張澤鑫，陳祎琦，吳汶豐，黃子怡，林思其，方舒涵，林麗珠，鐘 崇，李 菁

（1. 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 廣州 510405；4. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 長沙 410000）

肝癌是目前威脅人類生命健康的惡性疾病之一。根據病理類型可分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 、肝 內 膽 管 癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）以及混合型癌[1-2]。其中肝細胞癌約占原發(fā)性肝癌的80%[3]（以下簡稱肝癌）?！?020全球癌癥報告》顯示，肝癌在我國發(fā)病數達41萬，約占全國癌癥發(fā)病數的9%。死亡人數約為39.1 萬，為癌癥死亡原因的第二位[4]。由于惡性程度高、早期診斷困難、進展隱匿、高復發(fā)率等因素，肝癌患者總體預后不理想[5-6]。因此，尋找更佳的治療手段及建立預后評價模型具有重要臨床價值。

肝癌歸屬于中醫(yī)的“癥瘕”“肥氣”“積聚”等范疇[7-9]，中醫(yī)認為肝性喜調達惡抑郁。肝失疏泄，臟腑失調，氣滯血瘀，濕熱等病理產物蘊結，漸而成積[10,11]。柴胡疏肝散是疏肝解郁的代表方，其藥物組成包括柴胡、芍藥、香附、川芎、陳皮、枳殼、甘草，諸藥共奏疏肝解郁，活血止痛之功[12-13]。有研究發(fā)現，柴胡疏肝散聯合分子靶向藥可以有效避免肝癌腫瘤的進展和對肝臟的損傷[14]。在肝纖維化方面，尚立芝等進行大鼠模型實驗，發(fā)現柴胡疏肝散具有抗肝纖維化的作用[15-16]。然而，目前對于柴胡疏肝散治療肝癌的分子靶點和機制仍然需要進一步研究。

生物信息學分析用于研究腫瘤的基因表達及作用通路，有助于揭示疾病發(fā)生機制及篩選潛在生物標志物[17-18]。加權基因共表達網絡分析，能通過構建基因網絡以實現基因網絡的可視化，挖掘高度相關的基因模塊[19-20]。結合差異基因表達分析，可以揭示特定疾病的潛在生物標志物[21]。而一致性聚類分析可以將基因根據組學特點分為不同亞型，評估不同亞型的分析結果[22]。因此，通過結合加權共表達分析、差異表達分析和一致性聚類分析結果，能夠多維度識別與疾病發(fā)生發(fā)展高度相關的基因。

此外，網絡藥理學能夠揭示與疾病密切相關的分子靶點[23]，而在此基礎上的分子對接方法基于計算機技術分析分子間相互作用，預測其結合模式及親和力，在分子層面推動疾病基因與藥物靶點的研究[24-25]。

因此，本研究結合了網絡藥理學、分子對接和生物信息學，篩選柴胡疏肝散治療肝癌的核心靶點并研究其相關機制，構建預后評估模型和列線圖，用以評估患者的總體生存情況。

1 材料與方法

1.1 核心靶點的篩選、驗證

1.1.1 TCGA肝癌差異表達基因的鑒定

從 TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了TCGA-LIHC 的表達數據和臨床數據。進一步地根據log|FC|＞1，校正P值＜0.05的標準，對正常肝組織和腫瘤組織進行差異表達分析，以篩選出肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關差異表達基因。

1.1.2 TCGA肝癌加權共表達分析

通過R 語言4.0.1 的WGCNA 包，將基因表達和疾病特征進行了聯合分析，將疾病特征定義為正常組和腫瘤組。在本研究中，根據軟閾值β= 3，我們建立了無標度網絡。通過公式AIJ=|SIJ|β（AIJ：基因I 與基因J之間的鄰接矩陣，SIJ：通過所有基因對的皮爾遜相關性獲得的相似性矩陣，β：軟閾值），并轉換為拓撲重疊矩陣（TOM）及其相關的相似度（1-tom）。為了將相似的表達基因分為不同的共表達模塊，構建了1-tom矩陣的層次聚類樹。

