周永輝，王 爽，崔文強，屈謙偉，羅 佳，楊奕櫻

(1. 貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025 ； 2. 貴州中醫(yī)藥大學 貴州省法醫(yī)中藥毒理學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025 ； 3. 中國科學院深圳先進技術研究院，廣州 深圳 518055 ；4. 東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030 ； 5.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

奶牛乳房炎是導致奶牛淘汰的重要疾病之一，其致病菌主要有金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸埃希菌等[1-2]。近些年，隨著抗生素的不合理使用導致細菌耐藥等問題頻發(fā)。有學者發(fā)現(xiàn)，木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)等凝固酶陰性葡萄球菌在奶牛乳房炎病例中的分離率呈逐年上升趨勢，其不僅容易產(chǎn)生耐藥性并且易攜帶耐藥基因，已成為引起奶牛乳房炎發(fā)病的新特點[2-3]。木糖葡萄球菌是一種動物皮膚和黏膜的共生菌種，因此常存在于動物源性食物如奶類、奶類制品和發(fā)酵肉類制品中[4]。當木糖葡萄球菌形成生物被膜(Biofilm，BF)后，會使其逃避宿主免疫，產(chǎn)生極強的耐藥性[5]，導致奶牛乳房炎久治不愈，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[6]。因此，對木糖葡萄球菌生物被膜調(diào)控機制進行研究，尋找和研發(fā)新的干預生物被膜形成的藥物或作用靶點，已成為當前解決由木糖葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的重要手段之一。

生物被膜是附著在機體表面的微生物群落，在細菌的持久性感染中起著重要作用。與浮游細菌相比，生物被膜內(nèi)的細菌對抗生素的抵抗力要超出多個數(shù)量級[7]，而生物被膜的形成受多種復雜因素的影響和調(diào)節(jié)[8]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，木糖葡萄球菌組氨酸代謝通路中的關鍵酶咪唑甘油磷酸酯脫水酶(Imidazole glycerophosphate dehydratase，IGPD)在其生物被膜形成過程中具有重要調(diào)控作用，當IGPD基因(hisB)缺失后，會導致組氨酸含量和生物被膜的減少，說明其可以影響生物被膜的形成 ； 此外，由于IGPD僅存于植物和微生物中，使其成為優(yōu)質(zhì)的藥物靶點之一，可作為潛在的藥物靶標開發(fā)抑制劑[9]。

紅霉素(Erythromycin)屬于大環(huán)內(nèi)酯類藥物，對多種細菌及其形成的生物被膜有較好的抑制作用[10-11]，本課題組也在前期發(fā)現(xiàn)，紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜具有抑制作用[10]，但其具體機制及是否以IGPD為靶點干預木糖葡萄球菌生物被膜的形成還有待研究。因此，本試驗擬從紅霉素對IGPD的調(diào)控及直接作用兩方面探討紅霉素干預木糖葡萄球菌生物被膜形成的機制，為尋找干預木糖葡萄球菌生物被膜形成的藥物靶點奠定基礎，同時也為控制由木糖葡萄球菌生物被膜感染所引起的奶牛乳房炎等疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 木糖葡萄球菌ATCC 700404，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.2 主要試劑 紅霉素，購自Sigma公司；結(jié)晶紫、甲醇、乙醇、冰乙酸、無水乙醇、戊二醛、叔丁醇、磷酸鹽緩沖溶液，均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；咪唑甘油磷酸酯(IGP)，購自Santa Cruz Biotechnology公司；TSB培養(yǎng)基，購自海博生物科技有限公司；用于核酸操作的聚合酶、限制性內(nèi)切酶、試劑盒等相關分子生物學試劑及耗材，均購自TaKaRa有限公司；蛋白純化及分子互作所用藥品及試劑，購自GE Healthcare公司。

1.3 主要儀器 低溫高速離心機(Eppendorf 5430R)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，掃描電子顯微鏡[德國蔡司(ZEISS)公司]，分子互作儀(Octet RED384,ForteBio)。

1.4 引物設計 通過Premier 5.0設計了熒光定量PCR及蛋白表達引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列信息見表1。

