李曉鶯， 朱麗珍， 張曦燕， 閆亞美， 劉蘭英， 米 佳， 祿 璐， 何 軍

(1.寧夏農(nóng)林科學院枸杞科學研究所，寧夏銀川 750002； 2.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750021)

枸杞(L.)是茄科枸杞屬多年生落葉小灌木，廣泛分布于我國西北干旱和半干旱地區(qū)，作為一種傳統(tǒng)藥物已被廣泛使用了數(shù)千年。枸杞作為寧夏最具地方特色的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，在促進農(nóng)業(yè)效益、農(nóng)民增收致富中起著決定性作用。枸杞果實中含有豐富的活性物質(zhì)，主要包括枸杞多糖、維生素、類黃酮、多酚等物質(zhì)，是理想的藥食資源，在增強免疫力、防衰老、抗氧化、降血糖血脂等方面具有顯著功效。目前，枸杞漿果干制是其主要的加工方式，但制干過程中會導致大量活性成分的流失。枸杞鮮果的各種營養(yǎng)成分含量均比干果的高，營養(yǎng)價值優(yōu)于干果，導致近年來能夠使活性成分得以最大程度保留的鮮果枸杞需求日益增大。

枸杞鮮食不僅能更加充分地發(fā)揮其清除自由基、促進代謝的功效，而且也可以降低氨基酸、類胡蘿卜素等功能性成分的流失。但是由于枸杞鮮果皮薄肉嫩，水分含量高，采后容易受致腐病原真菌的侵染，常溫條件下果實放置2～4 d 就會變色、變味，腐爛指數(shù)逐步上升。放置8～10 d，果實腐爛指數(shù)迅速增加，甚至完全失去食用價值。但是，目前鮮果市場主要面對的難題是采后加工、運輸和貯藏期間造成的腐爛而導致的重大經(jīng)濟損失。據(jù)相關(guān)調(diào)查研究表明，在發(fā)達國家鮮果采摘后損失率一般在 25%以上，發(fā)展中國家則在 50%以上。而造成果實采后腐爛的最主要致腐菌為病原真菌，主要包括青霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬和木霉屬等。因此，如何控制枸杞采后腐爛已成為解決鮮果枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。

目前對導致鮮食枸杞腐爛現(xiàn)象的研究較少，通過研究發(fā)現(xiàn)，果實病害與其枸杞品種自身的抗性相關(guān)，現(xiàn)在枸杞的栽培品種品系很多，主要還是以寧杞系列枸杞為主。李捷研究發(fā)現(xiàn)，在接種致病力強菌尖孢鐮孢菌后，抗病能力依次表現(xiàn)為(枸杞屬美洲野生種)>(枸杞屬美洲野生種)>寧夏枸杞=中國枸杞>黑果枸杞>寧杞2號>寧杞1號>寧杞5號。研究者通過室內(nèi)和田間的炭疽病抗病性鑒定發(fā)現(xiàn)，寧杞1號和截萼枸杞是相對較抗病的品種，進而說明不同枸杞品種的抗病性存在差異。此外，大量研究表明，鮮果自身攜帶的生物源能誘導抗性因子的產(chǎn)生，這類常應(yīng)用于果實采后病害生物防治的微生物生物因子主要包括細菌、酵母菌、類酵母菌和木霉等。張小彥等在健康枸杞植株根際土壤樣品中篩選出對枸杞根腐病菌具有抑制效果的菌株，其中最高抑菌率可達到52%，該研究結(jié)果可為有效利用微生物拮抗作用防治枸杞根腐病提供理論依據(jù)。

