李昊晨，耿 靜，張子威，李素婷

（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)系；3.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

宮頸癌是全球婦女排名第四的?；及┌Y，據(jù)估計2018年有57萬個新發(fā)病例，全球31.1萬名婦女死于宮頸癌，其中90%發(fā)生在低收入和中等收入國家[1]。在中國，宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)癌癥[2]。2013年，年齡標準化發(fā)病率為每100000人10.3例[3]，5年相對存活率為45.4%[4]。近年來，全球女性宮頸癌的平均發(fā)病率有所下降，但是預(yù)計到2030年，每年被確診的患者將超過70萬例[5]。隨著人均壽命的延長，診斷、治療方法的發(fā)展，宮頸癌的5年生存率較高，預(yù)后研究卻相對較少[6]。從分子層面找出與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸相關(guān)的基因，對該疾病相關(guān)診療具有重大意義。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)（weighted correlation network analysis，WGCNA）分析是通過構(gòu)建無尺度基因共表達網(wǎng)絡(luò)，從而分析各個基因模塊以及臨床癥狀與基因模塊間的相關(guān)聯(lián)系的方法[7]。該方法在胃癌[8,9]、口腔鱗狀細胞癌[10]、肝癌[11]等疾病的研究中成功篩選出疾病相關(guān)基因。本研究采用WGCNA分析的方法對宮頸癌細胞進行分析并篩選關(guān)鍵基因。

1 材料和方法

1.1 臨床數(shù)據(jù)和表達數(shù)據(jù)的獲得及預(yù)處理

從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫獲取登錄號為GSE63514的宮頸癌基因表達數(shù)據(jù)。使用R對數(shù)據(jù)進行初步的整理后獲得癌癥基因表達矩陣。然后根據(jù)

[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0

Array平臺注釋信息，將原始數(shù)據(jù)中的Ensembl ID轉(zhuǎn)換成與其對應(yīng)的基因名。

1.2 差異基因的篩選

使用R（https://www.r-project.org/）的“edgeR”包對數(shù)據(jù)進行處理，對有多個表達數(shù)據(jù)的基因求平均值。獲得的表達矩陣用CPM矯正后再將所有樣品里表達量都很低的基因從表達矩陣中剔除。然后用“l(fā)imma”包對表達矩陣進行差異分析[12]。差異表達基因的篩選條件設(shè)定為logFC>0.05和adj.P.Val>0.05。用FDR法對差異分析的結(jié)果進行校正。矯正后最終得到的差異基因用于后續(xù)分析。

1.3 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊保守性分析

在R中使用軟件包“WGCNA”構(gòu)建無尺度基因共表達網(wǎng)絡(luò)[7,13]。檢查確認表達矩陣數(shù)據(jù)中無缺失值后首先對樣品進行聚類，將與其他樣品差異過大的離群樣品刪除。選出合適的軟閾值是構(gòu)建出的網(wǎng)絡(luò)更符合無尺度網(wǎng)絡(luò)標準。計算各基因間的鄰接值并構(gòu)建出拓撲重疊矩陣。根據(jù)之前選定的軟閾值，將所有基因劃分為至少包含50個基因的模塊，用動態(tài)樹剪切法將相關(guān)性小于0.25的模塊合并，將所有基因劃分為數(shù)個模塊，分別計算每個模塊和正常組織與癌組織的相關(guān)性，挑選出相關(guān)性絕對值最大的模塊并用分析其保守性[14]。經(jīng)分析該模塊的Preservationc Zsumary評分高于10分，則認為該模塊基因保守性較高，具有研究意義，可以進行后續(xù)分析。取該模塊基因和差異表達基因以及TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取的CESC表達數(shù)據(jù)的WGCNA結(jié)果和差異分析結(jié)果的交集。則交集內(nèi)的基因的表達量變化與組織的癌變相關(guān)性最大。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