1.1.3 GEO-GSE14502一致性聚類分析

從 GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了GSE14502 的芯片數據和GPL571 平臺數據，使用perl語言對其進行基因符號注釋。一致性聚類分析根據基因之間的不同功能，劃分成不同的聚類模塊。在本研究中，R 語言 4.0.1 的“ConsensusClusterPlus”包被應用于該分析。根據一致性打分結果，確定了2 個聚類模塊，并且將其與正常組織之間進行了差異表達分析。

1.1.4 肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因的鑒定

為了明確參與肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因，使用R 語言4.0.1 的韋恩圖包，對差異表達基因、加權共表達基因（顯著性水平：P值排名靠前的3 個模塊）、一致性聚類分析模塊與正常組織的差異表達基因進行取交集，以獲得肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因。

1.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶點的鑒定

根據口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）＞30%，類藥性( Drug Like，DL)＞0.18 的標準，從 TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和 SymMap 數據庫（http://www.symmap.org/）下載柴胡疏肝散（柴胡、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草、香附）的化合物和靶點，使用perl 語言進行化合物和靶點之間的相互映射，以明確其對應關系。

1.1.6 柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點鑒定

為了鑒定參與肝細胞癌治療的靶點，我們使用R語言4.0.1 的韋恩圖包，對1.1.5.中柴胡疏肝散的所有藥物靶點和肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因進行取交集，以獲得柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點。

1.1.7 柴胡疏肝散治療肝細胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

為了進一步了解柴胡疏肝散治療肝細胞癌涉及的生物學功能和通路，使用在線的metascape 數據庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進 行GO和KEGG功能富集分析。在本研究中，設定分析的物種為“智人”，顯著性水平P值＜0.05。

1.1.8 PPI蛋白互作網絡篩選核心靶點

為了了解柴胡疏肝散治療肝細胞癌的核心靶點，使用在線的metascape 數據庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）構建PPI 蛋白互作網絡。根據核心靶點的相互作用關系以及功能聚類，PPI 蛋白互作網絡將劃分為不同的模塊進行展示。

1.1.9 疾病-藥物-化合物-靶點網絡篩選核心靶點

為了明確柴胡疏肝散治療肝細胞癌的主要化合物和核心靶點，使用cytoscape3.7.2 軟件構建疾病-藥物-化合物-靶點網絡。在本研究中，篩選出了具有靶點作用數目排名前3 的化合物，被認為是治療肝細胞癌的主要化合物。篩選出了具有化合物作用數目排名前10的靶點，被認為是核心靶點。

1.1.10 柴胡疏肝散治療肝癌“病-癥-方/藥”網絡的構建

為了構建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網絡，我們在SymMap 數據庫中導入了柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點，并且保留疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現代醫(yī)學癥狀均有對應關系的點，然后使用cytoscape3.7.2繪制網絡圖。

1.1.11 核心靶點的生存分析

為了探討核心靶點與生存之間是否存在顯著相關，使用TCGA-LIHC 的臨床數據進行KM 生存分析。在本研究中，根據核心靶點的表達量，我們截取了中位數劃分為高低兩組，對秩數檢驗水平＜0.05 被認為具有顯著性意義。

1.2 預后模型及列線圖的構建

1.2.1 單因素cox 分析和LASSO 回歸構建柴胡疏肝散治療肝細胞癌靶點的預后模型

單因素cox 分析是研究單一變量與生存時間，生存狀態(tài)之間的關系，提供自變量與結局變量之間的危險比，用以評估自變量是否對結局變量存在保護或危險作用。在本研究中，單因素cox 分析用以篩選出柴胡疏肝散治療肝細胞癌顯著影響生存的靶點。然后進一步的LASSO 回歸去除了冗雜因素，用柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點構建預后模型。KM 生存分析將模型的評分分為高低兩組，對秩數檢驗＜0.05 被認為具有顯著性意義，并且使用ROC曲線評估了模型1，3，5 年的預測能力，ROC 曲線下面積 AUC＞0.6 被認為具有良好的預測能力。

