梁程博， 王久利， 孫 國(guó)， 馮 收， 卓平桂， 劉道鑫， 閆京艷*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院， 青海 西寧 810007；3.青海大學(xué)昆侖學(xué)院， 青海 西寧 810016)

熊蜂(Bombusspp.)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂屬(Bombus)，是一類社會(huì)性傳粉昆蟲[1]。其在維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮重要作用[2]，是眾多野生植物，尤其是高山植物和高原植物的重要傳粉者[3-6]。中國(guó)對(duì)熊蜂區(qū)系的研究起步較晚，20世紀(jì)70年代前，有關(guān)中國(guó)的熊蜂區(qū)系研究主要由西方學(xué)者進(jìn)行；20世紀(jì)70年代后，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所等單位開展了一系列科考活動(dòng)并報(bào)道了中國(guó)部分地區(qū)的熊蜂物種名錄；近20年來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所牽頭開展了中國(guó)熊蜂資源本底調(diào)查。黃家興等[7]對(duì)中國(guó)熊蜂多樣性進(jìn)行了研究，報(bào)道了125種熊蜂，占全球熊蜂資源的50%，認(rèn)為中國(guó)是熊蜂物種資源最豐富的國(guó)家；但目前，中國(guó)西部的部分地區(qū)仍缺少熊蜂多樣性研究(圖1)，其中包括重要的生態(tài)功能區(qū)——三江源地區(qū)。

圖1 中國(guó)熊蜂調(diào)查樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution sites of the bumblebees of China注：基于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所2002—2017年采集的標(biāo)本[7]Note:Based on the records of the collection of Institute of Apicultural Research of China Academy of Agricultural Science between 2002—2017

三江源地區(qū)是長(zhǎng)江、黃河和瀾滄江重要的水資源供給地[8-10]，是世界高寒生物資源庫(kù)[11]，也是我國(guó)江河中下游地區(qū)和東南亞國(guó)家生態(tài)環(huán)境安全和區(qū)域可持續(xù)發(fā)展的生態(tài)屏障[12]。因其惡劣的生態(tài)環(huán)境，當(dāng)?shù)貍鞣劾ハx種類少，尤其在高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，許多植物都嚴(yán)重依賴熊蜂授粉[2]。了解熊蜂分布情況是對(duì)其進(jìn)行保護(hù)和利用，進(jìn)而保護(hù)生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)。

本研究對(duì)三江源地區(qū)熊蜂組成情況進(jìn)行了調(diào)查與分析，為系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)該地區(qū)熊蜂組成情況和更完善地了解中國(guó)熊蜂資源提供了資料，為三江源地區(qū)傳粉昆蟲資源保護(hù)和生態(tài)平衡維持提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年至2021年每年的7月至8月，在三江源地區(qū)(北緯31°32′至36°16′，東經(jīng)89°23′至99°20′內(nèi))的瑪多縣、玉樹市、治多縣、囊謙縣、稱多縣、雜多縣和曲麻萊縣7個(gè)行政區(qū)進(jìn)行樣品采集。行政區(qū)劃分及本文所繪地圖均基于國(guó)家基礎(chǔ)地理信息中心(http://www.ngcc.cn/ngcc/)審圖號(hào)為GS(2016)2556的標(biāo)準(zhǔn)公益性地圖。在每個(gè)采樣點(diǎn)的采集范圍約1 km2，采集時(shí)間約1 h。采集時(shí)，用捕蟲網(wǎng)采集熊蜂后，將其放入礦泉水瓶中，待其死亡。將死亡的熊蜂進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)后，針插并放入標(biāo)本盒保存。共在84個(gè)樣點(diǎn)采集到1 467頭熊蜂(樣點(diǎn)分布見(jiàn)圖2)。