使用string（https://www.string-db.org/）在線將之前獲得的交集基因構(gòu)建成PPI共表達網(wǎng)絡(luò)[15]，互作關(guān)系評分設(shè)定為0.9然后輸出PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape（https://cytoscape.org/）打開在string構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape內(nèi)的“CytoHubba”包從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩選出模塊中的前十個核心基因[16]。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

使用R包“org.Hs.eg.db”將基因名轉(zhuǎn)化為entrezlID。然后使用R包“clusterProfiler”,“org.Hs.eg.db”,“enrichplot”和“ggplot2”包進行基因本體論分析GO（Gene Ontology）[17]和京都基因和基因組百科全書富集分析KEGG富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[18]。

1.6 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線將模塊基因富集到調(diào)控因子上。使用perl腳本整理轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并使用Cytoscape繪制可視化的共表達網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 生存分析和無病生存期分析

通過GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）在線進行生存分析[19]。從結(jié)果中篩選出P.Value<0.05的基因，這些差異表達的基因被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。然后再用Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/login.html）數(shù)據(jù)庫對差異表達具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義的基因進行驗證。

1.8 臨床相關(guān)性分析

在GSE63514（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE63514）表達數(shù)據(jù)中有宮頸上皮內(nèi)腫瘤的低度病變、中度病變和高度病變以及宮頸鱗狀上皮癌幾種狀態(tài)。結(jié)合核心基因的表達數(shù)據(jù)判斷核心基因與這幾種性狀間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選

下載登錄號為GSE63514的宮頸癌基因表達數(shù)據(jù)中共128例樣本，其中24例正常樣本，104例腫瘤樣本。腫瘤樣本中包括40例高分化度樣本，22例中分化度樣本，14例中分化度樣本。為了篩選出可能與癌癥相關(guān)聯(lián)的基因，我們對所有基因進行了差異分析，結(jié)果顯示，GSE63514數(shù)據(jù)集21654個基因中，431個為上調(diào)基因，360個為下調(diào)基因，共計791個存在差異表達的基因。繪制差異基因的火山圖（圖1A），挑選差異最顯著的50個基因和下調(diào)最顯著的50個基因繪制熱圖（圖1B）。

圖1 基因表達差異分析結(jié)果

2.2 基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊保守性分析

為了從791個表達存在差異的基因中篩選出和癌癥相關(guān)性更強的基因，我們將矯正過后的基因表達數(shù)據(jù)用于WGCNA分析。先將基因進行聚類（圖2A）。分析結(jié)果顯示當(dāng)選擇鄰接矩陣的軟閾值為4時網(wǎng)絡(luò)中的基因之間鏈接最符合無尺度網(wǎng)絡(luò)分布（圖2B）。所以設(shè)定power值為4進而構(gòu)建出18個基因模塊以及分層聚類樹。然后以相似系數(shù)為0.25為標準對聚類樹進行剪切。最終獲得17個基因模塊（圖2C）。在這些模塊中名為MEblack的黑色模塊與宮頸癌的相關(guān)性最強（圖2D）。說明MEblack模塊中的基因和癌癥相關(guān)性更強。對所有模塊進行保守性分析（圖2E），結(jié)果顯示MEblack模塊保守性大于10，說明該模塊內(nèi)基因在腫瘤細胞中表達狀況穩(wěn)定，因此該模塊具有進一步分析的意義。為了驗證WGCNA分析的結(jié)果，下載TCGA數(shù)據(jù)庫中CESC的表達數(shù)據(jù)，其中包括3例正常樣本和306例腫瘤樣本。一同進行差異分析和WGCNA分析后取分析結(jié)果的交集。最后共同篩選出125個差異基因。這些基因經(jīng)過數(shù)據(jù)集GSE63514和TCGA的CESC表達數(shù)據(jù)雙重驗證，可能為與宮頸癌高度相關(guān)的基因。

圖2 WGCNA共表達分析結(jié)果

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選

為了從上述125個基因中篩選出最重要的核心基因，我們將這些基因利用String構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖3A），將結(jié)果利用Cytoscape進行展示，并使用Cytoscape軟件包“CytoHubba”篩選出互作網(wǎng)絡(luò)中心的10個hub基因（圖3B）。這10個基因是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心，它們不僅自身的表達量會在腫瘤細胞中發(fā)生顯著的變化，還與大多數(shù)其他存在表達差異的基因之間具有互作關(guān)系。

