張 領(lǐng)，段麗穎，武 倩

（河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/ 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

熊果酸（ursolic acid，UA）別名烏索酸、烏蘇酸，是從杜鵑花科熊果中提取的一種五環(huán)三萜類化合物，具有抗菌[1]、護肺[2]、保肝[3]、降血糖[4]、調(diào)血脂[5]等多種生理活性，和誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡[6]、抗腦瘤[7]、抗癌[8]、治療重癥肌無力[9]、抗增殖活性[10]的作用。另外，UA具有明顯的抗氧化功能[11]，是一種較強的抗氧化劑，對人體的抗衰老、皮膚祛斑、祛色素都有積極作用。UA水溶性差，25℃時水中溶解度僅為7.16 μg/L[12]，生物利用度低。現(xiàn)有的提高UA溶出度和提高生物利用度的制劑技術(shù)有自微乳凍干制劑[13]、納米脂質(zhì)體[14]、固體分散體等。其中固體分散體由于工藝簡單，是常用于提高藥物的溶出度和生物利用度的手段之一。文獻報道有關(guān)熊果酸固體分散體（ursolic acid solid dispersions，UA-SD）的研究常采用載體如泊洛沙姆188[15]、PVP K30[16]等，近年來，隨著科技的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的輔料，如聚乙烯已內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）等，具有廣泛的應(yīng)用前景。其中，Soluplus具有良好的抑晶、增溶效果，為固體分散體的制備提供了更多選擇。本課題優(yōu)選新型載體材料，制備UA-SD，以提高藥物的溶出度、生物利用度。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），AG-254電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），RC806溶出試驗儀（天津天大天發(fā)公司），JA-2003電子天平（奧豪斯儀器有限公司），GT16-3型高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司），SHZ-DCZZZ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），HZQ-C氣浴恒溫振蕩器（天壇市天竟實驗儀器廠），HF型熱風循環(huán)干燥箱（吳江華飛電熱設(shè)備有限公司），KQ2200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司），DSC250熱分析儀（美國TA儀器），D8-Advance型X射線衍射儀（德國 Bruker公司），Nicolet380紅外光譜儀（美國熱電集團），Nano SEM430掃描電鏡（美國FEI公司）

1.2 試劑

熊果酸原料藥（寶雞市金臺區(qū)科瑞儀器經(jīng)銷部，批號：HU023144198），熊果酸對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：19011506），Soluplus（北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司），TPGS（湖北鴻運隆生物科技有限公司），PVP VA64（德國BASF公司），PEG 6000（北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司），SDS（天津市光復(fù)精細化工研究），檸檬酸（天津市標準科技有限公司），磷酸氫二鈉（天津歐博凱化工有限公司），磷酸二氫鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（天津歐博凱化工有限公司），濃鹽酸（北京化工廠），甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Technology Inc，USA），磷酸（色譜純，F(xiàn)isher Technology Inc，USA），無水乙酸鈉（天津市佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司）

2 UA的含量測定方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（150×4.6mm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水（90：10），流速為1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10μl；檢測波長：210nm。

2.2 溶液的配制

對照品溶液的配制：精密稱取UA對照品約3mg，置容量瓶中，加甲醇，超聲，放冷，定容，即得。

供試品溶液的配制：取樣品，加入甲醇，超聲，放冷，定容，即制得供試品溶液。

2.3 標準曲線的繪制

精密量取對照品溶液，注入HPLC測定，以峰面積對UA濃度做圖，得方程：Y= 4.2989X + 2.6741，R2= 0.9994，線性范圍：8~102μg/ml。

2.4 回收率實驗

精密吸取2.2項下UA對照品溶液，加入處方比例輔料，用適量甲醇稀釋得低、中、高3種濃度，每個濃度平行實驗3次，按2.1色譜條件進行測定，計算回收率。結(jié)果顯示，UA樣品的回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，RSD值均小于2%，符合標準。見表1。

表1 UA樣品回收率

3 結(jié)果

3.1 抑晶實驗

3.1.1 實驗條件 選用介質(zhì)為0.2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）水溶液，900ml，溫度37℃，轉(zhuǎn)速50r/min，槳法。

3.1.2 實驗方法 精密稱取Soluplus、PVPVA64、TPGS三種輔料各360mg，置于900ml 0.2%SDS中。精密稱取UA原料藥34mg，用4ml甲醇超聲溶解，制得UA原料藥溶液。將UA原料藥溶液加入溶出介質(zhì)中，在水中形成超飽和溶液，于5、10、15、30、45、60、90、120min分別取樣5ml，迅速補充同溫空白介質(zhì)5ml。樣品過0.45μm微孔濾膜后，用HPLC檢測，繪制不同載體對UA超飽和溶液析晶抑制效果曲線圖。結(jié)果顯示，三種載體對UA超飽和溶液的析晶均有一定抑制作用，但Soluplus的抑晶效果最為突出，故選用Soluplus制備UA-SD。見圖1。