圖2 采樣點(diǎn)分布Fig.2 The sampling points distribution

1.2 樣品鑒定

首先，通過(guò)毛色、上顎和后足脛節(jié)等形態(tài)學(xué)鑒別特征對(duì)樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[1,13-15]，依據(jù)鑒定結(jié)果將全部樣品分亞屬、種歸類存放。而后每種選取1～3頭進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定基于16S rDNA和COI基因的序列分析。首先，視樣品體型取右后足或右側(cè)后足與中足，碾碎，用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司)提取DNA。而后，對(duì)其線粒體16S rDNA(引物：F-5′-CACCTGTTTATCAAAAAC-AT-3′； R-5′-TATAGATAGAAACCAATCTG-3′)和COⅠ(引物：F-5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA-TTGG-3′；R-5′-TAAACTTCAGGGTG-ACCAAAAAATCA-3′)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為40 μL，其中DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，10×Buffer (Mg2+) 5 μL，dNTPs混合物2.5 μL，Tap酶0.5 μL，ddH2O 29 μL。兩序列的擴(kuò)增條件除退火過(guò)程不同外(16S rDNA：59℃，40 s；COⅠ：47.9℃，40 s)，其他均相同，為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性40 s，72℃延伸45 s，72℃總延伸6 min；循環(huán)均為45次。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測(cè)，確定擴(kuò)增出目標(biāo)條帶且無(wú)雜帶后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。結(jié)合峰圖用MEGA v7進(jìn)行校對(duì)，將校對(duì)后的序列在GenBank中進(jìn)行在線BLAST。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和BLAST結(jié)果進(jìn)行最終鑒定。

1.3 物種多樣性特征分析

根據(jù)鑒定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各樣點(diǎn)和行政區(qū)的熊蜂物種組成情況。利用相對(duì)多度(Ra)、Berger-Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)、Margalef物種豐富度指數(shù)(Rs)、物種豐富度(S)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和Pielou均勻度指數(shù)(E)分析三江源地區(qū)及其中各行政區(qū)的熊蜂物種多樣性特征。利用物種相似性系數(shù)和相同物種數(shù)比較各行政區(qū)間熊蜂組成的差異情況。根據(jù)梁鋮[16]的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三江源地區(qū)熊蜂優(yōu)勢(shì)種進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為Ra≥ 10%者為優(yōu)勢(shì)種，5% ≤Ra< 10%者為豐盛種，1% ≤Ra< 5% 者為常見(jiàn)種，0.1% ≤Ra< 1%者為偶見(jiàn)種，Ra< 0.1%者為稀有種。上述多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下所示。

1)相對(duì)多度Ra

Ra=Na/N×100%

式中Na為物種a的個(gè)體數(shù)；N為所有物種的個(gè)體數(shù)。

2)Berger-Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)

D=Nmax/N

式中Nmax為優(yōu)勢(shì)種的個(gè)體數(shù)；N為全部種類的個(gè)體數(shù)。

3)Margalef物種豐富度指數(shù)(Rs)

Rs=(S-1)/lnN

式中S為物種數(shù)；N為全部物種的個(gè)體總數(shù)。

4)Shannon-Wiener指數(shù)(H′)

式中S為物種數(shù)；Pi為第i種個(gè)體占總個(gè)體數(shù)的比例。

5)Pielou物種均勻度(E)

式中S為物種數(shù)；Pi為第i種個(gè)體占總個(gè)體數(shù)的比例。

6)物種相似性系數(shù)(Cs)

式中c表示兩個(gè)生境中共有物種數(shù)；a，b表示兩個(gè)生境中分別所具有的物種數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