1.2.2 構建列線圖用以評估患者的總體生存情況

為了評估患者的1，3，5年生存率，使用單因素cox分析篩選預后相關因素，單因素和多因素cox 分析具有顯著性水平的相關因素被認為是獨立的預后危險因素，然后將獨立的預后危險因素用以構建列線圖評估患者的總體生存情況。

1.2.3 藥物敏感性分析和分子對接

為了進一步明確柴胡疏肝散治療肝細胞癌的化合物和靶點的可靠性，使用癌癥藥物敏感性的基因組學數據庫（https://www.cancerrxgene.org/）對核心靶點進行藥物敏感性分析，尋找與靶點密切相關的藥物。然后對柴胡疏肝散治療肝細胞癌的化合物，靶點密切相關的藥物進行分子對接，以評估其之間的結合情況。在 Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）數據庫中下載共晶復合物。隨后，使用Schr?dinger 軟件包中的Protein and Ligand Preparation 模塊在基于OPLS-2005 的力場條件下對蛋白加氫、加電荷和質子化處理，并進行能量優(yōu)化。

1.3 核心基因的免疫組織化學驗證

使用人類蛋白質圖譜數據庫(human protein atlas,HPA)(（https://www.proteinatlas.org/）中的在線工具對肝臟中的正常組織與腫瘤組織之間的ESR1 蛋白質表達水平進行免疫組織化學驗證，比較在正常組織和肝癌組織中核心基因蛋白質的表達水平。

2 結果

2.1 核心靶點的篩選、驗證

2.1.1 TCGA肝癌差異表達基因的識別

通過差異表達分析，篩選出了肝癌差異表達基因2703 個。其中藍色代表下調，粉紅色代表上調；熱圖將正常組和腫瘤組進行了劃分，并且展示了顯著性水平排名前50個差異基因（見補充圖1）。

2.1.2 TCGA肝癌加權共表達基因的鑒定

通過函數pickSoftThreshold 選擇軟閾值β=3 建立了無標度網絡，篩選出了8個加權基因模塊，可以看出紅色、藍色、綠松石色在正常組和腫瘤組之間顯著性水平排名前三，因此被用于后續(xù)的分析（見補充圖1）。

補充圖1 差異表達分析和WGCNA分析。

2.1.3 GEO-GSE14502 一致性聚類分析篩選出核心的模塊基因

通過一致性聚類分析，我們劃分了2個聚類模塊，從圖可以看出，GEO 模塊1 和模塊2 之間能夠被明確的區(qū)別開來，并且當其模塊數目為2 時，內部一致性（cluster consensus）大于0.8，這說明了劃分聚類內部的可靠性（見補充圖2）。

補充圖2 一致性聚類分析

2.1.4 肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因的鑒定

通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，我們將上述的TCGA-LIHC 的差異表達基因，加權共表達基因，GEO_CLUSTER1 和 GEO_CLUSTER2 同 其 正 常 組 織 之間的差異表達基因進行了取交集處理，共得到了890個肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因。

2.1.5 柴胡疏肝散化合物和靶點的鑒定

根據口服生物利用度（Oral B，OB）＞30%，類藥性（Drug L，DL）＞0.18 的標準，共篩選出了160 個化合物，其中柴胡17個，白芍14個，川芎8個，枳殼5個，陳皮5個，甘草92個，香附19個；214個靶點（原1317個靶點，去重后得到214個），其中柴胡276個，白芍62個，川芎19 個，枳殼 52 個，陳皮 107 個，甘草 572 個，香附231個。

