謝 銳， 金曉蕾， 周繼鴻， 郭斌煜， 郭景山， 韓志剛

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 呼和浩特 010031； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 河北 保定 071000；3.巴林左旗農(nóng)牧局， 內(nèi)蒙古 赤峰 025450)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是全球種植最為廣泛的塊莖類(lèi)糧食作物之一，因其富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦質(zhì)元素以及膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，也是人類(lèi)飲食中膳食熱量和一些微量元素的重要來(lái)源[1-3]。彩色馬鈴薯是一種特殊的栽培馬鈴薯類(lèi)型，由于富含花青素和類(lèi)胡蘿卜素而使其塊莖的薯皮、薯肉呈現(xiàn)出黃、紅、粉、紫、黑等顏色，另外塊莖中含有多酚、類(lèi)黃酮和維生素C等多種抗氧化活性物質(zhì)，具有抗氧化、降三高、美容等保健功能，因此逐漸被消費(fèi)市場(chǎng)認(rèn)可[4-5]。近些年，彩色馬鈴薯新品種選育成為了研究的熱點(diǎn)，而彩色馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳背景及多樣性等尚不清楚。因此，本研究對(duì)彩色馬鈴薯種質(zhì)資源間遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，為選育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)彩色馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)檢測(cè)遺傳多樣性的方法，不受外界環(huán)境、組織部位或生育時(shí)期等因素的影響，在種質(zhì)資源鑒定上比傳統(tǒng)生化標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記更具鑒別力[6]。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence Related Amplified Polymorphism, SRAP)標(biāo)記，其目標(biāo)是檢測(cè)基因組中開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)的多態(tài)性，相較于RAPD、AFLP、SSR等技術(shù)，SRAP具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、效率高、成本低等特點(diǎn)[7-8]。目前，在彩色馬鈴薯遺傳多樣性研究方面所用的分子標(biāo)記大多為SSR[9-10]和ISSR[11-12]，利用SRAP分子標(biāo)記研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性的研究并不多。本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)收集的24個(gè)彩色馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為內(nèi)蒙古地區(qū)彩色馬鈴薯種質(zhì)資源可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院收集的24份彩色馬鈴薯品種(系)開(kāi)展研究。供試材料信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取及SRAP引物來(lái)源

于苗期采集供試材料幼嫩葉片并用液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存。稱取0.5 g葉片組織，使用TianGen植物DNA提取試劑盒(DP 305)按操作說(shuō)明提取樣品DNA，用1.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)Pezzotti等[13]和Lin等[14]的 SRAP引物序列，隨機(jī)選取正、反向引物各17條，具體信息如表2所示。

1.2.2SRAP-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系：共20 μL，包括2 μL模板DNA(50 ng/μL)，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix(0.1 U/μLTaqDNA聚合酶，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP，反應(yīng)緩沖液)16 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育10 min后4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：采用2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2.0 μL，電泳上槽緩沖液為1×TBE，120 V電壓下電泳1.5 h。

表1 彩色馬鈴薯品種及性狀Table 1 Varieties and traits of color potatoes

1.2.3數(shù)據(jù)分析

利用0/1賦值法將多態(tài)性標(biāo)記轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，即有條帶賦值為“1”，無(wú)條帶賦值為“0”。運(yùn)用Excel 2016軟件整理為“0”“1”數(shù)據(jù)矩陣；運(yùn)用PopGen 1.32軟件計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，包括有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s指數(shù)(I)；運(yùn)用NTSYS PC 2.02 e軟件計(jì)算各彩色馬鈴薯間的遺傳相似系數(shù)(GS)，再利用UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，通過(guò)Tree plot模塊構(gòu)建樹(shù)狀圖、PCA散點(diǎn)分布圖。多態(tài)性信息量值PIC(Polymorphism Index Contents)采用Nei’s多樣性指數(shù)公式獲得：

表2 SRAP引物序列Table 2 SARP primer sequences

注：M為DL 2 000；圖中數(shù)字編號(hào)對(duì)應(yīng)品種(系)與表1相同。下同。圖1 彩色馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis of color potatoes

