劉婉麗，譚永輝，鄭翼徳

（郴州市第一人民醫(yī)院血管外科，湖南郴州 423000）

頸動脈是將血液由心臟輸送至腦部的主要血管之一，頸動脈狹窄是指頸動脈內(nèi)徑變小甚至閉塞［1］，其發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)、自身免疫、動脈粥樣硬化等均與頸動脈狹窄發(fā)病相關(guān)，常伴有頭暈、記憶力下降、肢體麻木、意識障礙等不良表現(xiàn)，長期狹窄可引起慢性腦缺血缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，嚴(yán)重的頸動脈狹窄可引起腦梗死甚至死亡，嚴(yán)重危害患者生命健康［2-3］。氯吡格雷是抑制血小板聚集的藥物，常用于預(yù)防、治療由于血小板高聚集引起的腦卒中、心肌梗死、動脈循環(huán)障礙等疾病，在頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)中的使用幾率較大［4-5］，Graham 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有的抗血栓治療中加入氯吡格雷可顯著減少頸動脈狹窄引起的微栓塞數(shù)量。龔煜等［7］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷可顯著降低頸動脈狹窄患者的頸動脈內(nèi)膜中層厚度，且臨床效果較好，但關(guān)于其作用機制研究較少。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）及其特異性受體CXCR4 與胚胎發(fā)育、血管新生、炎癥反應(yīng)等生理病理過程密切相關(guān)，具有促進細(xì)胞遷移黏附、血管生成、內(nèi)膜增生等作用［8-9］。秦合偉等［9］研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織中SDF-1α、CXCR4 濃度顯著較高，并認(rèn)為SDF-1α/CXCR4 生物軸可能是冠心康干預(yù)動脈粥樣硬化形成的作用靶點之一。因此，本研究在前人的研究基礎(chǔ)上探究氯吡格雷對頸動脈狹窄及SDF-1α/CXCR4 通路的影響。

1 材料和方法

1.1 動 物

40 只無特定病原體（SPF）級SD 雄性大鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2016-0041。所有大鼠均于本院動物房中飼養(yǎng)并適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，采取自然光照及通風(fēng)，自由飲食、飲水，動物房內(nèi)溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在50%左右，按時對動物房及鼠籠進行清潔。

1.2 主要試劑及儀器

氯吡格雷（75 mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20080090）購于杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、改良蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：SERK-0024、SERK-0017、SERK-0053、SERK-0012、G1121、BC3710、PC0020）購于北京索萊寶科技有限公司；SDF-1α ELISA 試劑盒（貨號：ml026159）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源抗體、羊抗兔IgG 抗體（貨號：EPR5368、ab18919、ab124824、ab9485、ab150077）購于英國Abcam。

Bio-rad680 酶標(biāo)儀購于美國伯樂；TS3B 全自動生物組織脫水機購于浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；MA752 組織切片機購于英國Campden；DMD108 光學(xué)顯微鏡購于德國徠卡；BOND-Max 全自動免疫組化和原位雜交多功能染色機購于德國leica；JY300 蛋白電泳儀購于北京君意華鑫科技有限公司；TE70X 半干轉(zhuǎn)膜儀購于美國Hoefer；Quan?tum CX5 凝膠成像儀購于法國Vilber。

1.3 動物模型制備及分組給藥

頸動脈狹窄大鼠模型的構(gòu)建參考文獻［10］的方法并稍作修改，40 只SD 大鼠按照隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組（8 只）、造模組（32 只）。將大鼠麻醉后保持仰臥位固定，消毒大鼠頸部皮膚后沿頸部正中線做長度約為4 cm 的切口，逐層分離肌肉后使頸動脈暴露，在頸總動脈近心端與頸外、頸內(nèi)動脈交叉處的1.5 cm 處做約為血管橫截面1/3 的切口，將10 mL 注射器的針頭插入上述切口，保持針頭與血管平行，用0 號手術(shù)線結(jié)扎頸動脈及針頭，小心拔出針頭，縫合傷口并做消毒處理。假手術(shù)組僅暴露頸動脈，不做結(jié)扎處理。兩組隨機選取兩只大鼠，解剖后獲取狹窄動脈組織，清洗后進行HE 染色，觀察到造模組大鼠頸動脈新生內(nèi)膜明顯增厚即可說明頸動脈狹窄模型構(gòu)建成功。造模過程中，大鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，及時選取備用大鼠進行補充。

