李慧晨，張穎穎，郭文萍，宋永青，樊之聰

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

萬古霉素（分子式CHClNO）屬于糖肽類抗生素，作為抗生素的“最后一道防線”，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制被用于治療對其他抗生素?zé)o效的嚴(yán)重感染。萬古霉素的藥渣可作為補(bǔ)充蛋白飼料資源的一部分，并且可作為保健促生長飼料添加劑，用以提高飼料報(bào)酬率，因此被廣泛用于食用動物的生產(chǎn)養(yǎng)殖中，盡管農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告中已將萬古霉素列為禁用獸藥，但仍有養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中惡意添加，造成畜肉藥物殘留的問題。消費(fèi)者長期食用會產(chǎn)生嚴(yán)重的抗生素耐藥性，且萬古霉素有嚴(yán)重的耳毒性、腎毒性及其他副作用，給人類的健康造成巨大影響。

目前，萬古霉素的測定樣品基質(zhì)主要集中在藥物、血液、飼料、乳制品等，采用的方法多是液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光免疫法、近紅外光譜法、微生物法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。萬古霉素經(jīng)過飼喂及體內(nèi)吸收后，殘留在畜肉中的含量較低，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）具有分辨率高、定性定量準(zhǔn)確、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)π笕庵腥f古霉素進(jìn)行痕量檢測。近年來對畜肉中萬古霉素殘留量測定的研究不斷增多，回收率和檢出限也能滿足日常檢測需求，但普遍未對方法中基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)，也未評估檢測過程的不確定度。

食品檢驗(yàn)工作對結(jié)果的準(zhǔn)確度要求日益提高，但檢驗(yàn)過程會受到諸多因素的影響，導(dǎo)致測量結(jié)果和真值之間存在一定的誤差。由于真值往往不易得到，為了更客觀、科學(xué)地評價(jià)測量結(jié)果，需要開展對食品檢測過程中不確定度的評定。本研究利用UPLC-MS/MS，通過優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件及儀器采集條件，建立一種畜肉中萬古霉素的檢測方法，并依據(jù)CNAS-CL01-G003—2021《測量不確定度的要求》分析方法測量結(jié)果的不確定度，以便對用檢測結(jié)果進(jìn)行樣品符合性判定時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)開展評估，確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉（15 份）、牛肉（5 份）和羊肉（5 份）購買于農(nóng)貿(mào)市場。

萬古霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純） 美國Fisher公司；正己烷（分析純）、甲醇（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ UPLC-MS/MS儀（配備電噴霧離子源、TraceFinder 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Thermo Fisher公司；20PR-520高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；HGC-12A氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；HENGAO T&D固相萃取裝置 美國Aiglent公司；KQ-700DV超聲儀 昆山超聲儀器有限公司；C、C、PHENYL固相萃取柱 博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.014 75 g萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.000 01 g），用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈定容于100 mL容量瓶中，制得標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度為147.5 μg/mL，4 ℃冰箱保存。使用時(shí)依次用0.1%甲酸水溶液-乙腈（7∶3，/）稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 樣品制備

提取：分別取豬肉、牛肉和羊肉樣品，經(jīng)勻漿后制備成糜狀均質(zhì)樣品，準(zhǔn)確稱取5 g均質(zhì)樣品（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入5 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶液，渦旋2 min后，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min；上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，再向樣品殘?jiān)屑尤? mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶液，重復(fù)提取1 次，離心后合并提取液；加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min后，棄去上層正己烷。

凈化：將提取液全部加入至依次用5 mL甲醇、5 mL水活化的C固相萃取柱中，用5 mL水淋洗小柱，然后用6 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50 ℃氮吹至干；準(zhǔn)確吸取1.00 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）溶解殘?jiān)?，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測及分析。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：Hypersil GOLD C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈。二元梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子化模式為正模式；噴霧電壓3 000 V；離子源霧化溫度350 ℃；鞘氣壓力45 arb；輔氣壓力15 arb；采集方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，采集參數(shù)見表2。

表2 萬古霉素的MRM采集參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for vancomycin