PICk=1-∑Pi2

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

使用TianGen公司的DNA提取試劑盒提取DNA。結(jié)果表明，試劑盒提取的DNA質(zhì)量好，無(wú)降解，品種間DNA提取量均勻(圖1)，能夠滿足SRAP擴(kuò)增對(duì)供試材料DNA的要求，經(jīng)稀釋后可用于SRAP分析。

2.2 SRAP引物多態(tài)性分析

利用17組SRAP引物(表2)對(duì)24份彩色馬鈴薯的基因組DNA擴(kuò)增，其中有14對(duì)引物可擴(kuò)增出清晰且重復(fù)性好的條帶。利用篩選出的14對(duì)引物組合對(duì)24份彩色馬鈴薯進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表3)，共獲得74個(gè)多態(tài)性條帶，產(chǎn)物大小介于100～500 bp之間。SRAP引物在各種質(zhì)材料間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶為2～8條，每條引物平均擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為5.3條。PIC值的范圍在0.62～0.93之間，平均值為0.86，其中PIC值達(dá)到0.90的引物有7對(duì)，分別為M 3/E 10(0.93)、M 14/Be 7(0.92)、M 2/E 6(0.91)、M 1/E 2(0.9)、M 3/E 9(0.9)、M 11/E 2(0.9)、M 14/E 1(0.9)，以上7對(duì)SRAP引物在品種間表現(xiàn)出良好的多態(tài)性且條帶清晰穩(wěn)定(圖2)，可用于馬鈴薯種質(zhì)間的多樣性分析。PIC值在0.84～0.88之間的引物有5對(duì)，也表現(xiàn)出較好的多態(tài)性；PIC值小于0.8的引物有2對(duì)，分別為M 5/E 10(0.77)、M 3/E 1(0.62)(表3)。

在物種水平，供試24個(gè)彩色馬鈴薯種質(zhì)的有效等位基因數(shù)變幅為1.39～1.89，平均值為1.61；Nei’s遺傳多樣度變幅為0.25～0.47，平均值為0.36；Shannon信息指數(shù)介于0.40～0.66之間，平均值為0.54(表3)，其中M 3/E 9引物組合在以上3個(gè)參數(shù)上均表現(xiàn)為最大，說(shuō)明各種質(zhì)在M 3/E 9擴(kuò)增時(shí)多態(tài)性豐富，同時(shí)也表明供試彩色馬鈴薯種質(zhì)間存在較豐富的遺傳變異。

2.3 聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc計(jì)算24份彩色馬鈴薯的遺傳相似系數(shù)(GS)，并建立矩陣，結(jié)果(表4)表明，24份彩色馬鈴薯種質(zhì)的GS介于0.445 9～0.783 8之間，平均值為0.671 7，說(shuō)明彩色馬鈴薯種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性且存在一定的遺傳差異。其中Sienavodan和C 107相似系數(shù)最大(0.783 8)，表明兩種質(zhì)間遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近。而D 613和252遺傳相似系數(shù)最小(0.445 9)，表明兩者間遺傳差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 引物組合M 2/E 6對(duì)24份彩色馬鈴薯的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Genmic DNA amplification results of primer combination M 2/E 6 to 24 color potatoes

圖3 彩色馬鈴薯UPGMA聚類(lèi)分析Fig.3 UPGMA cluster of color potatoes

表3 SRAP引物組合多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Polymorphic amplification results of SARP primer combinations

利用UPGMA方法對(duì)24份彩色馬鈴薯進(jìn)行聚類(lèi)分析，由圖3可知，在遺傳相似系數(shù)為0.61時(shí)，可將供試彩色馬鈴薯種質(zhì)分為四大類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)群包含7份材料，其中5個(gè)材料為紅皮馬鈴薯，2個(gè)材料為紫皮；第Ⅱ類(lèi)群包含12份材料，其中紅皮黃肉或白肉的有7份，紅皮彩肉的有3份，紫皮的有2份；第Ⅲ類(lèi)群包含2個(gè)品種，為黑金剛和黑美人，薯皮薯肉均為深紫色；第Ⅳ類(lèi)群包含3份材料，均為紫皮紫肉種質(zhì)。