將造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字法分為模型組、氯吡格雷低劑量組（3 mg/kg）、氯吡格雷中劑量組（6 mg/kg）、氯吡格雷高劑量組（12 mg/kg）［11］，每組8 只。術(shù)后3 d 按照各組給藥劑量進行灌胃處理，連續(xù)灌胃1 周。

1.4 大鼠血液及頸動脈組織采集

末次給藥結(jié)束后24 h，將各組大鼠麻醉后行心臟取血（約4 mL），離心后收集血清用于炎癥因子濃度的測定；取血結(jié)束后將各組大鼠處死，采集結(jié)扎處頸動脈組織，用于頸動脈病理學(xué)觀察及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測。

1.5 大鼠血清炎癥因子濃度檢測方法

取1.4 中各組大鼠血清，用CRP、MCP-1、TGFβ、PGE2、SDF-1α 相關(guān)ELISA 試劑盒檢測血清中炎癥因子濃度，具體操作方法參考相關(guān)試劑盒中的說明書。

1.6 大鼠頸動脈組織病理損傷觀察

取出1.4 中各組大鼠適量頸動脈組織，清洗干凈后固定于4%多聚甲醛中（24 h），用水將頸動脈組織上的甲醛溶液沖掉，對頸動脈組織進行脫水、透明處理，接著將融化的石蠟完全浸入頸動脈組織中，待其凝固后進行修剪并切片，將得到的石蠟切片經(jīng)過二甲苯Ⅰ脫蠟10 min、二甲苯Ⅱ脫蠟10 min、無水乙醇Ⅰ2 min、無水乙醇Ⅱ2 min、95%乙醇2 min、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min、蘇木素染色5 min、分化液分化5 s、返藍(lán)液返藍(lán)1 min、伊紅染色2 min、80%乙醇3 s、90%乙醇3 s、95%乙醇3 s、95%乙醇3 s、無水乙醇1 min、二甲苯Ⅰ1 min、二甲苯Ⅱ1 min、封片等步驟得到病理組織切片，具體操作參考HE 染色試劑盒的要求，于光學(xué)顯微鏡下觀察后拍照并進行觀察。

1.7 免疫組化檢測大鼠頸動脈組織中α-SMA濃度

將包有大鼠頸動脈組織的石蠟切片進行常規(guī)脫蠟復(fù)水，置于3%H2O2中孵育30 min，經(jīng)過堿修復(fù)、加熱、煮沸后于5%牛血清白蛋白中37℃孵育1 h，加入兔源α-SMA 一抗（稀釋比為1∶800），4 ℃冰箱中孵育過夜后加入羊抗兔二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染核、中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡中觀察并拍照，采用Image J 軟件對染色結(jié)果進行半定量分析。

1.8 大鼠頸動脈組織SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表達(dá)檢測

取1.4 中各組大鼠適量頸動脈組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后剪碎，加入組織裂解液低溫研磨，根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒的要求提取其中蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其中蛋白質(zhì)濃度。將各組大鼠頸動脈組織蛋白質(zhì)溶液調(diào)至濃度相同，取5 μL待測液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，接著采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，將上述纖維膜用5%脫脂奶粉進行封閉處理2 h，用TBST 沖洗掉纖維膜上的封閉液后加入α-SMA、SDF-1α、CXCR4、GAPDH 兔源一抗（稀釋比為1∶1 000），4 ℃冰箱中孵育過夜后取出，用TBST 沖洗后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育1 h經(jīng)過顯色處理后進行定影觀察并拍照分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0 數(shù)據(jù)處理軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，單因素方差分析組間差異，進一步兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動脈狹窄大鼠模型構(gòu)建成功驗證