2.1.6 柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點鑒定

通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，我們將上述的890個肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因和柴胡疏肝散的214個靶點取交集，共得到了柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點38個。這些靶點將被用于后續(xù)的GO 和KEGG 功能富集分析，單因素cox 分析和LASSO 回歸構建預后模型，以及PPI蛋白互作網絡篩選核心靶點（圖1）。

圖1 肝細胞癌發(fā)生發(fā)展相關基因的鑒定（A）和柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點鑒定（B）。

2.1.7 柴胡疏肝散治療肝細胞癌的GO 和KEGG 功能富集分析

通過在線的metascape數據庫進行GO和KEGG 功能富集分析。條形圖結果顯示，GO 富集分析中，柴胡疏肝散治療肝細胞癌可能與對無機物的反應、類固醇代謝過程和對細胞外刺激的反應有關；KEGG 富集分析中，柴胡疏肝散治療肝細胞癌可能與FOXM1 信號通路有關。并且，我們構建了GO 和KEGG 之間的相互作用網絡，以進一步了解各個生物功能以及通路之間存在的相互作用關系（圖2A、圖2B）。

2.1.8 PPI蛋白互作網絡篩選核心靶點

通過在線的metascape 數據庫進行PPI 蛋白互作網絡分析，根據蛋白之間的相互作用和功能聚類。將38 個靶點進行了劃分，此網絡包括了38 個點，163 條邊，共得到了2 個聚類模塊，分別為PPI 模塊1：GSTM1， CYP1A1， CYP1A2， CYP3A4， SULT1E1，AKR1C3；PPI 模塊2：ESR1，JUN，AR，FOS。這些靶點被認為核心的靶點，將用于后續(xù)的分析（圖3）。

圖3 PPI蛋白互作網絡篩選核心靶點

2.1.9 疾病-藥物-化合物-靶點網絡篩選核心靶點

通過cytoscape3.7.2，我們納入了柴胡舒肝散對肝細胞癌有治療作用的化合物和靶點，構建疾病-藥物-化合物-靶點網絡。此網絡包括了133 個點，347 條邊?？梢钥闯?，PTGS2，AR，CCNA2，CHEK1，ESR1，F7，ADRB2，MAOB，NR3C2，JUN 是與化合物相互作用數目最多的前10 個靶點，來自甘草，香附的MOL000098（槲皮素），來自白芍，柴胡，香附的MOL000422（山奈酚），來自柴胡，香附的MOL000354（異鼠李素）是與靶點相互作用數目最多的前3個化合物（圖4A）。

圖4 疾病-藥物-化合物-靶點網絡篩選核心靶點（4A）和柴胡疏肝散治療肝癌“病-癥-方/藥”網絡（4B）

2.1.10 柴胡疏肝散治療肝癌的“病-證-方/藥”網絡構建

在SymMap 數據庫導入柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點，保留了疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現代醫(yī)學癥狀均有對應關系的點，從而構建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網絡（圖4B）?？梢钥闯?，柴胡疏肝散治療肝郁氣滯證肝癌的網絡，患者可能出現發(fā)熱、頭痛、嘔吐、口干、癥瘕、黃疸等既與少陽證候相關、又與肝癌相關的癥狀。

2.1.11 核心靶點的鑒定與生存分析

為了鑒定最終的核心靶點，通過R 語言4.0.1 的韋恩圖包，將疾病-藥物-化合物-靶點網絡篩選的10 個核心靶點和PPI 蛋白互作網絡篩選的10 個核心靶點進行取交集處理，得到了最終的三個靶點，分別為：ESR1，JUN 和 AR。KM 生存分析顯示，ESR1 和 JUN 基因在生存分析中具有顯著性意義。ESR1 高表達的肝細胞癌患者生存率更高，JUN 基因高表達的肝細胞癌患者生存率更差，其差異具有顯著性意義，對秩數檢驗的P值分別為0.036和0.00069（圖5）。