圖1 不同載體對UA超飽和溶液析晶的抑制作用

3.2 UA-SD的制備

3.2.1 UA-SD制備方法 采用溶劑法制備UA-SD，按照1：3、1：5、1：7、1：9、1：11、1：15的比例，精密稱取UA原料藥與Soluplus，將UA原料藥與載體分別溶于適量無水乙醇中，超聲至完全溶解，將載體的乙醇溶液加入原料藥的乙醇溶液中，超聲10min，于50℃減壓回收乙醇，得到白色固體后，置于干燥器內(nèi)24h，取出，研細，即得到不同比例的UASD。

3.2.2 UA物理混合物的制備方法 精密稱取適量UA原料藥與Soluplus，采用攪拌的方法將2者混勻，制備載藥比1：3、1：5、1：7、1：9、1：11、1：15的UA物理混合物。

3.3 溶出實驗

參照《中國藥典》四部，槳法，100r/min，37℃，溶出介質(zhì)為0.2%SDS水溶液，900ml。樣品分別為：UA原料藥25mg、不同載藥比的UA-SD、不同比例的物理混合物（含UA25mg）。于5、10、15、30、45、60、120min分別取樣5ml，同時補充同溫溶出介質(zhì)5ml，0.45μm微孔濾膜后，注入HPLC檢測，繪制溶出曲線。結(jié)果顯示，120min時，UA原料藥的累積溶出度為10.1%，UA-SD1：3時累積溶出度為36.5%、UA-SD1：5時累積溶出度為39.7%、UA-SD1：7時累積溶出度為48.6%、UA-SD1：9時累積溶出度為59.0%、UA-SD1：11時累積溶出度為102.7%、UA-SD1：15時累積溶出度為87%、PM1：3時累積溶出度為6.67%、PM1：5時累積溶出度為6.73%、PM1：7時累積溶出度為5.60%、PM1：9時累積溶出度為5.75%、PM1：11時累積溶出度為4.74%、PM1：15時累積溶出度為6.32%。與原料藥相比，物理混合物在120 min時累積溶出度無明顯增加，而UA-SD在120min累積溶出度明顯增高，其中1：11和1：15的SD增加最為明顯，故選擇兩個比例的樣品進行表征。見圖2。

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圖2 不同樣品的溶出曲線

3.4 溶解度實驗

3.4.1 介質(zhì)的配制 按照《中國藥典》2015版溶液配制方法分別配制pH1.2、4.5、6.8、7.2的緩沖溶液，以及加入0.2%

SDS的 pH1.2、4.5、6.8、7.2緩沖溶液以及0.2% SDS水溶液。共10種介質(zhì)。

3.4.2 溶解度實驗 在6.1配制的10種介質(zhì)中分別加入過量UA原料藥、不同載藥比UA-SD、物理混合物。將樣品放入37℃恒溫振蕩箱中振蕩48h，經(jīng)13000r/min離心20min后，過0.45μm濾膜，注入HPLC進行檢測。結(jié)果顯示，介質(zhì)中加入0.2%SDS可有效增加樣品的溶解度，同時UA-SD在不同介質(zhì)中的溶解度大于物理混合物的溶解度，并且隨著載藥比的不同，溶解度增加程度不同。見表2、圖3。

表2 UA原料藥在水及0.2%SDS水中的溶解度（μg/ml）

圖3 不同載藥比例UA-SD、物理混合物在不同介質(zhì)中的溶解度

3.5 理化性質(zhì)表征

3.5.1 掃描電鏡法（scanning electron microscope, SEM） 取適量樣品，用掃描電鏡對樣品進行分析。測試條件：電流10 mA，加速電壓5.0 kV。將SEM圖放大100倍時觀察圖像，見圖4。

圖4 SEM圖譜

由圖4A可知，UA原料藥為不規(guī)則棱柱形晶體，由圖4B可知，載體Soluplus近似球狀，由圖4C、4E可知，1：11、1：15的UA-SD為不規(guī)則的團塊狀，由圖4D、4F可知，1：11、1：15的UA物理混合物為Soluplus球狀載體上粘附有UA原料藥。

3.5.2 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry,DSC） 選用DSC250熱分析儀進行分析。測試條件：掃描范圍為25 ℃～300 ℃，升溫速度為10 K/min，見圖5。