本研究通過分離、鑒定枸杞鮮果在貯藏保鮮過程中產(chǎn)生的病原菌種類，為延長枸杞鮮果的貯藏期提供科學依據(jù)；同時，通過回接的方式對不同主栽枸杞品種的抗病性展開研究，為篩選適合鮮食枸杞的品種提供理論依據(jù)；進一步在研究過程中篩選拮抗菌，對延長鮮果枸杞產(chǎn)業(yè)鏈，增加農(nóng)民收入，促進枸杞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試果實為頭茬枸杞鮮果，采自寧夏農(nóng)林科學院園林場，品種為寧杞1號、寧杞5號、寧杞7 號。挑選大小、色澤較均一，表面無明顯病蟲害和機械損傷且?guī)Ч墓麑嵎湃? ℃冷藏保鮮備用。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗儀器主要有超凈工作臺(SW-GJ-2FD型，上海坤權(quán)生物科技有限公司)、高壓滅菌鍋(YXQ-LS-100SⅡ型，上海博迅實業(yè)有限公司)、智能人工氣侯培養(yǎng)箱(ZRX-258E型，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司)、熒光顯微鏡及DIC微分干涉儀[BX51型，奧林巴斯(中國)投資有限公司]、植物圖像分析儀(LA-S 杭州萬深探測科技有限公司)、超純水機(AXLK-181型，北京思普特科技有限公司)。

1.3 試驗時間與地點

1.3.1 試驗時間與地點 試驗于2021年6月在寧夏農(nóng)林科學院枸杞科學所枸杞貯藏保鮮加工實驗室進行。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基的選擇 采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA 培養(yǎng)基)培養(yǎng)枸杞的病害組織。稱取6.0 g馬鈴薯粉，20.0 g葡萄糖，20.0 g瓊脂粉，加入1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為5.4～5.8；115 ℃高壓滅菌 20 min，倒入培養(yǎng)皿中，備用。

1.4.2 病原菌分離與純化 選取在冰箱保鮮7 d后呈明顯發(fā)病癥狀的枸杞鮮果，先用75%乙醇溶液表面消毒后，移入超凈臺，用無菌鑷子去除表層菌絲，挑取4～6塊直徑約2 mm的內(nèi)部腐爛組織，分別用無菌水漂洗后轉(zhuǎn)移至同一PDA 培養(yǎng)基上并均勻分布，26 ℃條件下培養(yǎng)1 d。待菌株長出菌絲，立即轉(zhuǎn)接到新的PDA 平板上，繼續(xù)重復此操作3次，直至獲得菌株的純培養(yǎng)。觀察分離培養(yǎng)基平板上菌落的形態(tài)，包括形狀、色澤、大小、菌絲特征。將單菌落的病原菌制片后，用復紅染色后在10、20、40 倍目鏡及100倍油鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子形狀，記錄觀察結(jié)果并拍照。

1.4.3 病原菌基因組精細圖測序分析 提取高質(zhì)量基因組DNA，利用Nanodrop、Qubit和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和完整性質(zhì)檢；BluePippin全自動核酸回收系統(tǒng)回收大片段DNA；文庫構(gòu)建(SQK-LSK109連接試劑盒)：包括DNA損傷修復和末端修復，磁珠純化；接頭連接，磁珠純化；Qubit文庫定量；上機測序4個步驟。測序結(jié)果在國家生物技術(shù)信息中心(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的數(shù)據(jù)庫中比對，將病原菌鑒定到種，明確其分類地位。

1.4.4 不同枸杞品種對病原菌的抗病性研究 分別挑選寧杞1號、寧杞5號、寧杞7 號的優(yōu)級鮮果，用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min 后用滅菌蒸餾水沖洗，轉(zhuǎn)入超凈臺內(nèi)晾干，用無菌移液槍槍頭分別刺傷果實。再用移液槍吸取無菌水在5種菌株上吸打后，分別接種到寧杞1號、寧杞5號、寧杞7 號的傷口處。將接種后的果實置于培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)。每個處理5個果實，重復3次，定期觀察接種處是否有致病性及病害癥狀表現(xiàn)。用LA-S植物圖像分析儀進行果實病斑損害的分析，并對損害面積進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞鮮果采后病害的發(fā)病癥狀