假手術(shù)組大鼠頸動脈組織正常；與假手術(shù)組相比，造模組大鼠頸動脈新生內(nèi)膜顯著增厚，頸動脈腔管面積較小，結(jié)扎損傷法構(gòu)建大鼠頸動脈狹窄模型構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 假手術(shù)組與造模組大鼠頸動脈脈組織光學(xué)顯微鏡下圖像（HE 染色；A 為假手術(shù)組；B 為造模組）

2.2 各組大鼠血清炎癥因子濃度比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見表1。

表1 各組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度比較 ［n=8，］

表1 各組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2、SDF-1α 濃度比較 ［n=8，］

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠動脈組織結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組大鼠頸動脈組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜無明顯病變，中膜平滑肌細(xì)胞、彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰；與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動脈組織管腔狹窄嚴(yán)重，內(nèi)膜增厚明顯，中膜彈力纖維層混亂；與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠頸動脈組織內(nèi)膜增厚現(xiàn)象得到緩解，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，其中高劑量組效果較好，見圖2。

圖2 各組大鼠頸動脈組織顯微鏡下圖像（HE 染色；×200；A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

2.4 各組大鼠頸動脈組織α-SMA 濃度比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動脈組織α-SMA表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，氯吡格雷各劑量組大鼠頸動脈組織α-SMA 表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠頸動脈組織α-SMA 濃度免疫組化檢測結(jié)果比較（免疫組化染色；×200；A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

圖4 各組大鼠頸動脈組織中α-SMA相對濃度比較柱狀圖

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠頸動脈組織SDF-1α/CXCR4 通路蛋白以及α-SMA 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠頸動脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，氯吡格雷低、中、高劑量組大鼠頸動脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見圖5、表2。

表2 各組大鼠頸動脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA蛋白相對表達(dá)量比較 ［n=8，］

表2 各組大鼠頸動脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA蛋白相對表達(dá)量比較 ［n=8，］

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯吡格雷低劑量組比較，cP＜0.05；與氯吡格雷中劑量組比較，dP＜0.05

圖5 各組大鼠頸動脈組織SDF-1α、CXCR4、α-SMA 蛋白相對表達(dá)量比較（A 為假手術(shù)組；B 為造模組；C 為氯吡格雷低劑量組；D 為氯吡格雷中劑量組；E 為氯吡格雷高劑量組）

3 討論

頸動脈狹窄主要是動脈血管中出現(xiàn)粥樣斑塊，斑塊不穩(wěn)定、機體炎癥反應(yīng)等均為頸動脈狹窄發(fā)生的不良因素，嚴(yán)重時會引起血管閉塞，造成腦部缺血、缺血性腦卒中、血管性認(rèn)知障礙等不良疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危害患者的生命健康［12-13］。建立一種重復(fù)性好、狹窄程度易控制、操作簡單的動物模型對于研究頸動脈狹窄具有重要意義，張羽喬等［14］采用“針控線栓法”構(gòu)建大鼠頸動脈狹窄模型，構(gòu)建的動物模型成功率較高且較穩(wěn)定。本研究采用此方法構(gòu)建頸動脈狹窄動物模型，結(jié)果顯示，造模組大鼠新生內(nèi)膜顯著增厚，頸動脈腔管面積顯著減小，血清炎癥因子（CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2）濃度顯著升高，與王鴻康等［15］研究結(jié)果一致，表明大鼠頸動脈狹窄模型構(gòu)建成功。頸動脈狹窄可造成血管內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，而大量炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子的過度釋放對于血管損傷后的內(nèi)膜增生具有不利影響［15］。

