夏宏燕，陳雪六，謝 康

（1.廣東工業(yè)大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，廣州 510006；2.廣東工業(yè)大學(xué) 省部共建精密電子制造技術(shù)與裝備國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

在人們的日常工作或生活中，突發(fā)的疾病或意外可能會(huì)導(dǎo)致人體器官衰竭或部分組織功能缺損，這通常會(huì)降低人們的生活質(zhì)量甚至嚴(yán)重影響人們的生命健康[1-2]。組織工程的快速發(fā)展為組織器官功能修復(fù)提供了新的思路[3]。組織工程支架作為組織工程的重要基礎(chǔ)之一，不僅從結(jié)構(gòu)和成分上模擬目標(biāo)組織的細(xì)胞外基質(zhì)的功能和特點(diǎn)，為種子細(xì)胞的移植黏附提供一個(gè)臨時(shí)基質(zhì)，并將細(xì)胞順利地運(yùn)送到人體內(nèi)部特定的部位，還能引導(dǎo)組織再生，控制組織的結(jié)構(gòu)、形貌、尺寸及釋放活性因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞的表達(dá)[4-5]。

靜電紡絲技術(shù)制備的纖維膜不僅具有較大的比表面積[6]，適合細(xì)胞伸展，而且還具有多孔結(jié)構(gòu)和高孔隙率，方便細(xì)胞遷移、長(zhǎng)入及物質(zhì)的輸送和交換[7]。除此以外，靜電紡絲纖維膜還具有可調(diào)的表面性質(zhì)和可控的物理結(jié)構(gòu)，可以模擬不同結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)[8-9]。特別是三維多孔材料有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在其中運(yùn)輸傳遞，因此，本研究通過(guò)制備多孔PLA/CA纖維膜，探究多孔結(jié)構(gòu)對(duì)于組織工程支架的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

聚乳酸（PLA，Mw=1.0×105），山東醫(yī)療器械有限公司；醋酸纖維素（CA，Mn=3×104），瑪雅試劑；二氯甲烷（DCM，分析純），光華科技；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純），天津市致遠(yuǎn)；丙酮（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；N，N-二甲基乙酰胺（DMAC，分析純），聚-D-賴氨酸（PDL），上海麥克林；胎牛血清、馬血清、DMEM培養(yǎng)液、HBSS緩沖液、胰蛋白酶，美國(guó)Gibco；二甲基亞砜（DMSO，分析純），西格瑪；MTT，北京索萊寶科技有限公司；靜電紡絲機(jī)（QZNT-E01），佛山輕子精密測(cè)控技術(shù)有限公司；聚焦離子束場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（LYRA 3 XMU），捷克Tescan；X射線光電子能譜（Escalab 250Xi），英國(guó)Thermo Fisher；酶標(biāo)儀（Thermo 3001），美國(guó)Thermo。

1.2 PLA/CA纖維膜的制備

稱量0.5 g PLA與0.5 g CA加入7 g DCM與3 g DMF的混合溶液，攪拌2 h后得到無(wú)孔PLA/CA纖維紡絲液。稱量0.5 g PLA與0.5 g CA加入8 mL DCM與2 mL丙酮的混合溶液，攪拌2 h后得到多孔PLA/CA纖維紡絲液。采用10 mL注射器吸取紡絲液，設(shè)置針頭與接收器的距離為15 cm，工作電壓25 kV，溶液推出速度為4 mL/h，滾筒轉(zhuǎn)速為300 r/min。常溫常濕條件下開(kāi)始紡絲，將制好的纖維膜放入50℃真空干燥機(jī)干燥12 h，然后常溫備用。

1.3 纖維膜的改性

向HBSS緩沖液中加入PDL溶液，配制出質(zhì)量濃度為40μg/mL的改性PDL溶液，放在水浴鍋中備用。將制備的2種PLA/CA纖維膜放置在紫外光照射1 h，然后將2種PLA/CA纖維膜完全浸泡在改性苯丙氨酸解氨酶（PAL）溶液中，室溫條件下放置在搖床上以200 r/min的頻率搖勻2 h。纖維支架改性完成后取出得到PLA/CA+PDL纖維膜，用HBSS緩沖液將其沖洗3次，以此除去改性支架中為附著的PDL分子。清洗后再次使用紫外燈對(duì)纖維支架照射1 h，然后待用。

1.4 纖維膜的表征

1.4.1 SEM

無(wú)孔PLA/CA與多孔PLA/CA纖維膜經(jīng)過(guò)離子濺射鍍膜儀噴金后，使用聚焦離子束場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)纖維膜的形貌以及表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.4.2 XPS

使用X射線光電子能譜對(duì)多孔PLA/CA纖維膜和多孔PLA/CA+PDL纖維膜進(jìn)行掃描，分析纖維膜表面元素。

1.4.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

將備用的無(wú)孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜消毒后放置于96孔板，然后把含量為5×106/9.6cm2的PC12細(xì)胞分別接種在裝有纖維膜的96孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照組。將96孔板置入培養(yǎng)箱內(nèi)，經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后換上新的培養(yǎng)基并加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄去上清液，加入DMSO溶解20 min，將各孔液體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

1.5 纖維膜的細(xì)胞增殖能力測(cè)定

將含量為5×106/9.6 cm2的PC12細(xì)胞分別接種在內(nèi)置無(wú)孔PLA/CA、多孔PLA/CA及其改性后的纖維膜，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液，然后加入DMSO溶解紫色晶體，在570 nm處測(cè)定各孔OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 形貌觀察

掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從SEM電鏡圖中可以看到，以DCM/DMF體系的紡絲溶液所制備的靜電紡絲纖維呈現(xiàn)為一種光滑、平整且無(wú)孔狀結(jié)構(gòu)。而采用DCM/丙酮為溶劑時(shí)所制備的PLA/CA靜電紡絲纖維則為均勻多孔結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)椴捎肈CM/DMF為溶劑時(shí)，混合聚合物中CA中的低乙?；〈糠植荒鼙换旌先芤和耆芙猓宰罱K得到是無(wú)孔的PLA/CA纖維。丙酮作為CA的良好溶劑，在DCM溶液中加入一定比例的丙酮溶液能夠?qū)LA/CA二者的混合物完全溶解。DCM溶液的沸點(diǎn)為40℃，并且丙酮溶液的沸點(diǎn)為56℃左右，兩者的沸點(diǎn)都相對(duì)較低，但是DMF溶液的沸點(diǎn)卻是152℃左右。根據(jù)熱致相分離原理，靜電紡絲的過(guò)程中，由于DCM/DMF溶劑體系沸點(diǎn)較高，帶電射流在拉伸變細(xì)時(shí)，溶劑的揮發(fā)速率較慢，不能形成有效的熱致相分離效應(yīng)，因此最終只能形成無(wú)孔狀結(jié)構(gòu)的靜電紡絲納米纖維。但是DCM/丙酮體系的沸點(diǎn)就要比DCM/DMF體系的沸點(diǎn)低得多，所以DCM溶液能夠快速揮發(fā)，使得纖維在成形過(guò)程中溫度迅速降低，形成熱致相分離。發(fā)生熱致相分離后，紡絲溶液中的溶質(zhì)富集相形成了納米纖維的基本骨架，而溶劑的富集相則是形成了孔。因此，采用DCM/丙酮體系能夠制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的PLA/CA納米纖維。

圖1 不同溶劑體系下纖維形貌

2.2 表面元素分析

對(duì)多孔PLA/CA+PDL纖維膜進(jìn)行XPS能譜測(cè)試，分析經(jīng)賴氨酸改性后多孔PLA/CA纖維膜的表面元素，結(jié)果如圖2所示。圖2（a）為多孔PLA/CA改性前后的XPS全譜，從圖2（a）中可以看出，未改性的纖維膜中只有C和O元素，而改性后的纖維膜中出現(xiàn)了C、O和N元素，這說(shuō)明賴氨酸中的氨基改性成功。

從圖2（b）可以看出，C1s光譜中出現(xiàn)了3種C元素的結(jié)合態(tài)，分別為284.8 eV處的C—C、286.65 eV處的C—O—C和288.98 eV處的O—C=O。圖2（c）的O1s光譜則是在531.85 eV和533.01 eV處分別出現(xiàn)C—O和C==O的結(jié)合態(tài)。此外，在圖2（d）的N1s光譜400.13 eV處出現(xiàn)了屬于C—N的結(jié)合態(tài)。這也說(shuō)明了PDL對(duì)于多孔PLA/CA纖維膜改性的成功。

圖2 多孔PLA/CA+PDL纖維膜的XPS光譜圖

2.3 纖維膜細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用MTT法對(duì)無(wú)孔PLA/CA膜和多孔PLA/CA膜進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。無(wú)論是無(wú)孔纖維膜還是多孔纖維膜的OD值均大于空白對(duì)照組的OD值。這說(shuō)明接種在組織工程支架上的活細(xì)胞數(shù)量比接種在孔板中更多，也就是說(shuō)PC12細(xì)胞在這2種纖維支架上都能獲得增殖。這一結(jié)果表明這2種纖維膜不具有細(xì)胞毒性，可以作為組織支架在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)使用。

圖3 不同纖維細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

2.4 纖維膜的細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，無(wú)孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果是相似的。經(jīng)過(guò)改性的纖維膜OD值均高于未改性纖維膜的OD值，說(shuō)明PDL能有效修飾纖維膜的表面，提高纖維膜的黏附能力，從而增強(qiáng)細(xì)胞在纖維膜上的生長(zhǎng)增殖能力。具有微孔結(jié)構(gòu)的纖維膜的OD值大于無(wú)孔纖維的OD值。也就是說(shuō)改性后的微孔纖維膜促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力遠(yuǎn)大于改性后的無(wú)孔纖維膜。這可能是因?yàn)槎嗫桌w維內(nèi)部的孔為相互貫穿的連通孔，而這種孔結(jié)構(gòu)能更大程度上吸收PDL，使得改性更加徹底，也有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在其中運(yùn)輸傳遞，進(jìn)一步提高纖維膜對(duì)細(xì)胞的促增殖作用。更說(shuō)明經(jīng)過(guò)改性的具有微孔結(jié)構(gòu)的PLA/CA纖維膜適合作為生物組織支架。

圖4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，以PLA和CA為溶質(zhì)，DCM和丙酮為溶劑，在常溫常濕條件下制備了多孔納米纖維膜。SEM圖像證實(shí)了纖維膜表面存在相互貫穿的連通孔。XPS分析結(jié)果顯示，PDL的改性對(duì)PLA/CA纖維膜進(jìn)行了氮摻雜，有利于細(xì)胞黏附。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)孔PLA/CA纖維膜與多孔PLA/CA纖維膜在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面沒(méi)有顯著差異，但是多孔PLA/CA纖維膜對(duì)于表面修飾材料的吸收能力更加突出，經(jīng)過(guò)PDL改性過(guò)后的多孔PLA/CA纖維膜上細(xì)胞增殖水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于無(wú)孔PLA/CA+PDL纖維膜。因此，多孔PLA/CA纖維膜更適合作為組織工程支架。