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確移取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，用0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.59、1.48、2.95、5.90、14.75 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。采用外標(biāo)法，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以待測物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 測量不確定度評定

對豬肉中萬古霉素含量進(jìn)行6 次重復(fù)測定，根據(jù)測定結(jié)果，依據(jù)CNAS-CL01-G003—2021和JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，對測定過程產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行評估。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)按式（1）計(jì)算。

式中：基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以空白基質(zhì)提取液為溶劑，配制成與標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)質(zhì)量濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜圖采用Thermo Fisher TraceFinder 4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，自動計(jì)算擬合線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的選擇

萬古霉素屬于大環(huán)糖肽類抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羥基、酰胺等多個(gè)親水性基團(tuán)，在水溶液中有很好的溶解性，在甲醇中微溶，在中性和酸性溶液中較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)比較了水、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液、體積分?jǐn)?shù)0.3%甲酸水溶液的提取效果。結(jié)果顯示，酸性水溶液提取率高于水溶液，且0.1%甲酸水溶液與0.3%甲酸水溶液的提取率無明顯差別，故選擇0.1%甲酸水溶液進(jìn)行提取。但由于畜肉中有大部分蛋白質(zhì)是溶于水的，提取液渾濁，雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾嚴(yán)重且容易污染質(zhì)譜，根據(jù)畜肉中蛋白質(zhì)特點(diǎn)，加入適量的有機(jī)溶劑可降低蛋白質(zhì)的溶解性，因此比較在甲醇、乙腈中分別加入0.1%甲酸水溶液的提取率，結(jié)果顯示，0.1%甲酸水溶液-乙腈的提取率最高，因此選用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為混合提取試劑。

進(jìn)一步比較不同體積比的0.1%甲酸水溶液-乙腈（85∶15、70∶30、55∶45）對樣品中萬古霉素的提取回收率，結(jié)果顯示，0.1%甲酸水溶液-乙腈（70∶30，/）的回收率最高。此外，畜肉中所含的脂肪會干擾凈化過程并污染色譜柱，因此提取溶液需用乙腈飽和的正己烷去除脂肪后再進(jìn)一步凈化。

2.1.2 凈化條件的選擇

固相萃取柱的選擇：根據(jù)萬古霉素的化學(xué)性質(zhì)，分別選擇C、C、PHENYL 3 種固相萃取柱進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示，C萃取柱的回收率最高，因此選擇C作為固相萃取柱。

凈化條件的優(yōu)化：比較水和0.1%甲酸水溶液作為淋洗溶劑的效果，結(jié)果顯示，二者回收率無明顯差別，因此選擇水作為淋洗溶劑；進(jìn)一步比較3、6、10 mL甲醇作為洗脫溶劑的效果，結(jié)果顯示，用3 mL甲醇洗脫回收率最低，用6、10 mL甲醇洗脫的回收率相差不大，因此選擇6 mL甲醇進(jìn)行洗脫。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

萬古霉素的分子式為CHClNO，相對分子質(zhì)量為1 449.25，對萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行全掃描時(shí)，發(fā)現(xiàn)萬古霉素更容易產(chǎn)生帶正電的雙電荷離子（[M+2H]），因此其母離子為/725.4。之后進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，通過優(yōu)化碰撞電壓等條件，獲得定量離子、定性離子的最大響應(yīng)強(qiáng)度。正離子掃描模式下，在液相色譜流動相中加入少量的甲酸會增強(qiáng)待測化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，這主要是由于酸提供了更多的H。因此本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸水溶液與乙腈為流動相，優(yōu)化梯度洗脫程序，從而保證各個(gè)化合物有良好的峰形、分離度及響應(yīng)強(qiáng)度。在此條件下，10 ng/mL萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子色譜圖如圖1所示。

圖1 萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 1 Chromatogram of vancomycin standard solution

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍及檢出限

在0.59～14.75 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性方程為=94.19+142.50，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，線性關(guān)系良好。