圖3 蛋白共表達網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析

為了解差異表達基因的基本表達情況及功能，我們對125個交集基因進行GO富集分析。其中GO富集分析的結(jié)果（圖4A）顯示交集基因主要富集在染色體區(qū)域，多參與細胞器分裂，催化微管的結(jié)合。KEGG分析的結(jié)果（圖4B）顯示交集基因的作用多富集在細胞周期。該結(jié)果提示，這些基因的差異表達可能引起細胞復(fù)制分裂的改變，從而引起癌癥的發(fā)生。

圖4 GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果

2.5 轉(zhuǎn)錄因子共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進一步驗證交集基因和癌癥的關(guān)系，我們將模塊基因上傳到DAVID后經(jīng)過分析獲得轉(zhuǎn)錄因子共表達數(shù)據(jù)，然后將數(shù)據(jù)整理后導(dǎo)入到Cytosscape中，修飾過后獲得轉(zhuǎn)錄因子共表達網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。其中E2F和NFY是調(diào)控差異基因表達的兩個主要的轉(zhuǎn)錄因子，圖中圍繞這兩個轉(zhuǎn)錄因子的即是受他們調(diào)控的基因。底色為藍色的是在宮頸癌中低表達的基因，底色為紅色的是高表達的基因。轉(zhuǎn)錄因子E2F是控制細胞周期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，它的異常表達會誘導(dǎo)癌癥的產(chǎn)生[20]。NFY則與細胞的增殖相關(guān)，是癌細胞增殖的標志[21]。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

2.6 生存分析及無病生存分析

為了驗證hub基因與是否在臨床上確實影響宮頸癌的預(yù)后，我們在GEPIA2上對篩選出的10個hub基因進行生存分析（OS）（圖6）。結(jié)果顯示CDC45和MCM2與患者的生存顯著相關(guān)。然后利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對CDC45和MCM2分析結(jié)果進行驗證，結(jié)果提示CDC45和MCM2的表達和宮頸癌的預(yù)后顯著相關(guān)。

圖6 核心基因生存分析結(jié)果

2.7 臨床相關(guān)性分析

為了驗證CDC45和MCM2與臨床分級之間的關(guān)系，我們從GSE63514中提取患者的臨床信息，然后用R分析CDC45和MCM2的表達量和患者臨床癥狀之間的相關(guān)性（圖7）。如圖所示為CDC45在宮頸上皮內(nèi)腫瘤低，中，高三種程度的分化中均有顯著差異。MCM2在宮頸上皮內(nèi)腫瘤的高度分化細胞中，表達量顯著高于中、低級分化細胞。這一結(jié)果提示我們CDC45和MCM2的表達量和癌細胞的分化程度之間存在關(guān)系。

圖7 臨床性狀的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

本研究通過有別于傳統(tǒng)差異分析的構(gòu)建WGCNA共表達網(wǎng)絡(luò)的方法，篩選出FCDC45、MCM2、CDC6、

CHEK1、CDT1、CDC7、MCM10、GMNN、BUB1B、MAD2L1等10個核心基因。然后通過GO富集分析、KEGG富集分析、轉(zhuǎn)錄因子富集分析、生存分析和臨床相關(guān)分析等多種分析手段，逐步驗證了CDC45和MCM2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著顯著的影響。

CDC45是真核DNA15解旋酶的重要組成部分，對DNA的復(fù)制有重大影響。它會與單鏈DNA結(jié)合蛋白（replication protein A，RPA）結(jié)合并引導(dǎo)RPA和單鏈DNA結(jié)合[22]。而且有研究表明，CDC45是維持延伸過程中復(fù)制叉正常運作的重要蛋白。當(dāng)CDC45上調(diào)時會導(dǎo)致細胞凋亡[23

