張宇帆劉菁菁曹敏劉彤彤陳雪張秀敏

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院,河北省微生物育種與保育工程實(shí)驗(yàn)室, 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071002)

活的非可培養(yǎng)(viable but non culturable,VBNC)狀態(tài)是某些細(xì)菌在惡劣環(huán)境下形成的一種休眠狀態(tài),自然界中90%以上的微生物是不可培養(yǎng)的[1],在某些特定情況下可以使這些細(xì)菌恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài),即復(fù)蘇[2].1998年,Mukamolova[3]等發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌(Micrococcusluteus)中的Rpf蛋白可以復(fù)蘇其休眠細(xì)胞.隨后,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn),rpf基因廣泛存在于高G+C含量的革蘭氏陽性菌中,并且都具有70個(gè)氨基酸左右的保守區(qū)域,即Rpf域,該結(jié)構(gòu)域是起復(fù)蘇促進(jìn)作用的重要結(jié)構(gòu)[4-5].不同物種具有不同拷貝數(shù)和不同結(jié)構(gòu)的rpf基因.目前,Rpf蛋白是第1 個(gè)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的復(fù)蘇促進(jìn)因子,其復(fù)蘇促進(jìn)作用現(xiàn)常被用在疫苗研制[6-7]、診斷檢測[8-9]和污水處理[10-13]等方面.也有研究表明,Rpf蛋白可以有效促進(jìn)放線菌在土壤中的分離和培養(yǎng),是環(huán)境放線菌資源挖掘的有效手段[14-15].

為探索不同物種Rpf蛋白的功能特性,本研究設(shè)計(jì)了rpf基因特異性引物,擴(kuò)增得到了白色放線動(dòng)孢菌(Actinokineosporaalba)DSM 45114T的3 個(gè)rpf基 因(rpf-2、rpf-E-1、rpf-E-2),構(gòu) 建 了 載 體p ET-28a(+)-rpf-2,p ET-28a(+)-rpf-E-1,p ET-28a(+)-rpf-E-2,在EscherichiacoliBL21(DE3)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),并對其編碼蛋白氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域、功能等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和預(yù)測,為后續(xù)探討白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)Rpf蛋白的功能奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株來源

白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T,E.coilDH5α、BL21(DE3),表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a(+)來源于河北省微生物育種與保育工程實(shí)驗(yàn)室,克隆質(zhì)粒p MD18-T 購自大連寶生物工程有限公司.

1.2 Rpf蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)預(yù)測

通過NCBI、Protparam[16]、Protscale[16]、Signal P[17]、SOPMA[18]、CDD[19]、SWISS-MODEL[20]、DNAMAN 等軟件對rpf-E-1、rpf-E-2、rpf-2基因進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析,具體預(yù)測項(xiàng)目與網(wǎng)址見表1.

表1生物信息學(xué)預(yù)測項(xiàng)目及網(wǎng)址Tab.1 Bioinformatics testing programs and websites

1.3 白色放線動(dòng)孢菌的復(fù)蘇及培養(yǎng)

從甘油管中活化白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T,待菌株純化后挑取單菌落接種于10 m L NA液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)48 h.待菌體長好后,12 000 r/min離心1 min,收集菌體,-20℃保藏備用.

1.4 白色放線動(dòng)孢菌基因組DNA的提取

采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取.

1.5 rpf 基因的擴(kuò)增及克隆

1.6 rpf 基因表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

提取驗(yàn)證正確的質(zhì)粒和p ET-28a(+)質(zhì)粒,使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對其進(jìn)行酶切.用T4 DNA 連接酶連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,然后涂布于LB平板(含質(zhì)量濃度為100 mg/L的卡那霉素),37℃培養(yǎng)14～16 h,隨機(jī)篩選2個(gè)菌落,分別接種于5 m L含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒DNA,酶切進(jìn)行驗(yàn)證.經(jīng)驗(yàn)證,rpf基因插入正確的陽性克隆,命名為p ET-28a(+)-rpf-2,p ET-28a(+)-rpf-E-1,p ET-28a(+)-rpf-E-2.將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜.正交實(shí)驗(yàn)條件見表2,取500μL轉(zhuǎn)接于50 m L的LB液體培養(yǎng)基中,每個(gè)條件接種2 瓶.當(dāng)OD600值達(dá)到0.8 時(shí),按照3 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)表(表2)中溫度、誘導(dǎo)劑IPTG 終濃度、時(shí)間在搖床上以160 r/min的速度誘導(dǎo).

