張 江，馬晶晶，高俊鋒，韓相敏，吳漢宇，李凱亮，奉中花，賴 志

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 松江 201699 ； 2. 上海創(chuàng)宏生物科技有限公司，上海 松江 201619)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)，所有日齡的豬均易感，其中哺乳仔豬最易感，1周齡以內(nèi)的仔豬感染后臨床表現(xiàn)為嘔吐和水樣腹瀉，3～4 d后因脫水而死，病死率平均可達(dá)50%，嚴(yán)重者接近100%，日齡較大的豬通常表現(xiàn)為一過性的水樣腹瀉，持續(xù)1周后可自行康復(fù)，母豬臨床也有僅表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、乳汁減少和厭食的情況[1-2]。

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為帶囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為28 000 bp。其中編碼的S結(jié)構(gòu)蛋白可以識別并結(jié)合宿主細(xì)胞受體，是產(chǎn)生中和抗體的主要靶標(biāo)蛋白，與病毒入侵宿主細(xì)胞和毒力相關(guān)[3]。S蛋白是由S1(1～730 aa)亞基和 S2亞基(731～1 383 aa)共1 383個(gè)氨基酸組成，其中S1亞基與受體的結(jié)合有關(guān)，也是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要區(qū)域。PEDVS基因是PEDV重要的毒力基因，不同毒株之間S1基因高度易變，表現(xiàn)為堿基突變、插入或缺失，其遺傳變異性可造成PEDV毒力的改變[4-5]，所以PEDV變異毒株和經(jīng)典毒株的變異主要集中在S1區(qū)域，根據(jù)PEDVS1基因遺傳進(jìn)化樹比對分析可將PEDV分為GⅠ和GⅡ兩大分支，GⅠ分支主要由經(jīng)典株G1和S-INDEL毒株組成，GⅡ分支主要由中國流行變異株G2b及美國、加拿大毒株G2a組成，可以通過對S1基因的鑒別診斷和測序分析判斷PEDV屬于經(jīng)典株還是流行變異株，因此臨床多以PEDVS1區(qū)域比對特征作為疫苗選擇的理論依據(jù)[6]。

雖然國內(nèi)發(fā)病豬場已經(jīng)進(jìn)行了PED疫苗的免疫，但PED仍持續(xù)發(fā)生且危害嚴(yán)重，說明現(xiàn)階段僅通過使用疫苗還無法保證豬場的持續(xù)穩(wěn)定，疫苗毒株對不斷變異的新流行PEDV毒株存在保護(hù)力不足的情況[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室于2021年7月在江蘇某豬場因腹瀉死亡的哺乳仔豬群的腸道中分離鑒定出2株P(guān)EDV，并對其S1基因進(jìn)行了擴(kuò)增和序列分析，希望獲得流行毒株P(guān)EDV分子變異趨勢，為進(jìn)一步鑒別PEDV疫苗株和野毒株提供理論依據(jù)，為豐富PEDV的分子流行病學(xué)和疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 Vero細(xì)胞，購自上海創(chuàng)宏生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液，購自蘇州旭太生物工程有限公司，貨號：22001；胰蛋白酶，購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：A003702；RT-PCR一步法檢測試劑，購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，貨號：AH411；核酸提取試劑盒(吸附柱法)，購自龍闊(蘇州)生物工程有限公司，貨號：SJH9-2；豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自龍闊(蘇州)生物工程有限公司，貨號：SJH60。

1.2 主要儀器 Autopure32A核酸提取儀，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；FQA-48熒光定量PCR儀，杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品；JX-FSTPRP全自動(dòng)樣品組織研磨儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；37XC型光學(xué)顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 15頭3日齡健康哺乳仔豬，經(jīng)豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測結(jié)果為PEDV陰性，購自廣州市某豬場。

1.4 病料處理 從江蘇省2個(gè)豬場疑似PEDV發(fā)病死亡的仔豬中分別無菌操作各采集1份腸組織，使用組織研磨儀研磨，用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行5倍稀釋制成懸液，-70 ℃反復(fù)凍融3次。6 000 r/min離心20 min，分別各取5 mL上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，加入適量雙抗，-70 ℃保存作為接種材料。