表1 本試驗所用引物

1.5 試驗方法

1.5.1 紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜的抑制作用 無菌TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)木糖葡萄球菌至對數(shù)期，并稀釋使其濃度為1×105CFU/mL，后續(xù)試驗采用此濃度進行。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)規(guī)定的判定標準測定紅霉素對木糖葡萄球菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)；設置未加紅霉素處理的木糖葡萄球菌液為對照組，1/2 MIC(0.8 μg/mL)作用下的木糖葡萄球菌液為試驗組，參照楊艷北[10]操作方法，分別進行如下試驗：(1)測定生長速率：24 h內(nèi)每1 h取對照組和試驗組菌液測定OD570 nm值進行比較；(2)結(jié)晶紫染色法：分別取100 μL對照組和試驗組菌液加入96孔板，每組分別做6個重復孔，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，取出孔板測定OD570 nm值進行比較；(3)掃描電鏡法：分別取2 mL 對照組和試驗組菌液加入放有無菌毛玻璃片的6孔培養(yǎng)板中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。取出玻片后，脫水鍍膜，在掃描電子顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)。

1.5.2 紅霉素對木糖葡萄球菌IGPD的調(diào)控作用 紅霉素對hisB基因的影響：參照屈謙偉[12]操作方法，取1.5.1中稀釋后的木糖葡萄球菌菌液500 μL加到5 mL培養(yǎng)基內(nèi)，分組情況同1.5.1，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出菌液離心，采用RNA提取試劑盒提取RNA，采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在NCBI網(wǎng)站上下載hisB基因序列，設計引物，以16S rRNA為內(nèi)參基因。反應體系、反應程序和試驗數(shù)據(jù)的處理均參照本實驗室前期建立的方法[12]進行。

IGPD活性和組氨酸含量的測定：按照1.5.1培養(yǎng)對照組和試驗組菌液，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h，超聲破碎菌體，離心取上清。酶活性分析試驗參照Bisson等[13]方法，反應底物為IGP，測定上清液OD280 nm值；組氨酸含量測定按照本課題組前期建立的方法[10]進行，配置Pauly試劑，處理樣品，測定樣品的OD476 nm值。

1.5.3 紅霉素與IGPD的分子對接 從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下載IGPD的結(jié)構(gòu)文件，使用薛定諤軟件(Schrodinger docking software)的Glide模塊用于分子對接。活性區(qū)域盒子中心坐標：(X：42.99，Y：132.2，Z：21.84，Radius：20 ?)。具體可參見Kataria等[14]的方法，用以計算模擬小分子紅霉素與IGPD的作用關系。

1.5.4 紅霉素與IGPD的相互作用 參照參考文獻[12]操作方法，將IGPD蛋白純化，得到IGPD蛋白樣品，將IGPD蛋白與含0.05% Tween-20和1 mg/mL BSA的PBS溶液均勻混合，隨后將IGPD蛋白偶聯(lián)于Forte Bio Octet NTA傳感器上；同時將紅霉素進行2倍系列稀釋加入樣品孔；操作儀器使NTA傳感器分別與不同濃度的紅霉素相互作用，測定紅霉素與IGPD的結(jié)合解離曲線。

1.5.5 統(tǒng)計分析 本試驗采用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜的抑制作用 紅霉素對木糖葡萄球菌的MIC值為1.6 μg/mL。本試驗首先測定了1/2 MIC(0.8 μg/mL)的紅霉素對木糖葡萄球菌生長速率的影響，如圖1A所示，與對照組相比，試驗組的生長速率沒有受到藥物的影響(P>0.05)；通過結(jié)晶紫染色法測定了1/2 MIC(0.8 μg/mL)的紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預作用，如圖2B所示，與對照組相比，試驗組的OD570 nm值極顯著下降(P<0.01)；通過掃描電子顯微鏡觀察了1/2 MIC(0.8 μg/mL)的紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜形態(tài)學的影響，結(jié)果如圖1C和1D所示，對照組木糖葡萄球菌的生物被膜形態(tài)不同于游離菌，大量菌落排列緊密并黏附于蓋玻片表面，形成成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)(圖1C)，試驗組只有少量細菌黏附于蓋玻片表面，其立體結(jié)構(gòu)被破壞，不能形成成熟的生物被膜(圖1D)。以上結(jié)果表明，紅霉素可以有效抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成。

圖1 紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜的影響

2.2 紅霉素對木糖葡萄球菌IGPD的調(diào)控作用 為了驗證紅霉素對木糖葡萄球菌IGPD的調(diào)控作用，首先通過Real-time PCR檢測hisB基因的表達，結(jié)果如圖2A所示，與對照組相比，試驗組木糖葡萄球菌hisB基因表達極顯著下調(diào)(P<0.01)；隨后測定了木糖葡萄球菌IGPD酶活性和組氨酸含量，結(jié)果如圖2B和2C所示，與對照組相比，紅霉素顯著降低IGPD的酶活性(P<0.05)及組氨酸的含量(P<0.05)。