]。根據(jù)本研究中GO分析的結(jié)果指出，CDC45主要富集在復(fù)制叉，在DNA復(fù)制的過程中發(fā)揮著引導(dǎo)蛋白與DNA結(jié)合的作用。KEGG富集分析的結(jié)果顯示CDC45會富集在細胞周期。轉(zhuǎn)錄因子共表達網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示CDC45會受NFY和E2F的調(diào)控影響。其中NFY驅(qū)動細胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，是增殖調(diào)控的關(guān)鍵角色。高表達與癌癥相關(guān)[21]。E2F是控制細胞增殖的關(guān)鍵，它和RB口袋蛋白家族、MuvB復(fù)合物以及B-MYB和FOXM1調(diào)控著與細胞周期相關(guān)基因的表達，其異常表達與癌癥相關(guān)[20]，在乳腺癌，前列腺癌，肝癌，消化系統(tǒng)癌癥及視網(wǎng)膜母細胞瘤等多種癌癥組織中有特異性表達[24-28]。受NFY和E2F所調(diào)控的CDC45也與宮頸癌之間存在關(guān)聯(lián)。

本研究中生存分析的結(jié)果顯示，CDC45的高表達與較長的生存期顯著相關(guān)，與文獻中所描述的CDC45的高表達會誘導(dǎo)細胞更快凋亡的結(jié)論相符[21]。臨床分析結(jié)果顯示，CDC45的表達量在不同分化程度癌細胞中均有顯著差異，分化程度越低表達量越低。這種現(xiàn)象與生存分析的結(jié)果一致。

MCM2是MCM家族中的一員。由MCM2參與所組成的MCM2-7復(fù)合體與細胞周期和DNA復(fù)制相關(guān)，在DNA復(fù)制的起點驅(qū)動DNA解旋。MCM的磷酸化與DNA復(fù)制以及細胞循環(huán)進展和檢查點響應(yīng)相關(guān)[29]。在癌癥方面，有研究表明MCM與細胞周期進程，基因組穩(wěn)定性相關(guān)，其磷酸化異常與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[30]。在肺癌等共14種癌細胞中MCM2都有顯著的高表達，且MCM2已經(jīng)作為一種癌癥標志物被用于判斷病情和患者的預(yù)后[31]。

根據(jù)本研究中GO富集分析的結(jié)果顯示，MCM2在細胞周期中有DNA催化活性。KEGG富集分析顯示MCM2參與了細胞周期和DNA復(fù)制過程。轉(zhuǎn)錄因子的富集分析結(jié)果顯示，MCM2的表達受E2F的調(diào)控影響。這也表示MCM2與癌癥的產(chǎn)生發(fā)展相關(guān)。

本研究生存分析結(jié)果顯示，在宮頸癌中，MCM2的高表達會顯著提高患者的預(yù)后效果，這一結(jié)果與其他種類的癌癥研究的結(jié)果不符。究其原因可能是與MCM2的磷酸化會抑制DNA合成[30]。臨床相關(guān)性分析則指出，MCM2在高分化程度的細胞中的表達量顯著高于中低分化程度的細胞，該結(jié)果與生存分析的結(jié)果一致。

此外已有研究提出，MCM2和CDC45都是CMG復(fù)合體的組成部分，該復(fù)合體具有DNA解旋酶功能。CDC45在細胞核中參與DNA的復(fù)制[32]，細胞則會通過60merssDNA與CDC45相互作用來阻止復(fù)制[33]，而CDC45與MCM2和MCM5的是CMG復(fù)合物構(gòu)成的關(guān)鍵[34]。由此我們可以推斷，在宮頸癌中CDC45和MCM2之間的相互作用也會對病情產(chǎn)生影響，其作用機制和作用效果則有待后續(xù)實驗研究。

綜上所述，CDC45和MCM2在宮頸癌中的作用及機制有進一步研究挖掘的價值，CDC45和MCM2的表達量在臨床上對于宮頸癌這一疾病的產(chǎn)生、發(fā)展狀態(tài)的診斷以及預(yù)后結(jié)果的推測也均有一定的參考價值。