在空白豬肉樣品中加入萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過提取和凈化后，進(jìn)行儀器檢測，以定量離子信噪比不小于3為檢出限，得到檢出限為0.1 μg/kg。較周迎春等的研究，該方法檢出限更低。

2.3.2 回收率及精密度

在空白豬肉中添加低、中、高3 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加量分別做6 個(gè)平行，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。由表3可知，萬古霉素的回收率為86.7%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，其精密度和回收率均符合殘留分析方法的要求。在此基礎(chǔ)上，對空白牛肉、羊肉進(jìn)行低濃度水平（加標(biāo)量為0.38 μg/kg）的添加回收驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，回收率分別為86.3%和97.1%，滿足日常檢測需求。

表3 豬肉樣品中萬古霉素添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of vancomycin in spiked pork samples

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是影響定量分析準(zhǔn)確性的因素之一，產(chǎn)生的主要原因是樣品中鹽類、胺類、脂肪酸等干擾物質(zhì)與目標(biāo)物一同提取出來，從而影響目標(biāo)物進(jìn)入質(zhì)譜分析的離子數(shù)量，導(dǎo)致定量結(jié)果產(chǎn)生偏差。本研究中萬古霉素的基質(zhì)效應(yīng)為-24%，結(jié)合添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)未對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

2.4 方法的應(yīng)用

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)建立的前處理方法，對農(nóng)貿(mào)市場的豬肉、牛肉、羊肉共計(jì)10 個(gè)樣品進(jìn)行萬古霉素含量檢測，未檢出陽性樣品。

2.5 不確定度評估

由于既往對萬古霉素檢測方法的研究中，測量不確定度評估的研究較少，因此，本研究對豬肉中萬古霉素測定過程的測量不確定度進(jìn)行了評估。

2.5.1 建立數(shù)學(xué)模型

樣品中萬古霉素含量按式（2）計(jì)算。

式中：為試樣中萬古霉素含量/（μg/kg）；為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中擬合得到的萬古霉素溶液質(zhì)量濃度/（ng/mL）；為樣品溶液最終體積/mL；為樣品質(zhì)量/g。

2.5.2 不確定度分量的主要來源分析

通過檢測過程及數(shù)學(xué)模型，可以確定不確定度來源主要包括標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度、樣品制備過程引入的不確定度、曲線擬合引入的不確定度、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（隨機(jī)）變化引入的不確定度、試劑空白引入的不確定度、提取、凈化對樣品回收率的影響引入的不確定度和儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度。

相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（3）計(jì)算。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

來自標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度，按式（4）計(jì)算。

2.5.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的不確定度

來自標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容至100 mL時(shí)引入的不確定度。按式（5）計(jì)算。

式中：標(biāo)準(zhǔn)品證書上提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為（99.5±0.5）%，包含因子為3，則按式（6）計(jì)算。

天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.01 mg，包含因子為3，則按式（7）計(jì)算。

分別來源于容量瓶引入的不確定度和實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度。100 mL容量瓶的允許誤差為±0.1 mL，包含因子為6；實(shí)驗(yàn)溫度為22 ℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10/℃，包含因子為3。因此，按式（8）計(jì)算。

根據(jù)式（8）計(jì)算得到為4.74×10，根據(jù)式（5），利用式（6）、（7）、（8）的結(jié)果，計(jì)算得到為2.95×10。

2.5.3.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

來自0.2 mL分度吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（9）計(jì)算。

式中：0.2 mL分度吸管的允差為±0.005 mL，50 mL容量瓶的允差為±0.05 mL，包含因子均為6，實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度同上，則和分別按式（10）、（11）計(jì)算。

根據(jù)式（10）、（11）計(jì)算得到為1.02×10，為4.74×10。

根據(jù)式（9），利用式（10）、（11）的結(jié)果，計(jì)算得到為1.02×10。

來自0.5 mL分度吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（12）計(jì)算。

式中：0.5 mL分度吸管的允差為±0.010 mL，包含因子為6，實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度同上，按式（13）計(jì)算。