本研究共鑒定21種熊蜂，涉及9個(gè)亞屬(表1)。布氏熊蜂的16S和COⅠ等DNA條碼數(shù)據(jù)暫未公布；本研究中的布氏熊蜂得到了形態(tài)學(xué)鑒定支持，其雌性標(biāo)本的后足脛節(jié)不形成花粉框，生殖基節(jié)具“V”字型側(cè)龍骨突，屬擬熊蜂亞屬；加上其它形態(tài)特征[14]，可以確定樣品為布氏熊蜂。同時(shí)其16S rDNA的測(cè)序結(jié)果和同屬于擬熊蜂亞屬Psithyrus的崖熊蜂B.rupestris(NCBI登錄號(hào)DQ788099)的比對(duì)相似度最高，為96.42%，初步驗(yàn)證了形態(tài)鑒定結(jié)果。另有一個(gè)種的形態(tài)鑒定結(jié)果與已記錄熊蜂的形態(tài)特征均不同，且與GenBank中已知熊蜂參考序列的比對(duì)一致性均低于96%，本研究暫定為未知種(B.sp.SJY-2019)。根據(jù)形態(tài)特征，B.sp.SJY-2019被鑒定為屬于擬熊蜂亞屬；同時(shí)，其16S rDNA和COI分子標(biāo)記的測(cè)序結(jié)果分別和屬于擬熊蜂亞屬Psithyrus的角熊蜂B.cornutus(NCBI登錄號(hào)EF032353) 和圖氏熊蜂B.turneri(NCBI登錄號(hào)KX791753) 相似度最高，分別為95.19%和95.71%，即形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果均支持B.sp. SJY-2019屬于擬熊蜂亞屬。因本研究只獲得了少量B.sp. SJY-2019的蜂王標(biāo)本，所以未能對(duì)該種進(jìn)行明確的形態(tài)學(xué)描述。本研究中川熊蜂的鑒定得到了COI分子標(biāo)記的支持，形態(tài)特征與已記錄的川熊蜂特征僅存在少許差異；本研究中，標(biāo)本4，5腹節(jié)背面毛色均為橙色，而已有的記錄為白色(圖3)；鑒于COI分子比對(duì)中較高的序列相似度(與NCBI中KP671623序列相似度為99.36%)且其他形態(tài)特征符合，本研究將其鑒定為川熊蜂。其他熊蜂的16S rDNA鑒定、COI基因鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果均一致，即分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相互支持。

表1 三江源地區(qū)熊蜂分布情況Table 1 Bumblebees composition in Sanjiangyuan region

續(xù)表1

圖3 川熊蜂俯視圖Fig.3 Planform of B. sichuansis注：(a)為本研究標(biāo)本照片；(b)為已記錄的示意圖[1]Note:(a),the photographs of specimens in this study;(b),the recorded schematics diagram

2.2 物種多樣性特征

根據(jù)形態(tài)和分子物種鑒定結(jié)果，各采樣點(diǎn)和行政縣/市的熊蜂物種組成如表1和圖4所示，代表性采集點(diǎn)見(jiàn)表2。在分布范圍方面，克什米爾熊蜂、越熊蜂、川熊蜂、拉達(dá)克熊蜂、紅束熊蜂和穩(wěn)紋熊蜂在7個(gè)行政區(qū)均有分布，其中，克什米爾熊蜂和穩(wěn)紋熊蜂均為三江源地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種(相對(duì)多度Ra≥ 10%)，越熊蜂、川熊蜂、拉達(dá)克熊蜂和紅束熊蜂均為豐盛種(5% ≤Ra< 10%)。偽猛熊蜂也是豐盛種，但在囊謙未見(jiàn)其分布。蘇氏熊蜂、布氏熊蜂、黑尾熊蜂、B.tibeticus和盜熊蜂為常見(jiàn)種(1% ≤Ra< 5%)，分別在3～6個(gè)行政區(qū)有分布。密林熊蜂、弗里熊蜂、斯科熊蜂、B. sp. SJY-2019、西伯熊蜂、猛熊蜂和興熊蜂為偶見(jiàn)種(0.1% ≤Ra< 1%)，分別分布于1～4個(gè)行政區(qū)。凸污熊蜂和亞洲熊蜂均為稀有種(Ra< 0.1%)，均只有1個(gè)樣品被采集。一些種在三江源地區(qū)具較小的相對(duì)多度，但卻分布在較大的地理范圍內(nèi)分布，如黑尾熊蜂的相對(duì)多度為1.5%，多于斯科熊蜂(Ra=0.34%)，但前者僅在治多縣、稱多縣和玉樹市3個(gè)行政區(qū)被發(fā)現(xiàn)，而后者在曲麻萊縣、玉樹市、雜多縣和位于三江源地區(qū)最南部的囊謙縣4個(gè)行政區(qū)均有分布。

圖4 各采樣點(diǎn)的熊蜂物種組成Fig.4 Bumblebees composition at each locality注：圖中各位點(diǎn)柱形長(zhǎng)度與該位點(diǎn)采集熊蜂數(shù)成正比Note:The column length of each locality in the figure is proportional to the number of bumblebees collected at the locality