圖5 核心靶點的鑒定與生存分析

2.2 預后模型及列線圖的構建

2.2.1 單因素cox 分析和LASSO 回歸構建柴胡疏肝散治療肝細胞癌的預后模型

通過對柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點38 個進行單因素cox 分析，結果顯示（圖6A），有18 個基因與生存顯著相關，并且這18個基因危險比都沒有跨越1，這說明了結果良好。進一步使用了18 個基因進行LASSO 回歸去除了冗雜因素，以7 個基因構建了預后模型，其模型公式為：(0.1165)*CCNB1 + (-0.0396)*PON1 + (0.0888)*CHEK1 + (0.0521)*SPP1 + (0.0093)*NQO1 + (0.0102)*SERPINE1 + (0.0012)*IGFBP3。結果顯示，模型的低危險組中位生存期為6.9 個月，高危險組中位生存期為3.1 個月，其差異具有顯著性意義，P=6.71e-07（圖6）。預后模型的ROC曲線計算了AUC面積，分別為1年0.789，3年0.697，5年0.677,這說明了柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點構建的預后模型用以預測患者生存具有良好的效應。

圖6 柴胡疏肝散治療肝細胞癌的預后模型構建

2.2.2 構建列線圖用以評估患者的總體生存情況

結合年齡，性別，TNM分期和ESR1，JUN基因的表達，使用了單因素cox 分析篩選出了預后相關因素，結果顯示ESR1，T，M分期是預后相關因素。進一步的多因素cox 分析結果表明ESR1 和T 分期是獨立的預后危險因素，然后使用ESR1 和T 分期構建了列線圖，用以評估患者的總體生存情況，其C-index 為：0.622（0.555-1），P＜0.001，表 明 了 具 有 良 好 的 預 測 能力（圖7）。

圖7 構建列線圖用以評估患者的總體生存情況

2.2.3 藥物敏感性分析及分子對接

通過癌癥藥物敏感性的基因組學數據庫，我們鑒定了與ESR1 密切相關的兩種藥物，分別為Tamoxifen（他莫昔芬）和Fulvestrant（氟維司群），其IC50 最低分別為 9.29 μL、12.9 μL，AUC 最高分別為 0.987、0.980。這說明了極低劑量的他莫昔芬和氟維司群能對ESR1起到很好的靶向作用，并且此兩者在體內都能很好地進入循環(huán)系統（圖8）。為了驗證活性小分子Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant對蛋白（ESR1）的結合情況。在Protein Data Bank（PDB）數據庫中下載共晶復合物（ESR1 ID: 3ocb）。隨后，使用Schr?dinger軟件包中的Protein and Ligand Preparation 模塊在基于OPLS-2005 的力場條件下對蛋白加氫、加電荷和質子化處理，并進行能量優(yōu)化。從對接結果來看，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1 的結合效果良好。ESR1 的結合能與他莫昔芬、氟維司群非常接近，這也提示了異鼠李素可能成為潛在的ESR1靶向藥物（圖9、表1）。

圖8 ESR1藥物敏感性的IC50及AUC

表1 ESR1 與 Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 的分子對接評分

圖9 ESR1與Isorhamnetin、Tamoxifen和Fulvestrant的分子對接

2.3 免疫組織化學染色結果

通過HPA 數據庫進行免疫組織化學染色，結果顯示，ERS1 表達水平在正常組織中高于腫瘤組織，在腫瘤組織中不能檢測得到（圖10）。這與我們的生存分析一致，進一步說明ESR1 高表達在肝癌中是預后保護的因素。