表2 蛋白誘導(dǎo)條件的3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)Tab.2 Three factors and three levels orthogonal test table of protein induction conditions

將培養(yǎng)好的菌液倒入50 m L的離心管中,4℃下10 000 r/min離心10 min,收集菌體,用無菌去離子水重新懸浮菌體后再次離心.最后將菌體重懸于10倍體積的IMAC裂解緩沖液(含DNase 100 U/m L和尿素8 mol/L)中,使用超聲波細(xì)胞破碎儀對菌體進(jìn)行破碎.在冰上超聲處理15 min,工作5 s,間隔5 s.然后于高速冷凍離心機(jī)中4℃下10 000 r/min離心20 min,收集上清液和沉淀,置于-20℃冰箱保存.取10μL上清液和等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer,用渦旋混合器混勻,做好標(biāo)記,煮沸5 min.用SDS-PAGE 進(jìn)行檢測.電泳結(jié)束后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色30 min,之后用去離子水洗去浮色,加入脫色液,搖床脫色至條帶清晰,拍照記錄.

1.7 Rpf蛋白的復(fù)性與純化

將收集的沉淀用體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100 蛋 白 洗 滌 液 洗 滌3 次,4℃下10 000 r/min 離心20 min,重新收集沉淀.然后用含尿素的緩沖液重新懸浮沉淀,置于4℃條件下溶解過夜,為后續(xù)純化做準(zhǔn)備.使用伯樂蛋白純化試劑盒(6200239)和IMAC柱(6200241)對蛋白進(jìn)行純化.

1.8 VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

將保存于甘油管的藤黃微球菌(M.luteus)和濱海紅球菌(Rhodococcusmarinonascens)接種于NA 培養(yǎng)基中重新純化復(fù)壯,然后分別挑取單菌落接種于NA 液體培養(yǎng)基中,28℃下200 r/min搖床培養(yǎng)過夜.收集菌液4℃下6 000 r/min離心10 min后收集菌體,然后用生理鹽水重懸菌體,重復(fù)3次,最后將洗過的細(xì)胞重新接種于生理鹽水中于4℃條件下靜置培養(yǎng)至少90 d,之后取菌液涂布于平板,當(dāng)不能檢測到細(xì)菌時(shí),則認(rèn)為其已進(jìn)入VBNC狀態(tài).

1.9 Rpf對VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇的驗(yàn)證

為探討獲取的純化重組Rpf蛋白對藤黃微球菌(M.luteus)和濱海紅球菌(R.marinonascens)VBNC菌體的復(fù)蘇促生長能力,使用0.22μm 的濾膜對之前純化的重組蛋白進(jìn)行過濾,然后添加體積分?jǐn)?shù)為10%、1%、0.1%的重組Rpf蛋白至含有1%藤黃微球菌(M.luteus)或?yàn)I海紅球菌(R.marinonascens)的NA 液體培養(yǎng)基中,并以添加體積分?jǐn)?shù)為10%121℃高壓滅活15 min的重組Rpf蛋白做空白對照,不添加重組Rpf蛋白的為陰性對照組,置于Bioscreen多功能微生物生長自動(dòng)培養(yǎng)分析儀中.每組重復(fù)3次,分別在培養(yǎng)0、4、8、12、24、36、48、60、72 h時(shí)測定OD600吸光值.

2 結(jié)果

2.1 白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T r pf 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及親/疏水性分析

使用Expasy在線軟件的Protparam功能,對目的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測分析(表3).由表3可知,3個(gè)蛋白都具有親水性.不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)臨界值為40,3個(gè)蛋白的此值均小于40,所以3個(gè)蛋白都是穩(wěn)定性蛋白.用ProtScale功能對3個(gè)蛋白進(jìn)行疏水性和親水性分析(圖1).綜合整條肽鏈來看,3個(gè)蛋白分值絕大部分為負(fù)值,所以整條肽鏈表現(xiàn)為親水性,沒有明顯的疏水區(qū).因此3個(gè)蛋白均表現(xiàn)出一定的親水性,與理化分析的結(jié)果一致.

圖1 白色放線動(dòng)孢菌DSM 45114T Rpf蛋白的疏水性和親水性Fig.1 Hydrophobic and hydrophilic properties of Actinokineospora alba DSM 45114T Rpf protein

表3 氨基酸序列的理化性質(zhì)分析Tab.3 Analysis of physicochemical properties of amino acid sequences

2.2 白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T Rpf蛋白信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)

通過在線軟件Signal P-5.0的預(yù)測分析了Rpf-E-1、Rpf-E-2和Rpf-2的信號(hào)肽,結(jié)果如圖2所示,Rpf-E-1蛋白在位點(diǎn)21和22(AAA-DP)間存在信號(hào)肽;Rpf-E-2蛋白在位點(diǎn)40和41(ASA-SS)間存在信號(hào)肽;Rpf-2蛋白不存在信號(hào)肽.使用NetPhosBac 1.0程序?qū)pf蛋白的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化修飾位點(diǎn)的預(yù)測分析,結(jié)果如表4所示,3個(gè)Rpf蛋白氨基酸序列均只含有絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn).Rpf-E-1蛋白有1個(gè)絲氨酸和1個(gè)蘇氨酸共2個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn).Rpf-E-2蛋白中含有2個(gè)絲氨酸和1個(gè)蘇氨酸,共3個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn).Rpf-2蛋白中含有4個(gè)絲氨酸和2個(gè)蘇氨酸共6個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn).蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要可逆機(jī)制[21],是在蛋白質(zhì)生物合成后的一種有關(guān)活性調(diào)節(jié)的化學(xué)修飾.