表2 代表性采集點(diǎn)Table 2 The representative collection localities

在7個(gè)行政區(qū)中，稱多縣的物種多樣性最高，其物種數(shù)、多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均高于其他行政區(qū)(表3)。曲麻萊縣的物種多樣性最低，物種數(shù)、個(gè)體數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均低于其他行政區(qū)。在治多縣記錄到的個(gè)體數(shù)最多，但其豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)最低，而優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最高；這是因?yàn)樵摰貐^(qū)克什米爾熊蜂和穩(wěn)紋熊蜂的數(shù)量多，其他物種數(shù)量少?？耸裁谞栃芊浜头€(wěn)紋熊蜂是三江源地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種(相對(duì)多度Ra≥ 10%)，二者約四分之一的個(gè)體在治多縣被采集。

表3 各行政區(qū)熊蜂物種多樣性特征Table 3 Species diversity characteristic of bumblebees in each administrative region

物種相似度分析結(jié)果表明(表4)，雜多縣和玉樹市物種相似度系數(shù)最高(0.857 1)，兩地區(qū)有12個(gè)共有種；治多縣與囊謙縣的物種相似度最低(0.368 4)，兩地區(qū)僅7個(gè)共有種。在三江源地區(qū)內(nèi)，地理距離較小的地區(qū)間可能具有較大的物種相似性，如稱多縣和曲麻萊縣相鄰，二者的物種相似性系數(shù)為0.388 9，共有種7個(gè)；而稱多縣和雜多縣被其他行政區(qū)相隔，二者的物種相似性系數(shù)為0.555 6，共有種10個(gè)。

表4 各行政區(qū)間相同物種數(shù)和相似性系數(shù)Table 4 Number of the shared species and the similarity coefficient among administrative regions

3 討論

3.1 三江源地區(qū)熊蜂組成

本研究在三江源地區(qū)共發(fā)現(xiàn)隸屬于9個(gè)亞屬的20種已知種和1種未知種，其中布氏熊蜂、斯科熊蜂和B. sp. SJY-2019為寄生性熊蜂，其它18種為社會(huì)性熊蜂。20種已知種中，有越熊蜂、凸污熊蜂、川熊蜂和B.tibeticus4種中國(guó)特有種[7]，有穩(wěn)紋熊蜂、凸污熊蜂、偽猛熊蜂、越熊蜂、興熊蜂、克什米爾熊蜂、拉達(dá)克熊蜂、紅束熊蜂、斯科熊蜂和B.tibeticus10種青藏高原特有種[14-15]。

根據(jù)Williams等[14-15,17-19]、王保海等[20]、安建東等[13]和黃家興[1]的研究，青藏高原已記錄隸屬于11個(gè)亞屬的87種熊蜂，其中社會(huì)性熊蜂和寄生性熊蜂分別有79種和9種。三江源地區(qū)熊蜂物種數(shù)、社會(huì)性熊蜂物種數(shù)和寄生性熊蜂物種數(shù)均超過(guò)整個(gè)青藏高原的20%。本研究記錄的熊蜂，除未知種B.sp. SJY-2019外，其他種均已在青海有所記錄。與王保海等[20]的研究相比，本研究在雜多縣、囊謙縣、稱多縣和瑪多縣，新記錄到布氏熊蜂、盜熊蜂、弗里熊蜂、興熊蜂、克什米爾熊蜂、西伯熊蜂、斯科熊蜂、黑尾熊蜂、蘇氏熊蜂、B.tibeticus和川熊蜂。

利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定雌性熊蜂時(shí)，需通過(guò)毛色特征對(duì)同亞屬的不同種進(jìn)行區(qū)分。但此方法有時(shí)并不準(zhǔn)確[1]。部分熊蜂存在體色多態(tài)性[21]，如本研究采集到的川熊蜂標(biāo)本均與已記錄的川熊蜂存在毛色上的差異。同時(shí)，不同種熊蜂的毛色可能存在趨同，如B.sp. SJY-2019在毛色上與西藏熊蜂幾乎相同，這對(duì)熊蜂形態(tài)學(xué)鑒定和新種的發(fā)現(xiàn)造成了困難。進(jìn)年來(lái)，幾何形態(tài)學(xué)在昆蟲分類上的應(yīng)用得到了發(fā)展[22]，如Kozmus等[23]通過(guò)翅的結(jié)構(gòu)對(duì)19種熊蜂進(jìn)行了幾何形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定準(zhǔn)確度達(dá)到97%。尋找更多可用于幾何形態(tài)學(xué)鑒定的形態(tài)特征或許有利于更準(zhǔn)確地進(jìn)行熊蜂形態(tài)學(xué)分類。