根據(jù)式（13）計(jì)算得到為8.16×10。

根據(jù)式（12），利用式（11）、（13）的結(jié)果，計(jì)算得到為8.17×10。

來自1.0 mL單標(biāo)吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（14）計(jì)算。

式中：1.0 mL單標(biāo)吸管的允差為±0.007 mL，包含因子為6，實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度同上，按式（15）計(jì)算。

根據(jù)式（15）計(jì)算得到為2.87×10。

根據(jù)式（14），利用式（11）、（15）的結(jié)果，計(jì)算得到為2.91×10。

來自2.0 mL單標(biāo)吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（16）計(jì)算。

式中：2.0 mL單標(biāo)吸管的允差為±0.010 mL，包含因子為6，實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度同上，按式（17）計(jì)算。

根據(jù)式（17）計(jì)算得到為2.05×10。

根據(jù)式（16），利用式（11）、（17）的結(jié)果，計(jì)算得到為2.10×10。

來自5.0 mL單標(biāo)吸管引入的不確定度和定容引起的不確定度，按式（18）計(jì)算。

式中：5.0 mL單標(biāo)吸管的允差為±0.015 mL，包含因子為6，實(shí)驗(yàn)溫度引入的不確定度同上，按式（19）計(jì)算。

根據(jù)式（19）計(jì)算得到為1.24×10。

根據(jù)式（18），利用式（11）、（19）的結(jié)果，計(jì)算得到為1.33×10。

根據(jù)式（4），利用式（5）、（9）、（12）、（14）、（16）、（18）的結(jié)果，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.39×10。

2.5.4 樣品制備過程引入的不確定度

來自稱量引入的不確定度和用單標(biāo)吸管移取1.0 mL甲酸-乙腈溶液復(fù)溶所引入的不確定度，按式（20）計(jì)算。

式中：稱取5.000 g樣品，天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.001 g，包含因子為3，則按式（21）計(jì)算。

根據(jù)式（20），利用式（15）、（21）的結(jié)果，計(jì)算得到樣品制備過程引入的不確定度為2.87×10。

2.5.5 曲線擬合引入的不確定度

采用5 個(gè)質(zhì)量濃度水平的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（ρ）進(jìn)行線性擬合，得到線性方程：=94.19+142.50（=0.999 5），曲線擬合的相對合成不確定度按式（22）計(jì)算。

式中：為擬合曲線截距（142.50）；y為擬合曲線各個(gè)質(zhì)量濃度的響應(yīng)值；ρ為擬合曲線各質(zhì)量濃度。

2.5.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

在重復(fù)性條件下，對豬肉中的萬古霉素含量進(jìn)行了6 次平行測定，含量（x）分別為0.341、0.350、0.367、0.326、0.348、0.319 μg/kg。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的相對合成不確定度按式（25）計(jì)算。

2.5.7 試劑空白引入的不確定度

由于本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為色譜純或者分析純，試劑空白溶液在目標(biāo)物保留時(shí)間附近無干擾，故可忽略不計(jì)。

2.5.8 提取、凈化對樣品回收率的影響引入的不確定度

對含有萬古霉素的樣品進(jìn)行6 次添加回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率分別為88.8%、91.1%、88.8%、86.7%、89.8%和89.6%。加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的相對合成不確定度按式（27）計(jì)算。

2.5.9 儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度

根據(jù)校準(zhǔn)證書獲得儀器定量測量重復(fù)性引入的不確定度=6.12×10。

2.5.10 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3 結(jié) 論

本研究建立了測定畜肉中萬古霉素殘留的UPLCMS/MS法。樣品經(jīng)0.1%甲酸水溶液-乙腈提取，正己烷除去脂肪，過C固相萃取柱凈化，C色譜柱分離，采用MRM檢測，外標(biāo)法定量。檢出限為0.1 μg/kg，加標(biāo)回收率為86.7～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。對該過程的測量不確定度進(jìn)行評估，在95%的置信水平下，取擴(kuò)展因子=2，結(jié)果可表示為（0.342±0.041） μg/kg。本方法操作簡便快捷、靈敏度高、回收率穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量樣品的分析。