臧超然 覃 嶺 劉桂海 孫堅萍 李 康 張永宏

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)信息中心，北京 100069）

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的惡性腫瘤，全球新診斷的HCC 病例和病死患者約有50%發(fā)生在我國［1］。目前HCC 的治療方案包括外科切除、肝臟移植、消融治療、經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞、靶向治療、免疫治療等［2］。因為HCC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診時已進展至中晚期而失去根治機會［3］。免疫治療的興起給很多患者帶來希望。但由于目前關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展免疫機制的不明確以及免疫治療相關(guān)研究的欠缺等，免疫治療的療效仍不盡人意，其機制有待深入研究［4-5］。

腫瘤發(fā)生過程中，T細胞發(fā)揮主要清除作用。腫瘤細胞與T 細胞相互作用影響HCC 的發(fā)展方向［6］。在免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用下，腫瘤細胞通過各種機制影響T 細胞的生存及命運從而獲得生存機會。因此，確定腫瘤特異性T 細胞并使該T 細胞發(fā)揮殺傷功能是控制腫瘤的關(guān)鍵所在。據(jù)此，課題組篩選并使用了5 種在HCC 中表達的腫瘤相關(guān)抗原（tumorassociated-antigen，TAA）——婆羅雙樹樣基因-4（SALL4）、黑色素瘤抗原A1（MAGE-A1）、MAGE-A3、紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（NY-ESO-1）、滑膜肉瘤X 斷裂點2（SSX-2）組成抗原肽庫，檢測HCC 患者外周血中TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)，分析不同HCC患者間T 細胞的差異，并結(jié)合疾病預(yù)后分析T 細胞對疾病進展的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究納入原發(fā)性肝癌患者39例，男31例，女8例，平均年齡（55.26±1.31）歲，參照美國肝病研究協(xié)會（AASLD）的診斷標準診斷［2］，患者均未接受免疫相關(guān)治療?；颊呔捎媒槿胫委煵㈦S訪，每3~6 個月行CT 檢查，如發(fā)現(xiàn)肝臟或其他部位出現(xiàn)新發(fā)肝癌病灶，則診斷為治療后復(fù)發(fā)。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；96 孔反應(yīng)板購自美國 Millipore 公司；酶聯(lián)免疫斑點測定（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）試劑盒購自瑞典 Mabtech 公司；CD3 抗體（克隆：SK7）、PD1 抗體（克?。篍H12.2H7）購自美國Biolegend 公司；CD4 抗體（克隆：M-T477）、CD8 抗體（克?。篠K1）、CD45RA 抗體（克?。篐I100）、CCR7 抗體（克?。?50503）、CD27 抗體（克隆：M-T271）、CD152抗體（克?。築NI3）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肽庫的合成 以蛋白文庫中SALL4、SSX2、MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1 蛋白序列為模板，合成18 個氨基酸長、10 個氨基酸重疊的多肽片段259 條，并制成7 個反應(yīng)肽庫，各肽庫所包含的肽段如表1所示。

表1 7個肽庫的肽段序列Tab.1 Peptide sequences of seven peptide pools

1.2.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離 以EDTA抗凝管留取肝癌患者外周血，采用密度梯度離心法分離得到PBMC［7］，取適量用于 ELISPOT 實驗，剩余細胞凍存于液氮中。

1.2.3 ELISPOT 上述采用密度梯度離心法分離得到的PBMC 經(jīng)計數(shù)后，采用TAA 肽庫刺激，檢驗IFN-γ 分泌情況。試劑采用 IFN-γ 酶聯(lián)斑點免疫分析試劑盒，數(shù)據(jù)處理采用ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)，陽性判斷標準為每孔斑點數(shù)-背景斑點數(shù)≥25個且＞2 倍的背景斑點數(shù)，結(jié)果采用單位斑點形成數(shù)/106單個核細胞（SFU/106PBMC）表示。