圖2 白色放線動(dòng)孢菌DSM 45114 T Rpf蛋白的信號(hào)肽分析Fig.2 Signal peptide analysis of Actinokineospora alba DSM 45114 T Rpf protein

表4 蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Tab.4 Analysis of protein phosphorylation sites

2.3 白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T Rpf蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

用SOPMA 對白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T的3個(gè)Rpf 蛋白進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明,Rpf-E-1二級(jí)結(jié)構(gòu)由26.09%的α-螺旋、7.73%的β-轉(zhuǎn)角、16.91%延伸鏈和49.28%無規(guī)則卷曲構(gòu)成;Rpf-E-2二級(jí)結(jié)構(gòu)由26.39%的α-螺旋、10.65%的β-轉(zhuǎn)角、12.04%的延伸鏈和50.93%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成;Rpf-2二級(jí)結(jié)構(gòu)由24.23%的α-螺旋、9.03%的β-轉(zhuǎn)角、18.28%的延伸鏈和48.46%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成.

2.4 白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T Rpf蛋白保守結(jié)構(gòu)域組成

圖3 白色放線動(dòng)孢菌、藤黃微球菌、結(jié)核分枝桿菌Rpf結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Function domain analysis of Rpf proteins among Actinokineospora alba,Micrococcus luteus and M ycobacterium tuberculosis

2.5 Rpf蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL在線軟件對白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T的3個(gè)Rpf蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源建模(圖4),使用X 線對模板序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測:Rpf-E-1 的可信度為34.18%,分辨率為0.19 nm,覆蓋率為33%左右,與Rpf C 的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為0.38;Rpf-E-2的可信度為62.96%,分辨率為0.19 nm,覆蓋率為38%左右,與RpfC 的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為0.5;Rpf-2 的可信度為37.14%,分辨率為0.26 nm,覆蓋率為50%左右,與Rpf B的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為0.4.因Rpf類蛋白大家族中已明確三級(jí)結(jié)構(gòu)的較少,而不同物種Rpf蛋白在系統(tǒng)發(fā)育過程中又有所進(jìn)化,導(dǎo)致3個(gè)蛋白的可信度和覆蓋率并不高.

圖4 Rpf三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測模型Fig.4 Tertiary structure model of Rpf proteins

2.6 Rpf蛋白物種同源性分析

利用DNAMAN 軟件,對白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T的3個(gè)Rpf氨基酸序列與藤黃微球菌(M.luteus)Rpf、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)Rpf A-E、紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)Rpf氨基酸序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)它們均有1個(gè)由約70個(gè)氨基酸構(gòu)成的Rpf特有保守區(qū)域(圖5).Rpf-E-1與紅平紅球菌(R.erythropolis)Rpf同源性最高為22.84%,Rpf-E-2與藤黃微球菌(M.luteus)Rpf同源性最高為38.12%,Rpf-2與結(jié)合分枝桿菌(M.tuberculosis)Rpf B同源性最高為24.44%,這一結(jié)果與結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果一致.

圖5 白色放線動(dòng)孢菌、藤黃微球菌、結(jié)核分枝桿菌、紅平紅球菌Rpf氨基酸序列對比Fig.5 Alignment of Rpf amino acid sequence among Actinokineospora alba,Micrococcus luteus,Mycobacterium tuberculosis and Rhodococcus erythropolis

2.7 rpf 基因的擴(kuò)增及測序

用上述合成的3對引物,以白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T的基因組為模板,擴(kuò)增其rpf基因序列,大小均正確.使用純化試劑盒純化目的條帶,經(jīng)質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結(jié)果如圖6.由圖6可知,條帶大小正確,并將純化條帶送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序.

圖6 rpf 基因擴(kuò)增的電泳Fig.6 Electrophoretic map of rpf gene amplification

2.8 rpf 基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于p MD18-T 載體中,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選經(jīng)酶切鑒定正確的克隆p MD18-T-rpf(圖7),送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序.提取測序的質(zhì)粒p MD18-T-rpf雙酶切后回收,與用相同酶切的pET-28a(+)質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化,隨機(jī)挑選2個(gè)克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證,測序結(jié)果均正確.

