(zhǎng)而下降[25]，而非干燥方式造成的。采收時(shí)間較早的小青果雖然有效成分含量高，但果實(shí)偏小，會(huì)影響原藥材的產(chǎn)量和果農(nóng)的收益，農(nóng)殘超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)升高，因此不提倡過(guò)早采收。在其他3 種干燥方式得到的胡柚小青果干片中，柚皮苷和新橙皮苷含量均以熱泵干燥的最低，其中熱風(fēng)干燥的柚皮苷和新橙皮苷含量相對(duì)最高，其與熱泵干燥時(shí)間偏長(zhǎng)或溫度偏高是否存在因果關(guān)系還有待于進(jìn)一步證實(shí)。從表2 也可以看出，幾種干燥方式的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷含量均超出《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015版）[11]中關(guān)于衢枳殼原藥材藥效成分含量的最低要求。經(jīng)比較可知，只要天氣條件允許，日曬也不失為一種胡柚小青果切片經(jīng)濟(jì)有效的干燥方法。

表2 不同干燥方式的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷含量的變化Table 2 Naringin and neohesperidin contents in dried Huyou immature fruits slices with different drying methods單位：%

2.3 臭氧處理對(duì)胡柚小青果農(nóng)藥降解及有效成分含量的影響

臭氧處理是一種綠色、高效的降解農(nóng)殘的方式，不會(huì)對(duì)處理樣品造成二次污染[26]。為避免果農(nóng)在胡柚果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中因病蟲(chóng)害可能會(huì)過(guò)量施用農(nóng)藥而造成衢枳殼原藥材中農(nóng)殘超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，本研究以7月下旬采摘的胡柚小青果為原料，通過(guò)臭氧水浸泡法處理以達(dá)到降解農(nóng)殘的目的，考察臭氧降解農(nóng)殘的有效性。結(jié)果表明：未經(jīng)臭氧處理的7月下旬采摘的胡柚小青果中僅有虱螨脲和噻蟲(chóng)嗪被檢出，含量分別為0.074 mg/kg 和0.130 mg/kg（見(jiàn)表3），均低于GB 2763—2021[27]中柑橘類(lèi)水果的相關(guān)農(nóng)藥殘留限值（虱螨脲含量≤0.5 mg/kg，噻蟲(chóng)嗪≤0.5 mg/kg）。經(jīng)臭氧水浸泡后，這兩種檢出的農(nóng)藥均有一定程度的降解。其中，虱螨脲含量降為0.06 mg/kg，降解率達(dá)18.92%；噻蟲(chóng)嗪含量降為0.1 mg/kg，降解率達(dá)23.08%。結(jié)果顯示，臭氧水浸泡處理能夠降低虱螨脲和噻蟲(chóng)嗪在胡柚小青果中的殘留量，而本研究中農(nóng)殘去除率較低的原因可能是臭氧水濃度較低。表4 數(shù)據(jù)顯示：7月下旬采摘的胡柚小青果中柚皮苷和新橙皮苷含量分別為3.67%和2.72%，已達(dá)不到衢枳殼原藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求[12]，但經(jīng)過(guò)臭氧水浸泡處理后的胡柚小青果中柚皮苷和新橙皮苷含量與未經(jīng)處理組相比并無(wú)顯著下降，說(shuō)明當(dāng)前臭氧處理?xiàng)l件并不會(huì)影響胡柚青果中有效成分的含量。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于7月上中旬采摘用于加工原藥材的小青果的質(zhì)量安全管理仍有一定的指導(dǎo)意義。

表3 臭氧處理對(duì)胡柚小青果中農(nóng)藥殘留的影響Table 3 Effect of ozone treatment on pesticide residue in Huyou immature fruits 單位：mg/kg

表4 臭氧處理對(duì)胡柚小青果中有效成分含量的影響Table 4 Effect of ozone treatment on effective components in Huyou immature fruits 單位：%

3 結(jié)論

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，7月上中旬采摘的胡柚小青果加工而成的衢枳殼原藥材無(wú)常用農(nóng)藥殘留，SO2含量遠(yuǎn)低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局制定的中藥材及其飲片的二氧化硫殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其柚皮苷和新橙皮苷含量達(dá)到《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015 年版）中關(guān)于衢枳殼原藥材藥效成分含量的要求。不同干燥方式加工的胡柚小青果干片中柚皮苷和新橙皮苷含量有所差異，兩者的含量以采用日曬和生物質(zhì)顆粒蒸汽發(fā)生器熱風(fēng)干燥兩種干燥方式相對(duì)最高，企業(yè)可視生產(chǎn)條件和加工規(guī)模采用合適的干燥方式。

臭氧處理對(duì)胡柚小青果原料中的農(nóng)藥殘留有一定的降解作用，但不同臭氧水濃度、處理時(shí)長(zhǎng)以及不同清洗方式如氯水洗、淘米水洗等對(duì)去除農(nóng)殘的效果有待于進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果也表明，嚴(yán)格掌握田間噴灑農(nóng)藥時(shí)間和控制胡柚小青果的采摘時(shí)間對(duì)于衢枳殼原藥材的質(zhì)量和安全性是可控的。