3.2 三江源地區(qū)熊蜂物種多樣性水平

在多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和物種豐富度方面，三江源地區(qū)略低于青藏高原其它地區(qū)和青藏高原毗鄰區(qū)。如位于青藏高原東部向黃土高原過(guò)度地帶的甘肅省，其Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為3.03，Pielou均勻度指數(shù)為0.76，物種豐富度為56；位于青藏高原東側(cè)的青海省東部地區(qū)，其Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)和物種豐富度分別為2.67，0.85和23.00[2]。這兩個(gè)地區(qū)的三個(gè)指標(biāo)均高于三江源地區(qū)(Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為2.15,Pielou均勻度指數(shù)為0.71,物種豐富度為21)。這可能因?yàn)榍嗖馗咴螯S土高原、秦嶺山地和四川盆地過(guò)渡的地帶是世界熊蜂多樣性中心，上述兩地區(qū)比三江源地區(qū)更接近多樣性中心[7]。而同其它高寒地區(qū)相比，三江源地區(qū)熊蜂多樣性處于較高水平，如Rasmont等[24]在庇里牛斯山脈的高寒地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)7種社會(huì)性熊蜂，而本研究記錄到18種社會(huì)性昆蟲。從亞屬水平上看，三江源地區(qū)有9個(gè)亞屬，與中國(guó)其他地區(qū)相比具有較高的多樣性水平，如安建東等[13]通過(guò)對(duì)華北和西北部分地區(qū)熊蜂資源的研究發(fā)現(xiàn)，京津冀地區(qū)、山西省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)均只有8個(gè)亞屬，梁鋮等[16]在對(duì)云南熊蜂資源的調(diào)查中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)亞屬，王哲哲[25]在對(duì)貴州熊蜂資源的研究中也只發(fā)現(xiàn)8個(gè)亞屬。與青藏高原其它地區(qū)相比，三江源地區(qū)的熊蜂組成情況存在較大不同。在王磊等[2]對(duì)青海省東部地區(qū)熊蜂多樣性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，黑尾熊蜂、紅束熊蜂、克什米爾熊蜂和亞洲熊蜂均為優(yōu)勢(shì)種(相對(duì)豐度Ra≥10%)，穩(wěn)紋熊蜂為豐盛種(5%≤Ra<10%)；而三江源地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種為克什米爾熊蜂和穩(wěn)紋熊蜂，紅束熊蜂、黑尾熊蜂和亞洲熊蜂分別為豐盛種、常見(jiàn)種(1%≤Ra<5%)和稀有種(Ra<0.1%)；在青海省東部地區(qū)相對(duì)豐度不足1%的越熊蜂和拉達(dá)克熊蜂是三江源地區(qū)的豐盛種。這種差異的出現(xiàn)可能與三江源地區(qū)的高海拔環(huán)境有關(guān)，高海拔環(huán)境可能更適合克什米爾熊蜂和穩(wěn)紋熊蜂等高原特有種，較不利于其他種棲息。本研究發(fā)現(xiàn)，一些熊蜂在三江源地區(qū)具有較高的相對(duì)豐度，但其分布范圍卻較小，一些地理距離較近的地區(qū)卻具備較低的物種相似性。這種空間組成差異應(yīng)與環(huán)境差異有關(guān)。Williams等[17]發(fā)現(xiàn)，光照和降水等氣候因素與青藏高原不同地區(qū)熊蜂組成差異有關(guān)；但氣候、地理和土壤等因素對(duì)熊蜂空間組成差異的相對(duì)重要性有待被揭示。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)野外樣品采集、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，系統(tǒng)地調(diào)查并分析了三江源地區(qū)熊蜂組成情況。共有隸屬于9個(gè)亞屬的21種熊蜂被發(fā)現(xiàn)，其中包括一未知種B.sp. SJY-2019。三江源地區(qū)物種多樣性水平略低于周邊地區(qū)，但高于其他高寒地區(qū)；該地區(qū)與周邊地區(qū)的熊蜂組成差異大，而空間組成差異在三江源地區(qū)內(nèi)的不同區(qū)域間也比較明顯。