常溫條件下，采收1～2 d后果表就可觀察到菌絲，冷藏保存條件下5～7 d可觀察到。通過對不同果實發(fā)病癥狀的觀察，可將果實主要發(fā)病癥狀分為4類，4類病斑的果實發(fā)病癥狀見圖1、表1。對不同枸杞品種果實發(fā)病情況進行了調(diào)查，結(jié)果見表1。

表1 枸杞果實發(fā)病癥狀及不同品種發(fā)病情況調(diào)查

2.2 枸杞鮮果采后主要病原菌的分離與鑒定

根據(jù)發(fā)病癥狀，選擇不同癥狀特點的病斑進行病原菌的分離和鑒定，共分離到4株真菌菌株和1株細菌菌株，其中不同真菌菌株的菌落和孢子形態(tài)描述見圖2、圖3、表2。本研究對這5類菌株的形態(tài)學初步鑒定結(jié)果見表2。

表2 枸杞不同菌株的菌落和孢子形態(tài)描述

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

2.3.1 基因組測序分析 根據(jù)上述試驗和分析，由于Ⅳ類病斑具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，霉菌上研究較多(未送樣)，Ⅴ類病斑有拮抗微生物潛力，因此選擇4類研究相對較少的菌株進行送樣測序，分別是Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類、Ⅴ類菌株，將4類菌株送到北京百邁克生物科技有限公司進行病原菌基因組精細圖測序分析。使用NECAT軟件進行組裝，最后采用Pilon軟件利用二代數(shù)據(jù)進一步對組裝基因組進行糾錯，得到最終準確度更高的基因組。4類菌送樣編號分別為RO1、RO2、RO3、RO4。最后統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。

表3 基因組組裝結(jié)果統(tǒng)計

由于物種間重復序列的保守性相對較低，針對特定的物種進行重復序列的預測時需要構(gòu)建特定的重復序列數(shù)據(jù)庫。因此，借助LTR_FINDER v 1.05、MITE-Hunter、RepeatScout v1.0.5、PILER-DF v2.4等軟件，基于結(jié)構(gòu)預測和從頭預測的原理構(gòu)建該真菌基因組的重復序列數(shù)據(jù)庫，用PASTEClassifier對數(shù)據(jù)庫進行分類，再與Repbase的數(shù)據(jù)庫合并作為最終的重復序列數(shù)據(jù)庫，最后利用 RepeatMasker v4.0.6軟件基于構(gòu)建好的重復序列數(shù)據(jù)庫對該真菌進行重復序列的預測，得到 472 549 bp 的重復序列，重復序列比例為1.38%(表4)。

表4 重復序列預測結(jié)果統(tǒng)計

通過重復序列預測統(tǒng)計編碼蛋白基因的數(shù)量、平均長度，以及內(nèi)含子、外顯子的數(shù)量和平均長度進一步確定基因組組分。確定Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類菌為真菌菌株，Ⅴ類菌為細菌菌株。其中3類真菌菌株的基因基本信息見表5。4個菌株經(jīng)基因組測序后，獲得4個菌株的Contig重疊區(qū)，經(jīng)重疊分析就可以得到完整的染色體基因組序列。

表5 基因基本信息統(tǒng)計

2.3.2 病原菌的分子鑒定 進一步從GenBank數(shù)據(jù)庫中選擇4個菌株及其近緣種的rDNA-ITS序列，與供試菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

將Ⅰ類菌基因序列測序結(jié)果Contig00003在NCBI上通過 BLAST比對，與同源性相近的20個登錄號序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，與鏈格孢霉屬的和對應(yīng)登錄號分別為NR 160246.1和NR 077213.1同源性較高，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，聚為一類(圖4、表6)。鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，最終確定Ⅰ類病原菌為鏈格孢霉屬，具體種名還有待進一步明確。