圖7 p MD18-T-rpf 質(zhì)粒酶切鑒定圖譜Fig.7 Enzyme digestion map of p MD18-T-rpf plasmid

本研究克隆得到的序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號(hào)分別為Rpf-2(ON166660),G+C 的摩爾分?jǐn)?shù)為67.62%;Rpf-E-1(ON166662),G+C的摩爾分?jǐn)?shù)為72.97%;Rpf-E-2(ON166661),G+C 的摩爾分?jǐn)?shù)為70.27%.

2.9 rpf 基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

對rpf-2基因按照表2中的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(rpf-E-1、rpf-E-2未成功表達(dá),分析其原因是因?yàn)?個(gè)基因在編碼區(qū)均存在多個(gè)大腸桿菌的稀有密碼子),結(jié)果見圖8.泳道1～9分別是在正交實(shí)驗(yàn)表中的1～9號(hào)誘導(dǎo)條件下進(jìn)行的蛋白誘導(dǎo)表達(dá),泳道K 為不含質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌體.在第8個(gè)誘導(dǎo)條件下,出現(xiàn)與陰性對照有明顯區(qū)別的條帶,條帶大小52 ku左右,與預(yù)測條帶大小相近,而在其他幾個(gè)誘導(dǎo)條件下由于表達(dá)量低無法進(jìn)行正交分析,所以采用第8個(gè)條件(25℃,IPTG濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間12 h)進(jìn)行蛋白的純化.經(jīng)過蛋白的復(fù)性和純化,得到了大小為52 ku的單一條帶,純化結(jié)果如圖9.

圖8 Rpf-2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGEFig.8 SDS-PAGE of Rpf-2 protein induced expression

圖9 純化Rpf蛋白的SDS-PAGEFig.9 SDS-PAGE of purified Rpf protein

2.10 Rpf對VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇的驗(yàn)證

培養(yǎng)基中不同含量的重組Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)的藤黃微球菌(M.luteus)的復(fù)蘇作用見圖10,隨著時(shí)間的增長,添加重組Rpf蛋白的實(shí)驗(yàn)組在600 nm 下的OD 值不斷增長,并且明顯高于未添加Rpf蛋白和添加10%(體積分?jǐn)?shù),下同)滅活Rpf蛋白的對照組.當(dāng)向培養(yǎng)基中添加10%的Rpf蛋白時(shí),復(fù)蘇效果較明顯.

圖10 培養(yǎng)基中不同體積分?jǐn)?shù)的重組Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)的藤黃微球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用Fig.10 Growth-promoting activity of different volume fraction Rpf protein on VBNC state M icrococcus luteus

不同體積分?jǐn)?shù)重組Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)的濱海紅球菌(R.marinonascens)的復(fù)蘇作用見圖11,向培養(yǎng)基中添加0.1%、1%和10%的重組Rpf蛋白均能使進(jìn)入VBNC狀態(tài)的濱海紅球菌復(fù)蘇生長,未添加Rpf蛋白和添加10%滅活Rpf蛋白的對照組生長情況基本一致.當(dāng)向培養(yǎng)基中添加10%的Rpf蛋白時(shí),復(fù)蘇效果較明顯.

圖11 培養(yǎng)基中不同體積分?jǐn)?shù)的重組Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)的濱海紅球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用Fig.11 Growth-promoting activity of different volume fraction Rpf protein on VBNC state Rhodococcus marinonascens

3 討論

自發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇促進(jìn)因子以來,藤黃微球菌(M.luteus)[23-25]、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)[26-28]、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[29]與紅平紅球菌(R.erythropolis)[30]等被研究得較多[31-32],且不同細(xì)菌Rpf種類和數(shù)量有一定差異.

為探究不同放線菌Rpf蛋白的種類、數(shù)量及功能,以白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T為實(shí)驗(yàn)菌株,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)白色放線動(dòng)孢菌(A.alba)DSM 45114T中存在3個(gè)Rpf蛋白,基因所編碼的蛋白均具有Rpf樣結(jié)構(gòu)域.這3個(gè)Rpf蛋白在保有自己獨(dú)立特性的同時(shí)分別與結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、紅平紅球菌(R.erythropolis)、藤黃微球菌(M.luteus)Rpf蛋白有較高同源性.成功克隆了rpf-2、rpf-E-1、rpf-E-2基因,并在大腸桿菌中成功表達(dá)了Rpf-2蛋白.將重組Rpf-2蛋白加入到VBNC狀態(tài)的藤黃微球菌(M.luteus)和濱海紅球菌(R.marinonascens)中,發(fā)現(xiàn)重組Rpf-2蛋白的添加量在體積分?jǐn)?shù)10%時(shí)效果最好.此研究對白色放線動(dòng)孢菌Rpf蛋白的后續(xù)功能探究奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).