圖10 正常肝臟組織與肝細胞癌組織中ERS1的蛋白質表達水平

3 討論

肝癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率在我國惡性腫瘤中排名第4 位，死亡率位于惡性腫瘤的第2位[1]，對國民生命健康造成嚴重的威脅。目前肝癌的治療以手術切除為主，有研究報道其5 年復發(fā)率超過70%[26-27]，患者預后情況不佳。柴胡疏肝散源于《景岳全書》[28]，是臨床治療肝郁氣滯的主要方劑。柴胡疏肝散治療肝癌已被廣泛報道，但是其分子機制仍然需要進一步研究。因此，本研究旨在揭示柴胡疏肝散治療肝癌在分子層面的機制以及構建預后模型和列線圖，以期為臨床治療肝癌的進展提供可靠依據。

本研究基于生物信息學分析方法，在TCGA 數據庫中篩選得到肝細胞癌的差異表達基因2703個，加權共表達基因9810 個，在GEO 數據庫中獲得GEO 模塊差異表達基因1 4404 個，GEO 模塊差異表達基因2 5320 個。將上述四個模塊取交集得到與肝細胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關基因890 個。從TCMSP 數據庫得到柴胡疏肝散靶點的214 個，將柴胡疏肝散的靶點與肝細胞癌發(fā)生密切相關的基因進行取交集處理，得到藥物-疾病共同靶點38個。

為了研究柴胡疏肝散治療肝癌靶點的作用機制，對篩選出的38 個藥物-疾病靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。GO 功能富集結果顯示，柴胡疏肝散治療肝癌可能與對無機物的反應、類固醇代謝過程及對細胞外刺激反應等有關。KEGG 通路富集分析結果顯示，柴胡疏肝散治療肝癌可能與FOXM1 信號通路有關。研究表明，FOXM1信號通路通過調節(jié)細胞核基因表達，清除凋亡上皮細胞，與細胞的代謝過程有關[29]。胡國輝[30]研究發(fā)現FOXM1 信號通路通過激活下游KIF4A 啟動子，調節(jié)細胞有絲分裂，從而促進肝癌細胞的增殖。有研究[31]顯示，在FOXM1信號通路中，FOXM1 的上調可以激活 p38MAPK/NF-κB 通路，進而介導炎癥反應的發(fā)生，可能與對細胞外刺激反應有關。這提示了柴胡疏肝散可能通過作用FOXM1 通路，調節(jié)其異常表達從而抑制腫瘤細胞的增殖。

為了篩選得到與肝細胞癌密切相關的核心靶點，結合PPI 蛋白互作網絡和疾病-藥物-化合物-靶點網絡所篩選核心靶點取交集，最終得到3個核心靶點，分別為：ESR1、JUN、AR。生存分析發(fā)現，JUN、ESR1 在高低風險組中具有顯著差異性。其中，JUN 低表達與良好預后呈相關性，ESR1 的高表達與良好預后呈相關性。ESR1 是一種配體激活的轉錄因子受體，有研究表明[32]其通過抑制JAK、STAT 通路可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖。臨床研究顯示[33]ESR1 通過調節(jié)下游靶基因在肝癌細胞中的表達，影響肝癌細胞的遷移能力，ESR1對肝癌的進展有重要臨床意義。JUN 是細胞核內的重要轉錄因子，c-jun 的異常高表達已被證實與肝細胞癌的發(fā)生有關[34]。相關研究[35]發(fā)現c-jun 可以保護紫外線誘導的細胞凋亡，抑制TNF-α 誘導的凋亡，促進肝癌細胞增殖和免疫逃逸[36]。AR 是一種核蛋白受體，可以雄激素特異性結合，調節(jié)基因表達水平，誘導細胞增殖生長[37]。蔣廣宜[38]研究發(fā)現，AR 通過抑制PD-L1 表達而干擾T 細胞，使得肝癌細胞獲得免疫逃逸。

在SymMap 數據庫導入柴胡疏肝散治療肝癌的化合物或靶點，保留了疾病-藥物-化合物-中醫(yī)癥狀-現代醫(yī)學癥狀均有對應關系的點，從而構建肝郁氣滯型肝癌“病-證-方/藥”網絡。從柴胡疏肝散治療肝郁氣滯證肝癌的網絡可得，患者可能出現發(fā)熱、頭痛、嘔吐、口干、癥瘕、黃疸等既于少陽證候相關、又與肝癌相關的癥狀。