將Ⅱ類菌基因序列測序結(jié)果Contig00005a和Contig00005b在NCBI上通過 BLAST比對，與同源性相近的20個登錄號序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，與葡柄霉屬的對應(yīng)登錄號為NR 171994.1同源性較高，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，聚為一類(表7、圖5)。鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致， 結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果， 最終確定Ⅱ類病原菌為葡柄霉屬，具體種名還有待進一步明確。

將Ⅲ類菌基因序列測序結(jié)果Contig00034a、Contig00034b、Contig00034c、Contig00034d、Contig00028a、Contig00028b、Contig00028c在NCBI上通過 BLAST比對，與同源性相近的20個登錄號序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，與卷毛霉屬的和毛霉屬的、對應(yīng)登錄號分別為NR 154803.1，NR 152977.1，NR 152978.1同源性較高，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，聚為一類(表8、圖6)。鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，最終確定Ⅲ類病原菌為毛霉屬，具體種名還有待進一步明確。

將Ⅴ類菌基因序列測序結(jié)果Contig00001a、Contig00002a、Contig00001b、Contig00001c、Contig00001d、Contig00001e、Contig00001f、Contig00001g和Contig00002b在NCBI上通過 BLAST比對，與同源性相近的20個登錄號序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，與桿菌的z3032和ATCC 35469對應(yīng)登錄號分別為NR 102802.1和NR 074888.1，以及沙門菌的NR 074902.1同源性較高，位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，聚為一類(表9、圖7)。鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，最終確定Ⅴ類病原菌為桿菌和沙門菌屬的近緣菌，具體種名還有待進一步明確。

2.4 病原菌致病性測定及不同枸杞品種鮮果對病害響應(yīng)

將分離純化的菌種回接到健康枸杞上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等 4類病原菌均有發(fā)病，且表現(xiàn)出和腐爛枸杞病害相一致的典型癥狀；Ⅴ類菌無發(fā)病癥狀。從接種發(fā)病的枸杞上再進行分離純化培養(yǎng)，性狀與原來的微生物相同，得到與原來一樣的接種菌，依照科赫氏法則(Koch’s Rule)，可知分離的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ這4種病原菌是該品種枸杞采后病害的主要致病菌，Ⅴ類菌為非致病菌(表10)。

表10 不同真菌菌株回接枸杞后發(fā)病情況統(tǒng)計

用LA-S植物圖像分析儀進行果實病斑損害的分析，并對損害面積進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果見表11。

表11 不同真菌菌株回接枸杞后發(fā)病面積統(tǒng)計

通過對相同回接方式，相同回接時間后不同枸杞受損面積進行分析發(fā)現(xiàn)，寧杞7號具有明顯的抗病害潛力(圖8、表11)。其中， Ⅰ類病斑抗性，寧杞7號>寧杞1號>寧杞5號；Ⅱ類病斑抗性，寧杞7號>寧杞5號>寧杞1號；Ⅲ類病斑抗性，寧杞7號>寧杞5號>寧杞1號；Ⅳ類病斑抗性，寧杞7號>寧杞1號>寧杞5號。Ⅴ類菌株在任何枸杞上均無發(fā)病癥狀。

通過對不同枸杞品種鮮果上病原菌的分離對比，除了發(fā)現(xiàn)寧杞7號具有明顯的抗病害潛力外，還發(fā)現(xiàn)Ⅴ類菌株在3個枸杞品種中無病害癥狀，但在果實分離病害時發(fā)現(xiàn)，寧杞7號的所有病害均伴隨Ⅴ類病斑(圖9)。因此，考慮該菌株是否具有拮抗病害微生物的能力，可為病害拮抗菌的篩選和生物防治提供基礎(chǔ)；另外，考慮寧杞7號是否含有影響該類菌株的營養(yǎng)物質(zhì)，導致該類菌株的富集，最終影響寧杞7號抵抗病害的能力。