圖2 紅霉素對木糖葡萄球菌IGPD的調(diào)控作用

2.3 紅霉素與IGPD的分子對接 采用分子對接技術對紅霉素與IGPD的相互作用進行了準確模擬檢測，對接結(jié)果顯示，化合物紅霉素酸與IGPD具有良好的結(jié)合(Docking score：-4.551)。小分子紅霉素位于3個亞基形成的活性空腔中(封二彩版圖3A)，化合物與活性區(qū)域的氨基酸殘基Arg88、Ser108形成了2個氫鍵，Leu40和Phe43形成2個疏水相互作用，Glu162和Glu66形成2個鹽橋(靜電相互作用)(封二彩版圖3B)。

圖3 紅霉素與木糖葡萄球菌IGPD的分子對接

2.4 紅霉素與IGPD的相互作用 為了驗證紅霉素與IGPD蛋白的直接結(jié)合作用，進行了生物分子互作試驗，結(jié)果如封二彩版圖4所示，紅霉素與IGPD蛋白的結(jié)合在60 s內(nèi)達到平衡，其解離平衡常數(shù)(Kd)為550 μmol/L，并且兩者結(jié)合呈劑量依賴性，表明紅霉素可以與IGPD蛋白直接相互作用。

圖4 紅霉素與IGPD結(jié)合解離曲線

3 討論

在早期的研究中，木糖葡萄球菌被認為是一種“無害”的菌株，但越來越多的證據(jù)顯示木糖葡萄球菌與亞臨床奶牛乳房炎有關[15]。此外，有學者認為，木糖葡萄球菌或多種細菌為適應自然環(huán)境而形成微菌落聚集物，形如膜狀并不可逆地附著于病灶的表面，在機體內(nèi)形成生物被膜(BF)[16]，形成BF后具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[5]，使感染慢性化并難于控制，這也可能是凝固酶陰性細菌引起的奶牛乳房炎久治不愈的原因。因此，對木糖葡萄球菌生物被膜調(diào)控機制進行研究，尋找和研發(fā)新的干預生物被膜形成的藥物及靶點，是目前解決奶牛乳腺炎的有效手段之一。

紅霉素在獸醫(yī)臨床應用廣泛，對于多種細菌及其形成的生物被膜有較好的抑制作用，例如，有研究表明，亞抑菌濃度的魚腥草素鈉與紅霉素聯(lián)用對表皮葡萄球菌生物被膜具有破壞作用[17]；此外有研究顯示，紅霉素可以抑制多種細菌混合形成的生物被膜[18]。在本試驗中，通過結(jié)晶紫染色及掃描電鏡發(fā)現(xiàn)紅霉素可以降低生物被膜形成量，同時抑制木糖葡萄球菌生物被膜立體結(jié)構(gòu)的形成，說明紅霉素對木糖葡萄球菌生物被膜形成具有較好的抑制作用。此前有報道表明，紅霉素抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成可能與其調(diào)控了谷氨酰胺合成酶(GlnA)[10]和乳酸脫氫酶(LDH)[19]有關，但其是否存有其他機制及靶點還有待研究。

此前，本課題組通過試驗發(fā)現(xiàn)，IGPD在木糖葡萄球菌生物被膜形成過程中扮演著重要調(diào)控作用，并可能作為潛在的藥物靶標來開發(fā)抑制劑[9]，那么紅霉素是否以IGPD為靶點干預了木糖葡萄球菌生物被膜的形成，值得進一步的研究。本試驗采用Real-time PCR、酶活性測定和組氨酸含量測定等試驗，結(jié)果顯示，紅霉素可以顯著下調(diào)hisB基因的表達，同時降低IGPD的酶活性及組氨酸的含量，這些結(jié)果表明紅霉素能夠通過調(diào)控IGPD，從而影響組氨酸合成通路，進而抑制生物被膜的形成；進一步采用分子對接及等離子共振試驗，可見紅霉素與IGPD有較好的直接相互作用，表明IGPD可能是紅霉素作用的靶標；通過紅霉素對IGPD的調(diào)控及直接結(jié)合兩方面作用的結(jié)果，推測紅霉素可能以IGPD為作用靶點抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成。

本試驗通過一系列試驗初步證實紅霉素可能通過作用于IGPD抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成，但紅霉素干預生物被膜形成是否還有其他機制有待進一步研究；本試驗除可為尋找干預木糖葡萄球菌生物被膜形成的藥物靶點提供科學依據(jù)外，在以紅霉素為母核結(jié)構(gòu)研發(fā)新的抗生物被膜藥物上也能提供一些思路；此外，中藥因其多靶點、毒副作用小等優(yōu)點已逐漸被關注[20]，而在未來的研究中，也會重點關注是否能夠篩選到以IGPD為作用靶位干預生物被膜形成的中藥。