構建柴胡疏肝散治療肝癌的靶點預后模型，對預測肝癌患者預后評估具有臨床意義。KM 生存分析結果顯示，高低風險組間生存情況具有顯著差異，低風險組與良好生存情況相關。隨著風險評分的增加，患者的死亡人數不斷增加。此外，進一步使用ROC 回歸曲線驗證了該模型的準確性，其AUC 面積分別為1 年0.789，3年0.697，5年0.677，說明該模型預測肝癌患者預后具有良好效應。因此，柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點預后模型在預測患者預后中具有可靠性。

為進一步獲取獨立的預后因子，對肝細胞癌生存相關靶點結合性別、年齡、TNM 分期進行單因素及多因素cox分析。結合單因素cox和多因素cox分析結果可知，ESR1、T 分期是獨立的預后危險因素。進一步構建列線圖以估算ESR1、T 分期的表達水平與患者總體生存率的關系，結果顯示其c-index 為0.622（0.555-1），P＜0.001，說明該列線圖用以評估患者的總體生存情況具有中等程度的準確性。

為了評估ESR1 和核心化合物、相關敏感性藥物的優(yōu)劣情況，使用了分子對接模擬核心其相互之間的結合穩(wěn)定情況[39]，分子對接評分為負值說明結合，正值說明不結合，負值越大說明結合效果越好。結果顯示，Isorhamnetin、Tamoxifen 和 Fulvestrant 和蛋白 ESR1的分子對接評分均為負值，結合效果良好，ESR1 的結合能與他莫昔芬、氟維司群非常接近，這也提示了異鼠李素可能成為潛在的ESR1 靶向藥物。異鼠李素是銀杏、沙棘等植物中提取的黃酮類化合物[40]，蔣晨春等[41]進行研究發(fā)現，異鼠李素可以誘導肝癌細胞凋亡，抑制其進入細胞DNA 復制期，具有一定的抗肝癌作用。異鼠李素在阻滯肝癌細胞周期中，多種細胞周期蛋白表達下降，阻滯作用可能與細胞內活性氧水平相關[42]。此外，有研究[43]證實，異鼠李素與抗胃癌藥物聯合使用，可以增強藥物療效。

為了檢驗ESR1 在肝細胞癌中的表達情況，借助HPA 數據庫對肝臟組織進行免疫組織化學染色。結果顯示，肝細胞癌組織中ERS1 蛋白質表達水平低于正常肝細胞組織，進一步說明了ESR1 高表達是預后的保護因素。

中藥復方治療肝癌作用機制復雜，利用網絡藥理學方法可對其機制進行分子層面的進一步研究。謝小慧等[44]基于網絡藥理學研究發(fā)現健脾消積方中的槲皮素、木犀草素等是藥效成分的重要組成，發(fā)揮調控誘導肝癌細胞凋亡的作用。何燦封等[45]通過探討參桃軟肝丸治療肝癌的機制發(fā)現槲皮素、木犀草素及山奈酚可能是發(fā)揮作用機制的有效成分，通過利用網絡藥理學分析方法，尋找作用靶點與通路可推動肝癌發(fā)生機制認識及新藥研發(fā)，體現了中藥復方治療肝癌多成分、多靶點、多通路的特點。

本研究結合網絡藥理學、分子對接和生物信息學分析方法，研究柴胡疏肝散治療肝癌的分子靶點以及構建預后模型。根據研究得出結論：①異鼠李素可能是柴胡疏肝散治療肝細胞癌發(fā)揮作用的主要成分之一；②柴胡疏肝散治療肝細胞癌的靶點構建的預后模型可用以用于患者預后的評估；③根據ESR1 的表達水平、T 分期構建的列線圖可用于患者總體生存率的估算，效能良好。