針對頸動脈狹窄患者，應(yīng)當(dāng)采用血管內(nèi)介入治療，但由于血管內(nèi)治療技術(shù)水平有限、術(shù)后并發(fā)癥較多、治療費用偏高等因素不易被患者接受，因此抗血小板聚集類藥物仍是臨床中常用的治療藥物。氯吡格雷是第二代口服噻吩吡啶，具有抑制血小板聚集、抗炎等多種生物學(xué)作用［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷還具有抗神經(jīng)元凋亡、緩解缺血性腦卒中等作用［18］，對頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)后復(fù)發(fā)及臨床缺血事件的發(fā)生率具有一定的降低作用［19］。氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林可顯著抑制頸動脈狹窄患者血小板活化、抑制炎癥因子釋放、增強斑塊穩(wěn)定性等，并顯著改善患者的預(yù)后情況［20］。α-SMA可與血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）特異性結(jié)合，測定血管組織中α-SMA 表達(dá)可反映VSMCs 的分布及濃度，當(dāng)血管受到損傷時可引起VSMCs 的惡性增殖，進而造成血管腔狹窄［21］。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清CRP、MCP-1、TGF-β、PGE2濃度顯著降低，頸動脈組織內(nèi)膜增厚現(xiàn)象得到緩解，頸動脈組織α-SMA 表達(dá)降低，提示氯吡格雷可顯著抑制頸動脈狹窄、大鼠機體炎癥反應(yīng)及VSMCs 的惡性增殖，對于頸動脈狹窄大鼠具有一定的緩解作用，但其作用機制仍不清晰。

SDF-1 主要有SDF-1α、SDF-1β 兩種形式，主要以SDF-1α 為主，SDF-1α 屬于CXC 類趨化因子，在心臟、肝臟、小腸等組織中均有表達(dá)。CXCR4為CXC 類趨化因子受體，是SDF-1α 的特異性受體，SDF-1α/CXCR4 軸與細(xì)胞運動、細(xì)胞黏附、血管生成、血管生長等生物學(xué)行為密切相關(guān)［22-23］。資料顯示，當(dāng)機體組織受到損傷時，SDF-1α 的表達(dá)增加，進而激活CXCR4，使得炎癥細(xì)胞因子向受損部位聚集，同時促進炎癥因子對受損組織的浸潤，進而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙及VSMCs 增殖異常［24］。研究發(fā)現(xiàn)SDF-1α、CXCR4 在頸動脈粥樣硬化大鼠血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)［25］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷聯(lián)合銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對治療急性腦梗死療效顯著，能有效抑制炎癥反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展［26］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠機體炎癥反應(yīng)升高的同時，血清SDF-1α濃度、頸動脈組織中SDF-1α、CXCR4 蛋白表達(dá)水平也顯著升高，提示SDF-1α/CXCR4 軸可能參與了頸動脈新生內(nèi)膜的增厚過程，與頸動脈狹窄密切相關(guān)；與模型組大鼠相比，氯吡格雷各劑量組大鼠血清SDF-1α 濃度、頸動脈組織中SDF-1α、CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明氯吡格雷減輕炎癥反應(yīng)，緩解頸動脈內(nèi)膜組織增厚，與其降低SDF-1α、CXCR4 蛋白表達(dá)水平的作用機制有關(guān)，提示氯吡格雷可能通過抑制SDF-1α/CXCR4 通路，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮緩解頸動脈狹窄作用。

綜上所述，氯吡格雷可顯著緩解頸動脈狹窄大鼠的炎癥反應(yīng)及頸動脈內(nèi)膜增厚現(xiàn)象，可能是通過抑制SDF-1α/CXCR4 通路實現(xiàn)的，但氯吡格雷作用機制及頸動脈狹窄發(fā)病機制復(fù)雜，氯吡格雷是否通過其他途徑發(fā)揮作用仍不清晰，因此仍需深入研究。