3 結(jié)論與討論

枸杞采后腐爛是鮮果主要病害之一，其中病原真菌是果實采后腐爛的主要致腐菌，病原真菌主要包括鏈格孢屬、匍柄霉屬、毛霉屬、曲霉屬、芽枝霉屬、鐮孢屬、青霉屬、根霉屬等。本研究利用組織分離法從發(fā)病的果實病斑處分離得到了5株菌株，通過形態(tài)學、分子測序和菌株回接試驗確定4株為真菌菌株和1株為細菌菌株。

Ⅰ類病斑對應(yīng)的鏈格孢屬真菌作為果實采后常見的潛伏侵染病原菌，是半知菌暗色絲孢菌中重要的一類，主要通過產(chǎn)生毒素和代謝物等致病因子誘發(fā)果實腐爛等病害的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬真菌在自然發(fā)病條件下至少有2 個種和能引起枸杞鮮果的采后腐爛，與王曉等的研究結(jié)果相符。Ⅱ類病斑對應(yīng)的匍柄霉屬，是鏈格孢屬的近似屬，亦作為一種獨立的真菌類群廣泛分布于植物組織中，是漿果類采摘后腐爛的主要病原菌。Ⅲ類菌經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定為毛霉菌，多在高溫、高濕度以及通風不良的條件下快速孳生，加速鮮果腐爛進程。目前在鮮果上的研究較少，但根據(jù)枸杞鮮果采后病原菌的發(fā)病情況觀察，該類菌在鮮果采后腐爛進程中發(fā)揮重要作用。Ⅳ類病原菌在枸杞及其他漿果植物上研究較多，真菌形態(tài)具有明顯特征，曲霉屬黑曲霉菌，亦是枸杞果實腐爛部位的主要分離菌株。黑曲霉能導致水分較高的食物、果蔬等發(fā)生霉腐變質(zhì)，且有可能產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素，對人體危害性大。此外，真菌還會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物及其他真菌毒素，對人類和農(nóng)場牲畜都具有高度毒性。隨著人們生活水平和食品安全意識的提高，果蔬微生物安全控制越發(fā)受到重視，枸杞無論是鮮食還是加工干制都需要嚴格控制微生物生長，通過分離鑒定出鮮枸杞的主要致病微生物，為采取有效措施抑制微生物生長提供了理論依據(jù)，也為今后枸杞及制品安全流通提供了技術(shù)保障。

筆者進一步對枸杞三大主要栽培種進行了抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)寧杞7號具有明顯抗四大真菌病害的優(yōu)勢。盡管對寧杞7號抗病性研究較少，但本研究也進一步驗證了李捷的研究，即不同枸杞品種的抗病性存在差異。此外，在果實分離病害時發(fā)現(xiàn)，具有明顯抗病優(yōu)勢的寧杞7號在健康果和病害果實上均分離出Ⅴ類菌株，且回接該菌株后在任一枸杞品種上均無發(fā)病癥狀。之前也有關(guān)于桿菌類作為生防菌株的相關(guān)報道，Obagwu等首次報道了分離自柑橘果實表面的枯草芽孢桿菌可有效地抑制柑橘青綠霉病。馮玉衡篩選出2株沙福芽孢桿菌能夠抑制馬鈴薯黑痣病和枯萎病的發(fā)生，徐同偉等篩選出一株芽孢桿菌用于抑制煙草黑脛病。何文琪等從蓮霧上分離得到一株對蓮霧軟腐病病原菌具有明顯拮抗效果的芽孢桿菌菌株，可以作為抑制蓮霧軟腐病的潛在生防菌。因此，考慮Ⅴ類菌株亦具有拮抗病害微生物的能力，可以作為抑制枸杞鮮果腐爛病害的潛在生防菌，可為今后枸杞鮮果采后腐爛病害拮抗菌的篩選和生物防治提供基礎(chǔ)。