1.2.4 流式細胞術(shù) 將凍存的PBMC 復(fù)蘇，收集約1×106個細胞，以100 μl PBS 重懸。根據(jù)抗體說明書要求加入適量熒光標記抗體，4 ℃避光孵育20 min。PBS 洗滌 2 次，重懸于 500 μl 細胞固定液中用于流式細胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)［M（Q1，Q3）］表示，采用秩和檢驗。治療后生存分析采用Kaplan-Meier Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 患者TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng) 入組患者中有17例對任何TAA 均未出現(xiàn)特異性T 細胞免疫反應(yīng)，陰性反應(yīng)率為43.59%（17/39），22例患者的PBMC 至少能識別其中1 種TAA，陽性反應(yīng)率為56.41%（22/39）。就目前所覆蓋的腫瘤相關(guān)抗原，僅有約半數(shù)患者的外周循環(huán)中存在特異性T細胞。

2.2 TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)不同患者間的預(yù)后分析 所有HCC 患者根據(jù)不同病情均接受介入治療，其中接受消融治療并達到完全消融目的的患者有27例。對達到完全消融目的的患者進行隨訪，隨訪時間為0~32 個月，隨訪CT 發(fā)現(xiàn)新發(fā)灶為隨訪終點。生存分析顯示，TAA 特異性T 細胞反應(yīng)陽性患者的無復(fù)發(fā)生存期優(yōu)于TAA特異性T細胞反應(yīng)陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性和陰性患者的生存分析Fig.1 Survival analysis of patients with positive and negative TAA-specific T cell immune response

2.3 不同TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)患者間T 細胞分化表型的差異 對外周血T 細胞的分化表型進行分析，結(jié)果顯示：TAA特異性T細胞免疫反應(yīng)陽性患者外周血中CD4+和CD8+的TTE（terminal effector T cell，CD27-CD45RA+CCR7-）細胞百分比高于TAA 特異性T 細胞反應(yīng)陰性患者［CD4：0.83%（0.34%，1.33%）vs0.36%（0.24%，0.58%），P=0.02；CD8：7.57%（3.46%，11.29%）vs4.76%（2.42%，6.77%），P=0.03］，且TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性患者的CD4+TEM（effector memory T cell，CD27-CD45RA-CCR7-）顯著高于陰性患者［8.94%（6.30%，16.56%）vs6.32%（4.38%，11.77%），P=0.04］（圖2）。提示該部分患者中效應(yīng)階段T細胞水平較高，有利于針對并及時消滅靶細胞。

圖2 TAA特異性T細胞免疫反應(yīng)陽性和陰性患者的T細胞分化表型分析Fig.2 Differentiation phenotypic analysis of T cells in patients with and without TAA-specific T cell immune response

2.4 TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性患者免疫檢查點水平的表達差異 在外周循環(huán)能夠檢測到TAA 特異性 T 細胞的 22例 HCC 患者中，疾病早期（BCLC-0/A）患者 14例，進展期（BCLC-B/C）患者8例。對這 22例患者 PBMC 的免疫檢查點 PD-1 和CD152 表達水平進行分析，結(jié)果顯示：早期患者的CD8+PD1+T 細胞百分比為（27.66±2.64）%，進展期患者的CD8+PD1+T 細胞百分比為（40.65±4.39）%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.71，P=0.01）；早期患者的 CD8+CD152+T 細胞百分比為（11.84±0.89）%，進展期患者的CD8+CD152+T細胞百分比為（17.96±1.72）%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.51，P＜0.01，圖3）。早期和進展期患者間CD4+T細胞比例未見明顯差異。提示進展期患者的耗竭性細胞毒性T細胞比例顯著增高。

圖3 TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性的早期和進展期HCC患者耗竭性CD8+T細胞水平的比較Fig.3 Comparison of exhausted CD8+T cell levels in early and advanced HCC patients with positive TAA-specific T cell immune response

3 討論

近年來，腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究取得了重大進展，許多免疫治療方法已被應(yīng)用于臨床，尤其是各種致力于改善和恢復(fù) T 細胞功能的免疫療法［4-5，8-10］。腫瘤進展的相關(guān)免疫學(xué)機制也在被一步步深入探索并逐漸揭示。但我國HCC 人群T 細胞特點的數(shù)據(jù)較少，限制了基于我國人群的肝癌免疫治療發(fā)展［11-12］。