1.5 病毒分離 將1.4中處理的2個(gè)樣品各1 mL接種液分別接種于已長成單層的Vero細(xì)胞(10 mL培養(yǎng)液)，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，然后倒掉接毒液，新加入含4 μg胰酶的DMEM培養(yǎng)液10 mL，另設(shè)1瓶正常細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)72 h，盲傳3代，觀察有細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)的繼續(xù)傳代，直至穩(wěn)定。顯微鏡觀察接毒細(xì)胞CPE情況。

1.6 病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定 分別將病毒分離液使用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行鑒定，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 病毒含量測定 按《中華人民共和國獸藥典》附錄3402中病毒半數(shù)致死感染量測定法(Reed-Muench法)測定所分離病毒在Vero細(xì)胞上的病毒含量。

1.8 PEDVS1基因檢測和分析 取在Vero細(xì)胞適應(yīng)的病毒液，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法擴(kuò)增PEDVS1基因進(jìn)行鑒別診斷和測序分析。

1.8.1 引物合成 利用PEDVS1基因段鑒別引物[9]對分離毒株進(jìn)行鑒別診斷，獲得的擴(kuò)增片段大小為726 bp時(shí)鑒定為PEDV流行變異毒株，擴(kuò)增片段大小為581 bp時(shí)鑒定為PEDV經(jīng)典毒株，引物由安徽通用生物工程有限公司合成，信息見表1。

表1 PEDV S1基因鑒別引物

1.8.2 病毒RNA提取及RT-PCR檢測 使用核酸提取試劑盒提取PEDV RNA，利用表1合成的引物，使用RT-PCR檢測試劑擴(kuò)增PEDVS1基因。RT-PCR反應(yīng)總體積20 μL：RNA模板2 μL，2×One-step Reaction Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。RT-PCR反應(yīng)程序：50 ℃ 20 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.3S1基因的克隆與序列分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與pUC57克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液經(jīng)PCR鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。在NCBI網(wǎng)站上挑選并下載GenBank中不同年份的PEDV參考毒株，利用DNASTAR、MEGA生物信息軟件對分離株測得的S1基因序列與參考毒株S1基因序列進(jìn)行比對分析并繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.9 動(dòng)物毒力試驗(yàn) 將試驗(yàn)仔豬隨機(jī)分為3個(gè)組，A組、B組和C組，每組5頭。其中A組為對照組，B組和C組為攻毒組，每頭分別灌服接種分離培養(yǎng)的病毒液(107.0TCID50/mL)2 mL，攻毒后觀察仔豬臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將經(jīng)過除菌處理的腸組織懸液上清液接種于Vero細(xì)胞，傳至第5代，穩(wěn)定在24 h時(shí)開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)形成空泡，變圓皺縮；在36 h時(shí)細(xì)胞間出現(xiàn)拉絲，間隙增大；48 h時(shí)細(xì)胞呈梭形，脫落細(xì)胞達(dá)到60%，表現(xiàn)為典型細(xì)胞病變，正常對照細(xì)胞沒有病變(圖1)。

圖1 Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變 (200×)

2.2 病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定 使用豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒鑒定，2份病毒分離液樣品均為豬流行性腹瀉病毒陽性，Ct值分別為15.14和13.86，傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒均為陰性。將獲得的2株分離株分別命名為DJCY和DJYJ。