2.4 主成分分析

利用主成分分析(PCA)通過(guò)各種質(zhì)間位置可直觀判斷它們的親緣關(guān)系，種質(zhì)間位置越近表明它們的相似性越高，親緣關(guān)系越近，反之則越遠(yuǎn)?；凇?”“1”矩陣，利用NTsys軟件進(jìn)行主成分分析，形成24份種質(zhì)散點(diǎn)平面分布圖。前3個(gè)解釋總遺傳變異的主成分貢獻(xiàn)率依次為12.91%、9.35%、8.40%，占總遺傳變異的30.66%。從圖4可知，種質(zhì)間有交疊現(xiàn)象，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系較近。

表4 24個(gè)彩色馬鈴薯種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)Table 4 The genetic similarity coefficients among 24 color potatoes germplasms

圖4 彩色馬鈴薯主成分分析Fig.4 Principal component analysis of color potatoes

3 討論與結(jié)論

彩色馬鈴薯是一種特殊的馬鈴薯，新品種選育雖有所成效，但仍面臨資源缺乏、適栽品種較少以及消費(fèi)市場(chǎng)有限等問(wèn)題，使彩色馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展受限。另一方面，馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)狹窄，且收集的種質(zhì)資源由于退化難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確表型鑒定，這在某種程度上限制了彩色馬鈴薯新品種培育和遺傳改良工作的開(kāi)展。分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平直接反映物種的遺傳變異，克服了形態(tài)學(xué)鑒定的困難以及生長(zhǎng)期、環(huán)境的影響，且篩選出的特異性標(biāo)記可作為該品種的分子生物學(xué)性狀[15-16]。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)彩色馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳背景和多樣性研究對(duì)雜交育種工作親本的選配具有重要指導(dǎo)意義。SRAP標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、成本低等優(yōu)點(diǎn)[17]，在各物種遺傳多樣性分析、QTL定位、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面被廣泛應(yīng)用[18-21]。本研究以SRAP分子標(biāo)記技術(shù)探究了24份彩色馬鈴薯種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，14對(duì)引物共擴(kuò)增出74條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出5.3個(gè)多態(tài)性條帶，表明SRAP標(biāo)記適合彩色馬鈴薯遺傳多樣性分析。另外，供試彩色馬鈴薯SRAP引物多態(tài)性信息量平均值為0.86，高于油梨等[22]的多態(tài)性信息量(0.33)，而與忻雅等[23]研究的草莓多態(tài)性信息量(0.91)相當(dāng)，說(shuō)明SRAP-PCR技術(shù)適用于不同植物的遺傳多樣性分析，同時(shí)也表明彩色馬鈴薯在ORFs區(qū)具有豐富的遺傳多態(tài)性。Shannon信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣度(H)是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富度的常用指標(biāo)[24]，在物種水平上，本研究中24份彩色馬鈴薯H(均值)=0.36，I(均值)=0.54，表明其遺傳多樣性水平較豐富。

聚類(lèi)分析與主成分分析是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的有力工具，另外主成分分析更能直觀地反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系，也是對(duì)聚類(lèi)分析的佐證[25]，本研究中24份彩色馬鈴薯資源的遺傳相似系數(shù)平均值為0.61，說(shuō)明其親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。聚類(lèi)樹(shù)狀圖顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.61時(shí)可將材料分為四類(lèi)，其中，第Ⅲ類(lèi)群只有2份材料，黑金剛和黑美人，薯皮薯肉均為深紫色；第Ⅳ類(lèi)群包含3份材料，均為紫皮紫肉種質(zhì)，表明這兩個(gè)類(lèi)群各材料間遺傳背景差異較小。第Ⅰ類(lèi)群、第Ⅱ類(lèi)群皮色肉色都不盡相同，但其遺傳背景較為相似，造成這種現(xiàn)象的主要原因可能是控制色素合成的基因差異較大。進(jìn)一步采用主成分分析，結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果并不完全一致，這可能是與兩種分析方法的計(jì)算原理不同有關(guān)，另外，Ⅲ、Ⅳ類(lèi)群間有重疊現(xiàn)象，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，這可能與雜交育種時(shí)親本較為單一有關(guān)，因此，在常規(guī)雜交育種親本選配時(shí)，應(yīng)把育種目標(biāo)和親本間遺傳差異共同考慮。