T 細胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中負責(zé)消滅惡性細胞的主要力量。T 細胞識別并消滅腫瘤細胞的過程稱為“腫瘤免疫循環(huán)”［13］，但由于腫瘤細胞的惡化過程可通過各種機制逃避“腫瘤免疫循環(huán)”的殺傷并獲得生存，使該循環(huán)過程在各個環(huán)節(jié)被改變，從而影響T細胞殺滅靶細胞功能。其中最直接的作用就是影響并改變T 細胞。從最初的初始T 細胞分化為最終的特異性效應(yīng)性T 細胞的過程中，T 細胞的狀態(tài)和功能發(fā)生顯著轉(zhuǎn)變［14］。在這一過程中，腫瘤細胞與T 細胞間的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致T 細胞效應(yīng)功能減弱甚至喪失，如免疫檢查點的表達、調(diào)節(jié)性T 細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、髓源抑制性細胞等負向免疫調(diào)節(jié)的細胞，抑制了T細胞效應(yīng)功能的執(zhí)行［15-20］。

本研究顯示，半數(shù)以上HCC 患者的外周循環(huán)中可檢測到TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)，表明特異性T 細胞的存在。這些T 細胞能夠監(jiān)視并作用于循環(huán)中存在的腫瘤細胞，有利于及時消滅微小的循環(huán)轉(zhuǎn)移腫瘤細胞。同時，本研究結(jié)果也顯示TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性患者的無復(fù)發(fā)生存期優(yōu)于TAA特異性T 細胞免疫反應(yīng)陰性患者，證明了TAA 特異性T 細胞能夠延緩腫瘤的出現(xiàn)，并發(fā)揮保護作用。因此誘導(dǎo)產(chǎn)生和維持特異性T 細胞對于控制腫瘤、改善患者預(yù)后意義重大。進一步分析患者外周T細胞分化表型，結(jié)果顯示，TAA特異性T細胞反應(yīng)陽性患者外周循環(huán)中效應(yīng)功能性CD4+/CD8+T 細胞水平顯著高于陰性患者，且CD4+T 細胞可能在T 細胞清除腫瘤的過程中發(fā)揮重要作用［21］。TAA 特異性T細胞反應(yīng)陽性患者CD4+T 細胞中TEM 百分比顯著高于陰性患者，CD4+T 細胞對于細胞毒性T 細胞發(fā)揮殺傷功能的輔助必不可少，基于TEM 的增殖特性，有利于維持CD4+T 細胞的輔助作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然TAA 特異性T 細胞免疫反應(yīng)陽性患者的效應(yīng)性T細胞的水平相對較高，但伴隨腫瘤進展，免疫檢查點PD-1、CD152 的表達百分比也顯著增高，表明腫瘤的進展會限制T 細胞效應(yīng)功能的發(fā)揮，使更多T細胞逐漸進入功能抑制狀態(tài)導(dǎo)致腫瘤細胞的逃逸和疾病的進展。

因此，腫瘤抗原特異性T 細胞是控制腫瘤的關(guān)鍵。腫瘤細胞在與免疫細胞的博弈過程中進化出各種機制誘導(dǎo)T 細胞向失能狀態(tài)轉(zhuǎn)變：識別腫瘤細胞的功能性T細胞的減少、誘導(dǎo)免疫檢查點表達等。本研究結(jié)果提示：誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)性的特異性T細胞、阻斷免疫檢查點的表達是控制HCC 的重要途徑。因此，腫瘤疫苗的研究和應(yīng)用、嵌合抗原受體T細胞免疫療法、免疫檢查點抑制劑等方法的合理整合，在產(chǎn)生精準靶向腫瘤的T細胞的同時避免了免疫檢查點的表達，使靶向性T 細胞維持功能，可能會為HCC的免疫治療帶來更好的療效。