2.3 病毒含量測定 按Reed-Muench法測定所分離的DJCY和DJYJ病毒含量分別為107.80TCID50/mL和108.16TCID50/mL。

2.4 PEDVS1基因檢測與分析

2.4.1 PEDVS1基因RT-PCR檢測 對出現(xiàn)病變的細(xì)胞接毒液使用PEDVS1基因鑒別診斷引物進(jìn)行RT-PCR檢測，出現(xiàn)720 bp左右的目的條帶(圖2)。

圖2 分離株S1 基因的RT-PCR鑒別

2.4.2 PEDVS1基因序列分析 將2株分離株S1基因測序結(jié)果與PEDV典型毒株S1基因核苷酸序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，DJCY分離株和DJYJ分離株的同源性為99.7%，與經(jīng)典毒株(ZL29-2015、OH851、DR13、JS2008、CV777、SD-M)的同源性為85.9%～87.5%，與流行變異毒株(MN、AJ1102、CH-JX-JA、JSCZ1601等)的同源性為97.1%～99.2%(圖3)。DJCY分離株和DJYJ分離株在S1基因片段內(nèi)相對于經(jīng)典株分別有1個(gè)氨基酸(3個(gè)堿基)的插入和2個(gè)氨基酸(6個(gè)堿基)的缺失(圖4)，屬于PEDV變異株GⅡ分支G2b型(圖5)。

圖4 利用DNASTAR軟件對流行毒株S1基因與參考毒株S1基因序列部分片段的比較分析

2.5 動(dòng)物毒力試驗(yàn) B組和C組攻毒24 h后仔豬全部出現(xiàn)腹瀉，發(fā)病率均為100%；攻毒后7 d內(nèi)B組死亡4頭，死亡率為80%；C組死亡5頭，死亡率為100%；對死亡仔豬進(jìn)行剖檢，小腸腸壁變薄充血、脹氣，內(nèi)有黃色水樣糞便和未消化凝乳塊(圖6)，表明DJCY和DJYJ兩毒株毒力較強(qiáng)，可作為疫苗檢驗(yàn)用強(qiáng)毒。

圖6 PEDV感染仔豬的臨床剖檢

3 討論

本試驗(yàn)所得2株病毒分別分離于江蘇2個(gè)豬場，均可接種Vero細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定為豬流行性腹瀉病毒，用所分離的病毒接種哺乳仔豬均出現(xiàn)典型的豬流行性腹瀉癥狀，體外和體內(nèi)試驗(yàn)都證實(shí)分離毒株均為豬流行性腹瀉病毒毒株。

豬流行性腹瀉病毒DJCY分離株和DJYJ分離株在Vero細(xì)胞上測得的TCID50分別為107.80/mL和108.16/mL，將2個(gè)分離株稀釋為107.0TCID50/mL，分別接種5只哺乳仔豬均出現(xiàn)典型的豬流行性腹瀉癥狀，發(fā)病率均為100%，死亡率分別為80%(4/5)和100%(5/5)，發(fā)病仔豬的腸道均表現(xiàn)為小腸腸壁變薄、充血等病變。說明分離到的豬流行性腹瀉病毒野毒株毒力較強(qiáng)。

本試驗(yàn)分析了江蘇省2個(gè)豬場2021年7月引起仔豬腹瀉的主要病毒性病原的感染情況，檢測表明當(dāng)前引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原依然是PEDV，這可能與PEDV為RNA病毒，本身變異風(fēng)險(xiǎn)較大有關(guān)，因此本試驗(yàn)基于PEDV分離株的高變區(qū)S1基因片段進(jìn)行了遺傳進(jìn)化樹和同源性的相關(guān)分析，確定當(dāng)前江蘇省PEDV流行株均屬于變異毒株。氨基酸序列分析顯示，與經(jīng)典株相比，變異毒株具有特征性的氨基酸插入和缺失。PEDV弱毒疫苗株，在S1基因片段內(nèi)相對于常見PEDV毒株有4個(gè)氨基酸(12個(gè)堿基)的插入；經(jīng)典株相對于變異株分別有1個(gè)氨基酸(3個(gè)堿基)的缺失和2個(gè)氨基酸(6個(gè)堿基)的插入，可以此為依據(jù)區(qū)分疫苗株和變異株[10-12]。

目前國內(nèi)秋冬季節(jié)PEDV仍然高發(fā)，糞口傳播是主要的傳播方式，此外還有乳汁傳播、垂直傳播和空氣傳播，同時(shí)場內(nèi)的飼養(yǎng)管理也應(yīng)得到重視，用具和車輛合理科學(xué)的消毒管理、欄舍的干燥溫度控制以及員工定員定崗是預(yù)防此病必須做到的基礎(chǔ)工作。