圖5 DSC圖譜

由圖5可知，UA原料藥的晶體特征吸熱峰出現(xiàn)在285℃左右，載體Soluplus的吸熱峰不明顯，在75℃左右，為一寬、鈍的吸熱峰。而UA物理混合物中并未出現(xiàn)UA的吸熱峰，僅存在載體的特征吸熱峰，可能是載體融化時導(dǎo)致藥物溶解在載體中，進而未出現(xiàn)UA的特征吸熱峰。UA-SD中也僅有較弱的載體特征吸熱峰，未出現(xiàn)UA的特征吸熱峰。

3.5.3 X射線衍射法（X-Ray Diffraction， XRD） 取適量樣品，進行X射線衍射分析。儀器工作電壓：40kV，工作電流：40mA，Cu靶。實驗條件：2θ掃描范圍3~50度，步長0.02度/步，見圖6。

圖6 XRD圖譜

由圖6可知，UA原料藥5.47°、7.77°、10.87°、12.60°、13.52°、14.46°、16.76°、19.03°、20.35°、21.15°、22.48°、26.76°等處存在較明顯的特征衍射峰，而載體Soluplus不存在上述衍射峰；UA物理混合物中，盡管UA的某些特征衍射峰被掩蓋，但在7.77°、10.87°、14.46°、16.87°仍可觀察到變?nèi)醯腢A特征衍射峰的存在，表明UA被載體稀釋，特征衍射峰減弱，但仍以晶體形式存在；而在UA-SD中UA的特征衍射峰則完全消失，表明UA在SD中可能以無定形形式存在。

3.5.4 傅里葉變換紅外光譜法(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 取樣品適量，與適量的KBr研磨、混合均勻后壓片，在400～4000 cm-1波長范圍內(nèi)進行傅里葉紅外光譜掃描，記錄相應(yīng)譜圖，見圖7。

圖7 FT-IR圖譜

由圖7可知，UA原料藥中存在2個特征峰，3469cm-1處存在較強的-OH峰，1709cm-1處存在較強的C=O峰。載體Soluplus在1629cm-1處存在一較為明顯的特征峰，可區(qū)別于UA原料藥。UA-SD中，-OH峰由3469cm-1移向低頻區(qū)3417cm-1，C=O峰由1709cm-1移向高頻區(qū)1725cm-1，峰強度減弱，同時保留了Soluplus在1629cm-1處的特征峰，UA物理混合物中未出現(xiàn)新峰，可以認為是UA原料藥與載體的簡單加和。

3.6 工藝驗證

根據(jù)3.2.1項下的實驗方法，制備UA-SD，平行制備3份。根據(jù)3.3項下實驗方法，對每份UA-SD進行溶出實驗，平行3份。經(jīng)HPLC檢測，繪制累積溶出曲線，見圖8。

圖8 工藝驗證UA-SD（1：11）溶出曲線

由圖8可知，3批UA-SD1：11累積溶出度在120min時分別達到101%、99%、101%，與3.3項溶出實驗結(jié)果無較大差異，即可證明此工藝適用于本實驗。

4 討論

UA具有溶解度小、溶出速度慢的特點，故本研究用溶劑法將其制備成固體分散體以提高UA的溶解、溶出度。固體分散體中，載體抑制了被高度分散的粒子聚集趨勢（抑晶性），且載體本身可促進藥物的溶出。由于UA在無水乙醇中溶解度較好，可以減少實驗中溶劑用量，且無水乙醇無毒性，本研究在固體分散體的制備過程中，選用了無水乙醇作為溶劑。實驗操作過程中注意事項有：抑晶實驗時，注意樣品的保溫，防止因溫度變化導(dǎo)致藥物析晶，影響檢測結(jié)果；溶出度實驗時，注意防止藥物粘附在溶出杯壁及槳上，否則影響檢測結(jié)果；溶解度實驗時，注意觀察不同pH緩沖液中是否出現(xiàn)析晶，以免影響實驗結(jié)果。

由實驗結(jié)果可以得出，UA-SD在120min時累積溶出度為102%，遠遠高于UA原料藥及物理混合物的累積溶出度。可能因為UA原料藥在SD中以無定形狀態(tài)存在，分散度增加，故累積溶出度增加。在一定的范圍內(nèi)，固體分散體的累積溶出度隨載藥比的增大而增加。由此看出，固體分散體成功使原藥物的溶解度大大提高，改善了其溶出速率。通過理化性質(zhì)表征結(jié)果顯示，F(xiàn)T-IR中峰形的變化提示UA與載體之間形成了氫鍵。UA原料藥以無定形狀態(tài)分布在載體中，UA原料藥的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，故累積溶出度得到了提高。

綜上所述，以Soluplus為載體制備UA-SD,可明顯提高UA的體外溶出度。